Isolement rapide et la purification des mitochondries pour la transplantation par la dissociation des tissus et différencié Filtration

Résumé

Procédé pour l'isolement rapide de mitochondries à partir de biopsies de tissu de mammifère est décrite. foie de rat ou des préparations musculaires squelettiques ont été homogénéisés avec un dissociateur tissu commercial et les mitochondries ont été isolées par filtration différentielle à travers des filtres en filet de nylon. Temps d'isolement des mitochondries est <30 min par rapport à 60 - 100 min en utilisant des méthodes alternatives.

Résumé

Méthodes d'isolement des mitochondries décrites précédemment par centrifugation différentielle et / ou gradient de Ficoll centrifugation nécessitent 60 à 100 min pour terminer. Nous décrivons un procédé pour l'isolement rapide de mitochondries à partir de biopsies de mammifère en utilisant un dissociateur tissulaire commercial et filtration différentielle. Dans ce protocole, l'homogénéisation manuel est remplacé par un cycle d'homogénéisation normalisée du dissociateur tissulaire. Cela permet d'homogénéisation uniforme et cohérente de tissu qui n'est pas facile à réaliser avec homogénéisation manuelle. Après dissociation des tissus, le broyat est filtré à travers des filtres de maille de nylon, ce qui élimine les étapes de centrifugation répétitives. En conséquence, l'isolement des mitochondries peut être effectuée en moins de 30 min. Ce protocole d'isolement rendement d'environ 2 x 10 ¹⁰ mitochondries compétentes viables et la respiration de 0,18 ± 0,04 g (poids humide) de l'échantillon de tissu.

Introduction

Les mitochondries existent dans toutes les cellules du corps à l'exception des globules rouges et sont impliqués dans un grand nombre de processus cellulaires et métaboliques importantes ^1-4. En raison de ces nombreuses fonctions, dommage mitochondrial peut avoir des effets néfastes ^3. Afin d'étudier la fonction mitochondriale et la dysfonction plusieurs méthodes d'isolement des mitochondries ont été décrits. Les premiers comptes publiés de mitochondrial date de l'isolement à la 1940 ^5-8. Le premier essai a démontré documenté isolement des mitochondries par broyage du tissu hépatique dans un mortier puis par centrifugation dans une solution de sel à faible vitesse ^5,8. Plus tard, d'autres groupes étendus sur la procédure d'origine et ont démontré fractionnement du tissu sur la base de la centrifugation différentielle ^8.6. Ces premières méthodes ont constitué la base des techniques actuelles qui intègrent souvent homogénéisation et / ou centrifugation différentielle ^9-15. Le nombre de homogenizatiet les étapes de centrifugation varie selon les protocoles. Ces étapes répétitives d'augmenter le temps pour l'isolement des mitochondries et finalement réduisent la viabilité. En outre, l'homogénéisation manuel peut provoquer des dommages et incohérentes mitochondriales résultats s'il n'est pas correctement contrôlée ^10,16.

Récemment, nous avons utilisé l'homogénéisation et centrifugation différentielle pour isoler les mitochondries pour la transplantation dans le tissu myocardique ^17,18. Cette procédure d'isolement longue besoin d'environ 90 minutes et l'applicabilité clinique de cette méthode est donc limitée. Pour permettre une utilisation thérapeutique dans le traitement aigu et clinique chirurgicale nous avons mis au point un procédé d'isolement des mitochondries rapide qui peut être effectué en moins de 30 min.

Les principaux avantages de ce protocole sont que la dissociation des tissus uniformisée permet d'uniforme et cohérente homogénéisation du tissu qui n'est pas facile à réaliser avec homogénéisation manuel. Dans suppion, l'utilisation de la filtration différentielle à la place de la centrifugation différentielle élimine beaucoup de temps et répétition des étapes de centrifugation permettant l'isolement des mitochondries plus rapide compétentes hautement purifiés, viables et de respiration.

La capacité à isoler les mitochondries compétentes viables et de respiration en moins de 30 minutes permet d'applicabilité clinique. Ce protocole d'isolement a un potentiel pour une utilisation en chirurgie coronaire pontage aorto-greffe (CABG), et d'autres procédures thérapeutiques.

Protocole

Préparation

1. Préparez 1 M K-HEPES Stock Solution (ajuster le pH à 7,2 avec KOH).
2. Préparer M K-EGTA Stock Solution (ajuster le pH à 8,0 avec KOH) 0,5.
3. Préparez 1 M KH ₂ PO ₄ Stock Solution.
4. Préparez 1 M _MgCl2 Solution mère.
5. Préparation du tampon d'homogénéisation (pH 7,2), 300 mM de saccharose, 10 mM de HEPES-K, et 1 mM d'EGTA-K. Conserver à 4 ° C.
6. Préparer le tampon de respiration 250 mM de saccharose, 2 mM de KH ₂ PO _4, 10 mM MgCl _2, mM de tampon HEPES-K 20 (pH 7,2) et 0,5 mM de K-EGTA (pH 8,0). Conserver à 4 ° C.
7. Préparer la solution mère 10x PBS en dissolvant 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na ₂ HPO _4, et 2,4 g de KH ₂ PO ₄ dans 1 litre à double H ₂ O distillée (pH 7,4).
8. Préparer 1x PBS à la pipette 100 ml 10x PBS dans 1 L à double H ₂ O. distillée
9. Préparer subtilisine A Stock en pesant 4 mg de subtilisine A dansun tube à centrifuger de 1,5 ml. Conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation.
10. Préparer BSA Stock en pesant 20 mg de BSA dans un tube de 1,5 ml. Conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation.

Isolement mitochondriale (figure 1)

1. Immédiatement avant l'isolement, la subtilisine A se dissoudre dans 1 ml de tampon d'homogénéisation.
2. Immédiatement avant l'isolement, la dissolution de BSA dans 1 ml de tampon d'homogénéisation.
3. Recueillir deux échantillons de tissus frais en utilisant un poinçon 6 mm de l'échantillon de biopsie et magasin en 1x PBS dans un tube à centrifuger conique de 50 ml sur la glace.
4. Transférez les deux poinçons 6 mm de tissu dans un tube de dissociation de C contenant 5 ml de glace froide homogénéisation tampon.
5. Homogénéiser le tissu en plaçant le tube de dissociation de C sur la dissociateur de tissus et sélectionnez le cycle de l'isolement des mitochondries pré-établi (60 sec homogénéisation).
6. Retirer le tube de dissociation de C à un seau à glace.
7. Ajouter 250 pi de subtilisine A Solution mère à l'l'homogénat, mélanger par inversion et incuber l'homogénat sur de la glace pendant 10 min.
8. Placer un filtre à mailles de 40 um sur un tube à centrifuger conique de 50 ml sur de la glace humide et pré-filtre avec le tampon d'homogénéisation et de filtrage de l'homogénat dans le tube à centrifuger conique de 50 ml sur de la glace.
9. Ajouter 250 ul de fraîchement préparé BSA Solution mère au filtrat et mélanger par inversion.
   Remarque: Ignorez cette étape si la détermination de la protéine mitochondriale est nécessaire.
10. Placer un filtre de 40 um sur un tube à centrifuger conique de 50 ml sur de la glace humide et pré-filtre avec le tampon d'homogénéisation et de filtrage de l'homogénat dans le tube à centrifuger conique de 50 ml sur de la glace.
11. Placer un filtre de 10 um sur un tube à centrifuger conique de 50 ml sur de la glace humide et pré-filtre avec le tampon d'homogénéisation et de filtrage de l'homogénat dans le tube à centrifuger conique de 50 ml sur de la glace.
12. Transférer le filtrat à deux pré-réfrigéré 1,5 ml microtubes à centrifuger et centrifuger à 9000 g pendant 10 min à4 ° C.
13. Retirer le surnageant et remettre en suspension et de combiner des pastilles dans 1 ml de tampon glacé respiration.

ATP Assay

Remarque: Pour déterminer l'activité métabolique des mitochondries isolées d'un dosage par luminescence de l'ATP peut être effectuée en utilisant un kit de dosage de l'ATP. Le protocole, réactifs et des étalons ont été fournis dans le kit de dosage. Un résumé de la procédure est décrite ci-dessous.

1. Equilibrer les réactifs à la température ambiante.
2. Préparer 10 mM ATP Stock Solution en dissolvant culot ATP lyophilisée en 1170 ul d'eau distillée deux fois. Rangez ATP Solution Stock standard et échantillons mitochondriaux préparés sur la glace.
3. Ajouter 5 ml de solution tampon de substrat à un flacon de solution de substrat lyophilisé. Mélanger délicatement et placer dans l'obscurité.
4. Ajouter 100 ul de tampon de respiration à tous les puits de, un fond noir opaque, plaque de 96 puits.
5. Ajouter 10 ul de mitochondries des échantillons préparés dans chaque puits ofa noir, fond opaque, plaque de 96 puits. Note: Les échantillons sont étalés en triple. Inclure une ligne de normes et de trois puits pour le contrôle négatif (Respiration Buffer).
6. Ajouter 50 ul de solution de mammifère de la lyse des cellules dans chaque puits, y compris des normes et des contrôles.
7. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 5 min sur un agitateur orbital à 125 tours par minute.
8. Au cours de l'incubation préparer normes ATP dans des concentrations de 0,1 mM, 0,05 mM, 0,01 mM, 0,005 mM, 0,001 mM, et 0,0001 mM d'ATP à partir de la solution mère mM ATP 10. normes de magasins sur la glace.
9. Après l'incubation, ajouter 10 ul de standards de l'ATP à des puits correspondant, comme indiqué sur la carte en forme de plaque. Note: Les normes sont effectuées en double.
10. Ajouter 50 ul de la solution de substrat reconstitué dans chaque puits.
11. Incuber la plaque à 37 ° C sur l'agitation pendant 5 min à 125 rpm.
12. Ouvrez le logiciel Gen5 1.11 sur un ordinateur relié au spectrophotomètre.
13. Sous "Créez un nouvel élément ", cliquez sur" Expérience ".
14. Cliquez sur "protocole par défaut". Cliquez sur "Ok".
15. Dans la colonne de gauche, sélectionnez "Protocole", puis "procédure".
16. Sélectionnez "Delay". Situé à 0:10:00. Cliquez sur "Ok".
17. Sélectionnez "Lire". Sélectionnez "Luminescence" de menu déroulant. Définissez les autres paramètres: Lire le type Endpoint, temps d'intégration 0: 01.00 MM: SS.SS, Filtre Règle 1, émission Hole, Optique Position Haut, sensibilité 100, Top sonde Décalage vertical 1.00 mm.
18. Lorsque la plaque est prêt à être analysé, cliquez sur l'icône "Lire Plate" sur la rangée du haut. Cliquez sur "Lire". Lorsque le spectrophotomètre s'ouvre, placez la plaque sur le plateau, le puits A1 dans le coin supérieur gauche. Une boîte avec la température va s'ouvrir. Cliquez sur "Lire". Remarque: Des valeurs plus élevées sont en corrélation avec les niveaux d'ATP accrus et l'activité métabolique plus élevé.

Résultats

A la figure décrivant les étapes de la procédure dans l'isolement des mitochondries des tissus à l'aide de dissociation et de filtration différentielle est représentée sur la Figure 1. Temps de procédure total est inférieur à 30 min.

Des échantillons de tissus ont été obtenus en utilisant un poinçon de biopsie de 6 mm. poids des tissus a été de 0,18 ± 0,04 g (poids humide). Le nombre des mitochondries isolées tel que déterminé par la taille des pa...

Discussion

Pour isoler avec succès mitochondries qui utilisent ce protocole, il est essentiel de garder toutes les solutions et les échantillons de tissus sur la glace pour conserver la viabilité mitochondriale. Même lorsqu'il est maintenu sur la glace, les mitochondries isolées présenteront une diminution de l'activité fonctionnelle au fil du temps ^19. Nous recommandons que toutes les solutions et les ajouts être pré-préparés. Nous avons pré-peser et stocker subtilisine A à 4 mg aliquotes de 1,5 ml...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sucrose	Sigma Aldrich	84100
HEPES	Sigma Aldrich	H4034
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
Substilsin A	Sigma Aldrich	P5380
BSA	Sigma Aldrich	A7906
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5379
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266
NaCl	Sigma Aldrich	S6191
KCl	Fisher Scientific	P2173
Na2HPO4	Fisher Scientific	S374
ATPlite Luminescence Assay System, 1000 Assay Kit	Perkin Elmer	6016941
Equipment
50 mL Conical Tubes	BD	352098
40 μm Nylon Filters	BD	352340
GentleMACS C tube	Miltenyl Biotech	120-005-331
1.5 mL Eppendorf tube	Fisher Scientific	05-408-129
6 mm biopsy punch	Miltex	33-36
10 μm Pluristrainer	Pluriselect	43-500-10-03
Eppendorf Centrifuge 5415C	Marshall Scientific	EP-5415C
GentleMACS Dissociator	Miltenyl Biotech	130-093-235
96-well plates, tissue culture treated	VWR	82050-732
Rotomax 120 orbital shaker	Heidolph	544-41200-00
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode  Microplate Reader	BioTek
Multisizer 4 Coulter Counter	Beckman Coulter	A63076
Oxytherm System	Hansatech Instruments
Hemacytometer	Fisher Scientific	267110