Isolamento rapida e purificazione di mitocondri per il trapianto da tessuto Dissociazione e Filtrazione Differenziale

Riepilogo

Un metodo rapido isolamento dei mitocondri da biopsie di tessuto mammiferi è descritto. Fegato di ratto o preparazioni muscolari scheletriche sono stati omogeneizzati con un dissociatore tessuto commerciale e mitocondri sono stati isolati per filtrazione differenziale attraverso filtri a rete di nylon. Tempo di isolamento mitocondriale è <30 min rispetto ai 60 - 100 min con metodi alternativi.

Abstract

Metodi di isolamento mitocondriali precedentemente descritti utilizzando centrifugazione differenziale e / o Ficoll gradiente di centrifugazione richiedono da 60 a 100 minuti per completare. Noi descriviamo un metodo per il rapido isolamento di mitocondri da biopsie di mammifero usando un dissociatore tessuto commerciale e filtrazione differenziale. In questo protocollo, omogeneizzazione manuale viene sostituito con il ciclo omogeneizzazione standardizzata del dissociatore tessuti. Questo permette uniforme e costante omogeneizzazione del tessuto che non è facilmente ottenibile con omogeneizzazione manuale. A seguito di dissociazione dei tessuti, l'omogeneizzato è filtrata attraverso filtri a rete di nylon, che eliminano le fasi di centrifugazione ripetitivi. Come risultato, l'isolamento mitocondriale può essere eseguito in meno di 30 min. Questo protocollo isolamento produce circa 2 x 10 ¹⁰ mitocondri competenti vitali e la respirazione da 0,18 ± 0,04 g di campione di tessuto (peso a umido).

Introduzione

Esistono mitocondri in ogni cellula del corpo ad eccezione dei globuli rossi e sono coinvolti in un gran numero di importanti processi cellulari e metabolici ^1-4. A causa di queste numerose funzioni, danno mitocondriale può avere effetti negativi ^3. Al fine di indagare la funzione mitocondriale e disfunzione diversi metodi di isolamento mitocondriali sono state descritte. I primi resoconti pubblicati su mitocondriale data isolamento al 1940 ^5-8. Il primo tentativo documentato dimostrato isolamento mitocondriale dalla macinazione di tessuto epatico in un mortaio seguita da centrifugazione in una soluzione salina a bassa velocità ^5,8. Più tardi, altri gruppi estesa, la procedura originale e dimostrato frazionamento del tessuto sulla base di centrifugazione differenziale di ^6-8. Questi primi metodi hanno costituito la base delle tecniche attuali, che spesso incorporano omogeneizzazione, e / o differenziale centrifugazione ^9-15. Il numero di homogenizatisu e centrifugazione gradini varia tra i protocolli. Questi passaggi ripetitivi aumentano il tempo per l'isolamento dei mitocondri e, infine, ridurre la vitalità. Inoltre, omogeneizzazione manuale può causare danni e inconsistenti risultati mitocondriali se non adeguatamente controllato ^10,16.

Recentemente, abbiamo utilizzato omogeneizzazione e centrifugazione differenziale per isolare i mitocondri per trapianto nel tessuto miocardico ^17,18. Questa procedura di isolamento lunga tenuta di circa 90 minuti e l'applicabilità clinica di questo metodo era quindi limitata. Per consentire l'uso terapeutico acuto nel trattamento clinico e chirurgico abbiamo sviluppato una rapida procedura di isolamento mitocondriale che può essere eseguito in meno di 30 min.

I principali vantaggi di questo protocollo è che la dissociazione del tessuto standardizzata consente di uniforme e coerente omogeneizzazione del tessuto che non è facilmente ottenibile con omogeneizzazione manuale. In Additione, l'uso di filtrazione differenziale al posto di centrifugazione differenziale elimina richiede tempo e le fasi di centrifugazione ripetitive consentendo un più rapido isolamento di altamente purificati, vitali e respirazione mitocondri competenti.

La capacità di isolare mitocondri competenti vitali e respirazione in meno di 30 minuti permette di applicabilità clinica. Questo protocollo di isolamento ha il potenziale per l'uso in chirurgia di bypass coronarico (CABG) e altre procedure terapeutiche.

Protocollo

Preparazione

1. Preparare 1 M K-HEPES Stock Solution (aggiustare il pH a 7,2 con KOH).
2. Preparare 0,5 M K-EGTA Stock Solution (aggiustare il pH a 8,0 con KOH).
3. Preparare 1 M KH ₂ PO ₄ Stock Solution.
4. Preparare 1 M MgCl ₂ Stock Solution.
5. Preparare omogeneizzazione Buffer (pH 7,2) saccarosio 300 mM, 10 mM K-HEPES, e 1 mM K-EGTA. Conservare a 4 ° C.
6. Preparare saccarosio respirazione Buffer 250 mm, 2 mm KH ₂ PO _4, 10 mM MgCl _2, 20 mM K-HEPES Buffer (pH 7,2) e 0,5 mM K-EGTA (pH 8,0). Conservare a 4 ° C.
7. Preparare 10x PBS Archivio soluzione sciogliendo 80 g di NaCl, 2 g di KCl, 14,4 g di Na ₂ HPO _4, e 2,4 g di KH ₂ PO ₄ in 1 L doppia H ₂ O distillata (pH 7,4).
8. Preparare 1x PBS pipettando 100 ml di 10x PBS in 1 L doppio distillata H ₂ O.
9. Preparare Subtilisina A Stock pesando su 4 mg di Subtilisina A inin una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso.
10. Preparare BSA Archivio pesando i 20 mg di BSA in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso.

Isolamento mitocondriale (Figura 1)

1. Immediatamente prima dell'isolamento, sciogliere Subtilisina A in 1 ml di tampone di omogeneizzazione.
2. Immediatamente prima dell'isolamento, BSA sciogliere in 1 ml di tampone di omogeneizzazione.
3. Raccogliere due campioni di tessuto fresco con un pugno campione bioptico 6 mm e conservare in 1x PBS in una provetta da centrifuga da 50 ml conica sul ghiaccio.
4. Trasferire i due punzoni 6 mm di tessuto in una provetta dissociazione C contenente 5 ml di freddo ghiaccio Omogeneizzazione Buffer.
5. Omogeneizzare il tessuto inserendo il tubo di dissociazione C sul dissociatore tessuti e selezionare il ciclo di isolamento mitocondriale preimpostato (60 sec omogeneizzazione).
6. Rimuovere il tubo di dissociazione C per un secchio di ghiaccio.
7. Aggiungere 250 ml di Subtilisina A Stock soluzione alomogeneizzato, mescolare per inversione ed incubare l'omogeneizzato in ghiaccio per 10 min.
8. Mettere un filtro a rete 40 micron su un tubo da centrifuga da 50 ml conica su ghiaccio e pre-bagnato il filtro con Omogeneizzazione Buffer e filtrare l'omogeneizzato nel tubo da centrifuga da 50 ml conica sul ghiaccio.
9. Aggiungere 250 ml di preparato fresco BSA Stock Solution al filtrato e mescolare per inversione.
   Nota: Omettere questo passaggio se è necessaria la determinazione delle proteine ​​mitocondriali.
10. Mettere un filtro 40 micron su un tubo da centrifuga da 50 ml conica su ghiaccio e pre-bagnato il filtro con Omogeneizzazione Buffer e filtrare l'omogeneizzato nel tubo da centrifuga da 50 ml conica sul ghiaccio.
11. Collocare un filtro da 10 micron su un tubo da centrifuga da 50 ml conica su ghiaccio e pre-bagnato il filtro con Omogeneizzazione Buffer e filtrare l'omogeneizzato nel tubo da centrifuga da 50 ml conica sul ghiaccio.
12. Trasferire il filtrato di due pre-refrigerati provette da 1,5 ml microcentrifuga e centrifugare a 9.000 xg per 10 min a4 ° C.
13. Rimuovere il surnatante e risospendere e combinare pellet in 1 ml di ghiaccio freddo respirazione Buffer.

ATP Assay

Nota: Per determinare l'attività metabolica dei mitocondri isolati un saggio luminescenza ATP può essere eseguita utilizzando un kit di test ATP. Il protocollo, reagenti e standard sono stati forniti nel kit test. Una sintesi della procedura è descritta di seguito.

1. Equilibrare reagenti del kit a RT.
2. Preparare 10 mM ATP Stock Solution sciogliendo liofilizzato pellet ATP in 1.170 ml di acqua bidistillata. Conservare ATP standard di soluzione Stock e campioni mitocondriali preparati sul ghiaccio.
3. Aggiungere 5 ml di soluzione Tampone Substrato ad un flacone di soluzione di substrato liofilizzato. Mescolare delicatamente e mettere al buio.
4. Aggiungere 100 ml di respirazione tampone a tutti i pozzetti di un nero, fondo opaco, 96 pozzetti.
5. Aggiungere 10 ml di mitocondri dai campioni preparati a ciascun bene ofa nero, fondo opaco, 96 pozzetti. Nota: I campioni sono placcati in triplice copia. Include una riga per standard e tre pozzi per il controllo negativo (Respirazione Buffer).
6. Aggiungere 50 ml di soluzione di lisi cellulare dei mammiferi a tutti i pozzetti, comprese le norme e controlli.
7. Incubare la piastra a 37 ° C per 5 minuti su un agitatore orbitale a 125 rpm.
8. Durante l'incubazione preparare norme ATP in concentrazioni di 0,1 mm, 0,05 mm, 0,01 mm, 0.005 mm, 0.001 mm, 0,0001 ATP mm dal 10 mM ATP Stock Solution. Norme Conservare su ghiaccio.
9. Dopo l'incubazione, aggiungere 10 ml di norme ATP corrispondenti pozzetti come indicato nella mappa piastra. NOTA: Gli standard vengono eseguiti in duplicato.
10. Aggiungere 50 ml di soluzione ricostituita di substrato in ogni pozzetto.
11. Incubare la piastra a 37 ° C su agitatore orbitale per 5 min a 125 rpm.
12. Aprire il software Gen5 1.11 su un computer collegato con lo spettrofotometro.
13. Sotto "Creare un nuovo elemento ", cliccare su" Experiment ".
14. Clicca su "protocollo predefinito". Fare clic su "Ok".
15. Nella colonna di sinistra, selezionare "Protocollo", poi "Procedura".
16. Selezionare "Delay". Impostare 00:10:00. Fare clic su "Ok".
17. Selezionare "Leggi". Selezionare "Luminescence" dal menu a discesa. Regolare le altre impostazioni per quanto segue: Leggere tipo di endpoint, Tempo di integrazione 0: 01.00 MM: ss.ss, Filter Set 1, Emissione Foro, Ottica posizione superiore, Sensibilità 100, Offset Top sonda verticale 1,00 millimetri.
18. Quando il piatto è pronto per essere analizzato, fare clic sull'icona "Leggi Targa" sulla riga in alto. Fare clic su "Read". Quando si apre lo spettrofotometro, posizionare la piastra nel cassetto con pozzetto A1 nell'angolo in alto a sinistra. Una scatola con la temperatura si aprirà. Fare clic su "Read". Nota: I valori più alti sono correlati con un aumento dei livelli di ATP e una maggiore attività metabolica.

Risultati

Una figura che illustra le fasi procedurali nel isolamento dei mitocondri mediante dissociazione dei tessuti e la filtrazione differenziale è mostrato in Figura 1. Tempo procedurale totale è inferiore a 30 min.

I campioni di tessuto sono stati ottenuti utilizzando una biopsia 6 mm. Peso del tessuto era 0,18 ± 0,04 g (peso umido). Il numero dei mitocondri isolati come determinato mediante conteggio granulometria era 2,4 x 10 ¹⁰ ± 0,1 x 10 ¹⁰ mitocond...

Discussione

Per isolare con successo mitocondri utilizzano questo protocollo è essenziale per mantenere tutte le soluzioni e campioni di tessuto sul ghiaccio per conservare la vitalità mitocondriale. Anche quando mantenuto sul ghiaccio, mitocondri isolati esporranno una diminuzione dell'attività funzionale nel tempo ^19. Si raccomanda che tutte le soluzioni e le integrazioni essere pre-preparati. Abbiamo pre-pesare e immagazzinare Subtilisina A in 4 aliquote mg in 1,5 ml provette per microcentrifuga e conservare a ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sucrose	Sigma Aldrich	84100
HEPES	Sigma Aldrich	H4034
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
Substilsin A	Sigma Aldrich	P5380
BSA	Sigma Aldrich	A7906
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5379
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266
NaCl	Sigma Aldrich	S6191
KCl	Fisher Scientific	P2173
Na2HPO4	Fisher Scientific	S374
ATPlite Luminescence Assay System, 1000 Assay Kit	Perkin Elmer	6016941
Equipment
50 mL Conical Tubes	BD	352098
40 μm Nylon Filters	BD	352340
GentleMACS C tube	Miltenyl Biotech	120-005-331
1.5 mL Eppendorf tube	Fisher Scientific	05-408-129
6 mm biopsy punch	Miltex	33-36
10 μm Pluristrainer	Pluriselect	43-500-10-03
Eppendorf Centrifuge 5415C	Marshall Scientific	EP-5415C
GentleMACS Dissociator	Miltenyl Biotech	130-093-235
96-well plates, tissue culture treated	VWR	82050-732
Rotomax 120 orbital shaker	Heidolph	544-41200-00
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode  Microplate Reader	BioTek
Multisizer 4 Coulter Counter	Beckman Coulter	A63076
Oxytherm System	Hansatech Instruments
Hemacytometer	Fisher Scientific	267110