عزل السريع وتنقية الميتوكوندريا لزرع الأنسجة بواسطة التفكك والتفضيلية الترشيح

Summary

يوصف طريقة لعزل السريع الميتوكوندريا الخزعات النسيجية الثدييات. تم المتجانس كبد الفئران أو مستحضرات العضلات والهيكل العظمي مع dissociator النسيج التجاري وتم عزل الميتوكوندريا عن طريق الترشيح من خلال مرشحات التفاضلي شبكة من النايلون. الميتوكوندريا الوقت العزلة هو <30 دقيقة مقارنة ب 60-100 دقيقة باستخدام طرق بديلة.

Abstract

طرق العزلة الميتوكوندريا التي سبق وصفها باستخدام الطرد المركزي التفاضلي و / أو Ficoll التدرج الطرد المركزي تتطلب 60 الى 100 دقيقة لإكمال. نحن تصف طريقة لعزل الميتوكوندريا السريع لخزعات من الثدييات باستخدام dissociator النسيج التجاري والترشيح التفاضلي. في هذا البروتوكول، يتم استبدال التجانس اليدوي مع دورة التجانس موحدة للdissociator في الأنسجة. وهذا يسمح للموحدة وتجانس ثابت من الأنسجة التي لا يتحقق بسهولة مع التجانس اليدوي. بعد تفكك الأنسجة، ويتم تصفية جناسة من خلال شبكة مرشحات النايلون، والتي تزيل الخطوات الطرد المركزي المتكررة. ونتيجة لذلك، والعزلة الميتوكوندريا يمكن أن يؤديها في أقل من 30 دقيقة. هذا البروتوكول العزلة ينتج حوالي 2 × ¹⁰ 10 الميتوكوندريا المختصة قابلة للحياة والتنفس من 0.18 ± 0.04 جرام (الوزن الرطب) عينة الأنسجة.

Introduction

وتوجد الميتوكوندريا في كل خلية في الجسم ما عدا خلايا الدم الحمراء وتشارك في عدد كبير من العمليات الخلوية والأيض المهمة ^1-4. لأن العديد من هذه الوظائف، يمكن أن تلف الميتوكوندريا لها آثار ضارة ^3. من أجل التحقيق في وظيفة الميتوكوندريا وضعف عدة طرق العزلة الميتوكوندريا تم وصفها. أقرب الحسابات المنشورة التاريخ العزلة الميتوكوندريا إلى 1940s ^5-8. أظهرت محاولة موثقة الأولى العزلة الميتوكوندريا عن طريق طحن أنسجة الكبد في بمدافع الهاون تليها الطرد المركزي في محلول الملح على سرعة منخفضة ^5،8. في وقت لاحق، وسعت مجموعات أخرى على الإجراء الأصلي وأظهرت الأنسجة تجزئة استنادا التفاضلية الطرد المركزي ^6-8. هذه الأساليب المبكرة شكلت أساس التقنيات الحالية والتي غالبا ما تتضمن التجانس، و / أو التفاضلية الطرد المركزي ^9-15. عدد homogenizatiعلى الطرد المركزي والخطوات يختلف بين البروتوكولات. هذه الخطوات المتكررة تزيد من الوقت لعزل الميتوكوندريا وفي نهاية المطاف خفض قدرتها على البقاء. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تسبب أضرارا التجانس اليدوي وتتعارض النتائج الميتوكوندريا إذا لم يتم السيطرة بشكل صحيح ^10،16.

في الآونة الأخيرة، كنا التجانس والتفضيلية الطرد المركزي لعزل الميتوكوندريا لزرعها في أنسجة عضلة القلب ^17،18. هذا الإجراء يتطلب عزلة طويلة ما يقرب من 90 دقيقة وكان انطباق السريري لهذه الطريقة بالتالي محدود. للسماح للاستخدام العلاجي الحاد في العلاج السريري والجراحية وضعنا الداخلي العزلة الميتوكوندريا السريع التي يمكن القيام بها في أقل من 30 دقيقة.

الفوائد الرئيسية لهذا البروتوكول هي أن تفكك نسيج موحد يسمح موحدة وتجانس ثابت من الأنسجة التي لا يتحقق بسهولة مع التجانس اليدوي. في additأيون، واستخدام الترشيح التفاضلي في مكان الطرد المركزي التفاضلي يلغي تستغرق وقتا طويلا والخطوات الطرد المركزي المتكررة السماح لعزل أسرع من الميتوكوندريا المختصة العالية النقاء وقابلة للحياة والتنفس.

القدرة على عزل الميتوكوندريا المختصة قابلة للحياة والتنفس في أقل من 30 دقيقة تسمح للتطبيق السريري. هذا البروتوكول العزلة لديها امكانات للاستخدام في جراحة الشريان التاجي الالتفافية تطعيم (CABG) والإجراءات العلاجية الأخرى.

Protocol

إعداد

1. إعداد 1 M-K HEPES محلول المخزون (ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 مع KOH).
2. تحضير 0.5 M-K EGTA المالية الحل (ضبط درجة الحموضة إلى 8.0 مع KOH).
3. إعداد 1 M KH ₂ PO ₄ أسهم الحل.
4. إعداد 1 M MgCl ₂ محلول المخزون.
5. إعداد المجانسة العازلة (درجة الحموضة 7.2) 300 ملي السكروز، K-10 ملي HEPES، وK-1 ملم EGTA. تخزينها في 4 درجة مئوية.
6. إعداد التنفس العازلة 250 ملي السكروز، 2 مم KH ₂ PO _4، 10 ملم MgCl _{2 و} 20 ملي K-HEPES العازلة (درجة الحموضة 7.2) و 0.5 ملي K-EGTA (8.0 درجة الحموضة). تخزينها في 4 درجة مئوية.
7. إعداد 10X PBS المالية الحل عن طريق إذابة 80 جم من كلوريد الصوديوم، و 2 غرام من بوكل، 14.4 غرام من نا ₂ هبو _4، و 2.4 غرام من KH ₂ PO ₄ في 1 L مزدوج المقطر H ₂ O (7.4 درجة الحموضة).
8. إعداد 1X PBS قبل pipetting 100 مل 10X PBS إلى 1 L مزدوج المقطر H ₂ O.
9. إعداد سبتيليزين مخزون من وزنها من 4 ملغ من سبتيليزين ألف فيإلى أنبوب 1.5 مل microfuge. تخزين في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
10. إعداد BSA المالية التي وزنها من 20 ملغ من BSA في أنبوب 1.5 مل microfuge. تخزين في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

عزل الميتوكوندريا (الشكل 1)

1. مباشرة قبل العزلة، ويحل سبتيليزين ألف في 1 مل من المجانسة العازلة.
2. مباشرة قبل العزلة، ويحل BSA في 1 مل من المجانسة العازلة.
3. جمع عينتين أنسجة جديدة باستخدام 6 ملم عينة خزعة لكمة وتخزينها في برنامج تلفزيوني 1X في أنبوب الطرد المركزي 50 مل مخروطي على الجليد.
4. نقل اثنين من اللكمات 6 ملم من الأنسجة لأنبوب التفكك C تحتوي على 5 مل من البرد الجليد التجانس العازلة.
5. تجانس الأنسجة عن طريق تركيب أنبوب C التفكك على dissociator الأنسجة وتحديد دورة العزلة الميتوكوندريا المحددة مسبقا (60 ثانية التجانس).
6. إزالة أنبوب التفكك C إلى دلو الجليد.
7. إضافة 250 ميكرولتر من سبتيليزين مخزون الحل لجناسة، مزيج من انعكاس واحتضان جناسة على الجليد لمدة 10 دقيقة.
8. وضع مرشح شبكة 40 ميكرون على أنبوب الطرد المركزي 50 مل مخروطي على الجليد وما قبل الرطب مرشح مع المجانسة العازلة وتصفية جناسة في أنبوب الطرد المركزي 50 مل مخروطي على الجليد.
9. إضافة 250 ميكرولتر من الطازجة BSA الحل لاسهم الراشح وتخلط بواسطة انقلاب.
   ملاحظة: حذفت هذه الخطوة إذا كان مطلوبا الميتوكوندريا تقرير البروتين.
10. وضع مرشح 40 ميكرون على أنبوب الطرد المركزي 50 مل مخروطي على الجليد وما قبل الرطب مرشح مع المجانسة العازلة وتصفية جناسة في أنبوب الطرد المركزي 50 مل مخروطي على الجليد.
11. وضع مرشح 10 ميكرون على أنبوب الطرد المركزي 50 مل مخروطي على الجليد وما قبل الرطب مرشح مع المجانسة العازلة وتصفية جناسة في أنبوب الطرد المركزي 50 مل مخروطي على الجليد.
12. نقل الترشيح لاثنين قبل المبردة 1.5 مل أنابيب microfuge والطرد المركزي في 9000 x ج لمدة 10 دقيقة في4 درجة مئوية.
13. إزالة طاف وإعادة تعليق والجمع بين الكريات في 1 مل من الجليد الباردة التنفس العازلة.

ATP الفحص

ملاحظة: لتحديد النشاط الأيضي الميتوكوندريا المعزولة والتلألؤ فحص ATP يمكن أن يؤديها باستخدام عدة ATP الفحص. بروتوكول، تم تزويد الكواشف والمعايير في عدة الفحص. يوصف ملخص الإجراء أدناه.

1. تتوازن الكواشف عدة لRT.
2. إعداد 10 ملي ATP المالية الحل عن طريق إذابة بيليه ATP مجفف بالتجميد في 1،170 ميكرولتر من الماء المقطر مزدوجة. تخزين ATP المالية القياسية الحل وعينات الميتوكوندريا مستعدة على الجليد.
3. إضافة 5 مل من محلول الركيزة العازلة إلى قارورة من حل الركيزة مجفف بالتجميد. المزيج بلطف ووضع في الظلام.
4. إضافة 100 ميكرولتر من العازلة التنفس لجميع آبار سوداء، أسفل مبهمة، 96 لوحة جيدا.
5. إضافة 10 ميكرولتر من الميتوكوندريا من العينات مستعدة لكل بئر ساتحاد كرة القدم الأسود، أسفل مبهمة، 96 لوحة جيدا. ملاحظة: يتم مطلي العينات في ثلاث نسخ. تشمل على التوالي لمعايير وثلاثة آبار للسيطرة سلبية (التنفس الاحتياطي).
6. إضافة 50 ميكرولتر من الثدييات حل تحلل الخلية لجميع الآبار، بما في ذلك المعايير والضوابط.
7. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على شاكر المداري في 125 دورة في الدقيقة.
8. أثناء الحضانة إعداد معايير ATP في تركيزات 0.1 ملم، 0.05 ملم، 0.01 ملم، 0.005 ملم، 0.001 ملم، و0.0001 ملي ATP من 10 ملي ATP المالية الحل. مخزن المعايير على الجليد.
9. بعد الحضانة، وإضافة 10 ميكرولتر من المعايير ATP إلى الآبار المقابلة كما هو موضح على الخريطة وحة. يتم تنفيذ المعايير في نسختين: مذكرة.
10. إضافة 50 ميكرولتر من الحل الركيزة أعيد إلى كل بئر.
11. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية على شاكر المداري لمدة 5 دقائق عند 125 دورة في الدقيقة.
12. مفتوحة Gen5 1.11 البرنامج على جهاز كمبيوتر مرتبط مع طيفي.
13. تحت عنوان "إنشاء عنصر جديد "، انقر على" تجربة ".
14. انقر على "بروتوكول الافتراضي". انقر على "موافق".
15. في العمود الأيسر، حدد "البروتوكول"، ثم "الداخلي".
16. حدد "تأخير". تعيين ل00:10:00. انقر على "موافق".
17. حدد "اقرأ". حدد "التلألؤ" من القائمة المنسدلة. ضبط الإعدادات الأخرى إلى ما يلي: اقرأ نوع نقطة النهاية والتكامل الوقت 0: 01.00 MM: SS.ss، تصفية مجموعات 1، الانبعاثات هول، البصريات الوظيفة الأعلى، الحساسية 100، أوفست الأعلى المسبار الرأسي 1.00 ملم.
18. عندما لوحة جاهزة للتحليل، انقر فوق "قراءة لوحة" أيقونة على الصف العلوي. انقر على "اقرأ". عندما يفتح طيفي، ووضع لوحة في علبة مع جيدا A1 في الزاوية اليسرى العليا. سوف يظهر مربع مع درجة حرارة فتح. انقر على "اقرأ". ملاحظة: القيم العليا ترتبط مع زيادة مستويات ATP والنشاط الأيضي العالي.

النتائج

ويرد الرقم يحدد الخطوات الإجرائية في عزل الميتوكوندريا باستخدام تفكك الأنسجة والترشيح الفارق في الشكل 1. مجموع الوقت الإجرائي هو أقل من 30 دقيقة.

وتم الحصول على عينات الأنسجة باستخدام 6 ملم خزعة لكمة. كان وزن النسيج 0.18 ± 0.0...

Discussion

لعزل الميتوكوندريا بنجاح باستخدام هذا البروتوكول لا بد من الحفاظ على كل الحلول وعينات الأنسجة على الجليد للحفاظ على استمرارية الميتوكوندريا. حتى عندما حافظت على الجليد، والميتوكوندريا المعزولة تظهر انخفاضا في النشاط الوظيفي على مر الزمن ^19. ونحن نوصي جميع الح...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sucrose	Sigma Aldrich	84100
HEPES	Sigma Aldrich	H4034
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
Substilsin A	Sigma Aldrich	P5380
BSA	Sigma Aldrich	A7906
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5379
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266
NaCl	Sigma Aldrich	S6191
KCl	Fisher Scientific	P2173
Na2HPO4	Fisher Scientific	S374
ATPlite Luminescence Assay System, 1000 Assay Kit	Perkin Elmer	6016941
Equipment
50 mL Conical Tubes	BD	352098
40 μm Nylon Filters	BD	352340
GentleMACS C tube	Miltenyl Biotech	120-005-331
1.5 mL Eppendorf tube	Fisher Scientific	05-408-129
6 mm biopsy punch	Miltex	33-36
10 μm Pluristrainer	Pluriselect	43-500-10-03
Eppendorf Centrifuge 5415C	Marshall Scientific	EP-5415C
GentleMACS Dissociator	Miltenyl Biotech	130-093-235
96-well plates, tissue culture treated	VWR	82050-732
Rotomax 120 orbital shaker	Heidolph	544-41200-00
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode  Microplate Reader	BioTek
Multisizer 4 Coulter Counter	Beckman Coulter	A63076
Oxytherm System	Hansatech Instruments
Hemacytometer	Fisher Scientific	267110