Aislamiento rápido y purificación de mitocondrias para el trasplante por disociación de tejidos y filtración diferencial

Resumen

Un método para el rápido aislamiento de las mitocondrias a partir de biopsias de tejido de mamíferos se describe. Preparaciones de hígado de rata o de músculo esquelético se homogeneizaron con un disociador tejido comercial y mitocondrias se aislaron por filtración a través de filtros diferencial de malla de nylon. Tiempo de aislamiento mitocondrial es <30 min frente a 60 - 100 min utilizando métodos alternativos.

Resumen

Métodos de aislamiento mitocondriales descritos previamente utilizando centrifugación diferencial y / o centrifugación en gradiente de Ficoll requieren de 60 a 100 minutos para completar. Se describe un método para el rápido aislamiento de las mitocondrias a partir de biopsias de mamíferos usando un disociador tejido comercial y filtración diferencial. En este protocolo, homogeneización manual se reemplaza con ciclo de homogeneización estandarizada del disociador tejido. Esto permite uniforme y homogeneización coherente de tejido que no se logra fácilmente con homogeneización manual. Después de la disociación del tejido, el homogeneizado se filtró a través de filtros de malla de nylon, que eliminan etapas de centrifugación repetitivas. Como resultado, el aislamiento mitocondrial se puede realizar en menos de 30 min. Este protocolo de aislamiento rinde aproximadamente 2 x 10 ¹⁰ mitocondrias competentes viables y respiración de 0,18 ± 0,04 g (peso húmedo) muestra de tejido.

Introducción

Las mitocondrias existen en todas las células del cuerpo excepto las células rojas de la sangre y están involucrados en un gran número de importantes procesos celulares y metabólicos ^1-4. Debido a estas muchas funciones, el daño mitocondrial puede tener efectos perjudiciales ^3. Con el fin de investigar la función mitocondrial y la disfunción mitocondrial varios métodos de aislamiento se han descrito. Las cuentas publicadas tempranas de fecha aislamiento mitocondrial a la década de 1940 ^5-8. El primer intento documentado demostró aislamiento mitocondrial moliendo el tejido hepático en un mortero, seguido de centrifugación en una solución salina a baja velocidad ^5,8. Más tarde, otros grupos expandido en el procedimiento original y demostraron fraccionamiento tejido basado en centrifugación diferencial ^6-8. Estos primeros métodos fueron la base de las técnicas actuales que a menudo incorporan homogeneización y / o centrifugación diferencial ^9-15. El número de homogenizatien pasos de centrifugación y varía entre los protocolos. Estos pasos repetitivos aumentan el tiempo para el aislamiento mitocondrial y en última instancia reducen la viabilidad. Además, la homogeneización manual puede causar daños e inconsistentes resultados mitocondriales si no están adecuadamente controlados ^10,16.

Recientemente, hemos utilizado la homogeneización y centrifugación diferencial para aislar las mitocondrias para el trasplante en el tejido miocárdico ^17,18. Este largo procedimiento de aislamiento requiere aproximadamente 90 min y la aplicabilidad clínica de este método era, por tanto, limitada. Para permitir el uso terapéutico aguda en el tratamiento clínico y quirúrgico se ha desarrollado un procedimiento de aislamiento mitocondrial rápida que se puede realizar en menos de 30 min.

Las principales ventajas de este protocolo son que la disociación del tejido normalizada permite uniforme y coherente homogeneización de tejido que no se logra fácilmente con homogeneización manual. En addition, el uso de filtración diferencial en lugar de la centrifugación diferencial elimina mucho tiempo y etapas de centrifugación repetitivos lo que permite más rápido aislamiento de las mitocondrias competentes altamente purificadas, viables y respiración.

La capacidad de aislar las mitocondrias competentes viables y respiración en menos de 30 min permite la aplicabilidad clínica. Este protocolo de aislamiento tiene potencial para su uso en la cirugía de revascularización coronaria (CABG) y otros procedimientos terapéuticos.

Protocolo

Preparación

1. Preparar 1 M K-HEPES Stock Solution (ajustar el pH a 7,2 con KOH).
2. Preparar 0,5 M K-EGTA Stock Solution (ajustar el pH a 8,0 con KOH).
3. Preparar 1 M KH ₂ PO ₄ Stock Solution.
4. Preparar 1 M de _MgCl2 Stock Solution.
5. Preparar tampón de homogeneización (pH 7,2) de sacarosa 300 mM, 10 mM K-HEPES, y 1 mM de K-EGTA. Almacenar a 4 ° C.
6. Preparar sacarosa 250 mM Respiración Buffer, 2 mM KH ₂ PO _4, 10 mM _MgCl2, 20 mM K-HEPES buffer (pH 7.2) y 0,5 mM K-EGTA (pH 8,0). Almacenar a 4 ° C.
7. Preparar 10x PBS Solución Stock disolviendo 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na ₂ HPO _4, y 2,4 g de KH ₂ PO ₄ en 1 L de doble H ₂ O destilada (pH 7,4).
8. Preparar PBS 1x pipeteando 100 ml 10x PBS en 1 l doble _H2O destilada
9. Preparar Subtilisina A Stock pesando 4 mg de Subtilisina A ena un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Almacenar a -20 ° C hasta su uso.
10. Preparar BSA Stock pesando 20 mg de BSA en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Almacenar a -20 ° C hasta su uso.

Aislamiento mitocondrial (Figura 1)

1. Inmediatamente antes del aislamiento, disolver Subtilisina A en 1 ml de tampón de homogeneización.
2. Inmediatamente antes del aislamiento, BSA disolver en 1 ml de tampón de homogeneización.
3. Recoger dos muestras de tejido fresco usando un punzón 6 mm muestra de biopsia y almacenar en 1x PBS en un tubo de centrífuga cónico de 50 ml en hielo.
4. La transferencia de los dos punzones 6 mm de tejido a un tubo de disociación C que contiene 5 ml de tampón de homogeneización enfriado con hielo.
5. Homogeneizar el tejido mediante el ajuste del tubo de disociación C en el disociador de tejido y seleccionar el ciclo de aislamiento mitocondrial pre-establecido (60 seg homogeneización).
6. Retire el tubo de disociación C a un cubo de hielo.
7. Añadir 250 l de Subtilisin una solución madre a lahomogeneizado, se mezcla por inversión y se incuba el homogeneizado en hielo durante 10 min.
8. Coloque un filtro de malla de 40 micras en un tubo de centrífuga de 50 ml cónico en hielo y pre-mojado el filtro con tampón de homogeneización y filtrado del homogeneizado en el tubo de centrífuga de 50 ml cónico en el hielo.
9. Añadir 250 l de solución de BSA Stock recién preparada al filtrado y mezclar por inversión.
   Nota: Omita este paso si se requiere la determinación de proteínas mitocondriales.
10. Coloque un filtro de 40 micras en un tubo de centrífuga de 50 ml cónico en hielo y pre-mojado el filtro con tampón de homogeneización y filtrado del homogeneizado en el tubo de centrífuga de 50 ml cónico en el hielo.
11. Coloque un filtro de 10 micras en un tubo de centrífuga de 50 ml cónico en hielo y pre-mojado el filtro con tampón de homogeneización y filtrado del homogeneizado en el tubo de centrífuga de 50 ml cónico en el hielo.
12. Transferir el filtrado a dos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml pre-refrigerados y centrifugar a 9000 xg durante 10 min a4 º C.
13. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender y combinar pastillas en 1 ml de hielo frío Respiración Buffer.

Ensayo de ATP

Nota: Para determinar la actividad metabólica de las mitocondrias aisladas de un ensayo de luminiscencia de ATP se puede realizar usando un kit de ensayo de ATP. El protocolo, reactivos y patrones se suministra en el kit de ensayo. Un resumen del procedimiento se describe a continuación.

1. Equilibrar reactivos del kit a temperatura ambiente.
2. Preparar mM ATP Stock Solución 10 disolviendo pellet ATP liofilizada en 1.170 l de agua doblemente destilada. Guarde ATP estándar de solución y las muestras mitocondriales preparados en hielo.
3. Añadir 5 ml de solución tampón de sustrato a un vial de solución de sustrato liofilizado. Mezclar suavemente y colocar en la oscuridad.
4. Añadir 100 l de Buffer respiración a todos los pocillos de un fondo opaco negro, placa de 96 pocillos.
5. Añadir 10 l de las mitocondrias de las muestras preparadas a cada pocillo ofa color negro, fondo opaco, placa de 96 pocillos. Nota: Las muestras se sembraron por triplicado. Incluya una fila para las normas y tres pozos para el control negativo (Respiración Buffer).
6. Añadir 50 l de solución de lisis de células de mamífero a todos los pocillos, incluyendo los estándares y controles.
7. Incubar la placa a 37 º C durante 5 min en un agitador orbital a 125 rpm.
8. Durante la incubación preparar las normas de ATP en concentraciones de 0,1 mM, 0,05 mM, 0,01 mM, 0,005 mM, 0,001 mM y 0,0001 mM ATP a partir de la mM ATP Solución Stock 10. Normas Tienda en el hielo.
9. Después de la incubación, añadir 10 l de las normas de la ATP a los pozos correspondientes como se indica en el mapa de placas. Nota: Las normas se realizaron por duplicado.
10. Añadir 50 l de la solución de sustrato reconstituido a cada pocillo.
11. Incubar la placa a 37 º C en el agitador orbital durante 5 min a 125 rpm.
12. Software Gen5 1.11 Abrir en una computadora conectada con el espectrofotómetro.
13. Bajo "Crear un nuevo elemento ", haga clic en" Experimento ".
14. Haga clic en "protocolo predeterminado". Haga clic en "Ok".
15. En la columna de la izquierda, seleccione "Protocolo", luego "Procedimiento".
16. Seleccione "Delay". Se establece en 00:10:00. Haga clic en "Ok".
17. Seleccione "Leer". Seleccione "luminiscencia" de menú desplegable. Ajuste otros ajustes para las siguientes: Lea tipo de punto final, Integración Tiempo 0: 01.00 MM: ss.ss, Filter Sets 1, Emisión Hole, Óptica Posición Top, Sensibilidad 100, Top Sonda Vertical Offset 1,00 mm.
18. Cuando el plato está listo para ser analizado, haga clic en el icono de "Leer Plate" en la fila superior. Haga clic en "Leer". Cuando se abra el espectrofotómetro, colocar la placa en la bandeja con el pocillo A1 en la esquina superior izquierda. Una caja con la temperatura se abrirá. Haga clic en "Leer". Nota: Los valores más altos se correlacionan con un aumento de los niveles de ATP y una mayor actividad metabólica.

Resultados

Una figura que describe los pasos de procedimiento en el aislamiento de las mitocondrias utilizando la disociación de tejido y filtración diferencial se muestra en la Figura 1. Duración total del procedimiento es de menos de 30 min.

Las muestras de tejido se obtuvieron usando un punzón de biopsia de 6 mm. Peso del tejido fue de 0,18 ± 0,04 g (peso húmedo). El número de mitocondrias aisladas como se determina por recuento de tamaño de partícula fue de 2,4 x 10 x

Discusión

Para aislar con éxito las mitocondrias utilizando este protocolo es esencial para mantener todas las soluciones y las muestras de tejido en hielo para preservar la viabilidad mitocondrial. Incluso cuando se mantiene en hielo, mitocondrias aisladas exhibirán una disminución en la actividad funcional en el tiempo ^19. Recomendamos que todas las soluciones y adiciones serán pre-preparados. Nos pre-pesar y almacenar Subtilisina A en 4 mg alícuotas de 1,5 ml tubos de microcentrífuga y almacenar a -20 ° C. De...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sucrose	Sigma Aldrich	84100
HEPES	Sigma Aldrich	H4034
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
Substilsin A	Sigma Aldrich	P5380
BSA	Sigma Aldrich	A7906
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5379
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266
NaCl	Sigma Aldrich	S6191
KCl	Fisher Scientific	P2173
Na2HPO4	Fisher Scientific	S374
ATPlite Luminescence Assay System, 1000 Assay Kit	Perkin Elmer	6016941
Equipment
50 mL Conical Tubes	BD	352098
40 μm Nylon Filters	BD	352340
GentleMACS C tube	Miltenyl Biotech	120-005-331
1.5 mL Eppendorf tube	Fisher Scientific	05-408-129
6 mm biopsy punch	Miltex	33-36
10 μm Pluristrainer	Pluriselect	43-500-10-03
Eppendorf Centrifuge 5415C	Marshall Scientific	EP-5415C
GentleMACS Dissociator	Miltenyl Biotech	130-093-235
96-well plates, tissue culture treated	VWR	82050-732
Rotomax 120 orbital shaker	Heidolph	544-41200-00
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode  Microplate Reader	BioTek
Multisizer 4 Coulter Counter	Beckman Coulter	A63076
Oxytherm System	Hansatech Instruments
Hemacytometer	Fisher Scientific	267110