快速分离纯化线粒体移植用组织分离和鉴别过滤

摘要

一种用于线粒体的从哺乳动物组织活检快速分离方法进行说明。大鼠肝或骨骼肌肉制剂匀浆与商业组织离解和线粒体是通过尼龙网过滤分离差过滤。线粒体隔离时间是相对于60 <30分钟 - 用替代的方法100分钟。

摘要

使用差速离心和/或聚蔗糖梯度离心之前描述的线粒体分离方法需要60至100分钟内完成。我们描述了线粒体利用商业组织离解和鉴别过滤哺乳动物的活组织切片检查的快速提取方法。在这个协议中，手动均化置换为组织离解的标准化的均匀化周期。这使得均匀和组织的一致均质化是不容易用手工匀化来实现的。以下组织离解，在匀浆通过尼龙网过滤器，它消除重复离心步骤过滤。其结果是，线粒体隔离可以在不到30分钟来进行。此隔离协议产生约^2×10 10活和呼吸从0.18±0.04克（湿重）的组织样品主管线粒体。

引言

存在的每一个细胞在体内除了红血细胞中的线粒体，并参与了大量重要的细胞代谢过程^1-4。由于这些诸多功能，线粒体损伤可能具有不利的影响^3。为了研究线粒体功能和功能障碍的若干线粒体的分离方法进行了描述。线粒体隔离日至1940年^5-8最早公布的帐目。第一次记录尝试通过研磨肝组织在研钵中，然后离心以盐溶液在低速^5,8证实线粒体隔离。后来，其他群体扩大后，原来的程序，证明组织分离的基础上差速离心^6-8。这些早期方法形成的电流的技术，往往掺入均质化，和/或差速离心^9-15的基础。 homogenizati数并离心步骤不同协议之间。这些重复的步骤，增加了时间线粒体隔离，并最终降低的可行性。此外，手动均化可引起线粒体损伤和不一致的结果，如果没有适当的控制^，10,16。

最近，我们使用的同质化和差速离心分离线粒体移植到心肌组织^17,18。这个冗长分离过程需要约90分钟，该方法的临床适用性因此受到限制。要允许在临床和手术治疗急性治疗用途，我们已经开发出可以在不到30分钟内完成快速的线粒体分离过程。

该协议的主要好处是标准化的组织分解允许统一和组织的一致同质化是不容易用手工同质化来实现的。在乳房清洁度离子，代替差速离心的使用微分过滤消除了耗时的和重复离心步骤，允许对高度纯化的，可行的和呼吸能力的线粒体的更快速分离。

隔离可行和呼吸主管线粒体在不到30分钟的能力允许临床应用。这种隔离协议有潜力的冠状动脉旁路移植术（CABG）和其他治疗程序中使用。

研究方案

准备

1. 制备的1M K-HEPES溶液（pH调节至7.2，用KOH）。
2. 制备0.5M的K-EGTA溶液（调节pH值至8.0，用KOH）。
3. 制备的1M KH ₂ PO ₄的储备溶液。
4. 准备1米_氯化镁储备溶液。
5. 制备均质缓冲液（pH 7.2）中300mM的蔗糖，10mM的K-HEPES，和1mM K-EGTA。保存在4℃。
6. 制备呼吸缓冲液250mM的蔗糖，2mM的KH ₂ PO _4，10mM的MgCl ₂的_，20mM的K-HEPES缓冲液（pH值7.2）和0.5mM的K-EGTA（pH 8.0）中。保存在4℃。
7. 制备10倍的PBS原液溶解80克的NaCl，2克的KCl，14.4称量Na ₂ HPO _4，和2.4克KH ₂ PO ₄加入到1 L双蒸H _{2 O的} （pH 7.4）中。
8. 吹打百毫升10X PBS为1升双蒸H ₂ O准备1X PBS
9. 准备枯草杆菌蛋白酶A股称重在4毫克枯草杆菌蛋白酶A的以1.5 ml离心管中。储存在-20℃直到使用。
10. 准备BSA股票称取20毫克的BSA为1.5 ml离心管中。储存在-20℃直到使用。

线粒体的分离（图1）

1. 紧接隔离，溶解枯草杆菌蛋白酶A在1毫升均质缓冲液。
2. 紧接隔离，BSA溶解在1毫升均质缓冲液。
3. 使用6毫米活检样本冲和存储在1X PBS在冰50毫升离心管中收集两个新鲜组织标本。
4. 转移组织两个6毫米拳含有5ml冰冷的均质缓冲液的分离Ç管。
5. 由嵌合在组织离解的离解Ç管均质化的组织，并选择预先设定的线粒体隔离周期（60秒均化）。
6. 拆下分离ç管冰桶。
7. 加入250μl的枯草杆菌蛋白酶原液的匀浆，通过倒置混合，并培育在冰上匀浆10分钟。
8. 放置一个40微米的筛网过滤器上的冰和预湿的过滤器以均质缓冲液50ml锥形离心管中，并过滤匀浆成冰的50ml锥形离心管中。
9. 加入250微升新鲜制备的BSA储备液，向滤液并通过倒置混合。
   注:省略这一步，如果需要线粒体蛋白的决心。
10. 放置一个40微米的过滤器上的冰和预湿的过滤器以均质缓冲液50ml锥形离心管中，并过滤匀浆成冰的50ml锥形离心管中。
11. 放置一个10微米的过滤器上的冰和预湿的过滤器以均质缓冲液50ml锥形离心管中，并过滤匀浆成冰的50ml锥形离心管中。
12. 将滤液转移到2预冷1.5毫升离心管和离心9000 xg离心10分钟4ºC。
13. 除去上清液并重新悬浮和结合粒料在1ml冰冷的呼吸缓冲液。

ATP含量

注意:要确定分离线粒体的ATP荧光检测可以用一个ATP检测试剂盒进行的代谢活动。的协议，试剂和标准的测定试剂盒提供。的流程的概要进行说明。

1. 平衡试剂盒至室温。
2. 准备10毫摩尔ATP原液在1170微升双蒸水溶解冻干ATP的颗粒。储存的ATP冰上标准储备液，准备线粒体样本。
3. 加入5毫升底物缓冲溶液，以冻干底物液的小瓶中。轻轻摇匀后放置在黑暗中。
4. 加入100μl呼吸缓冲液至黑色，不透明的底部，96孔板的所有孔中。
5. 从所制备的样品中添加10微升线粒体向每个孔ø发黑色，不透明的底部，96孔板中。注:样品被镀以一式三份。包括行的标准，三口井为阴性对照组（呼吸缓冲器）。
6. 加入50微升的哺乳动物细胞溶解液到所有孔中，包括标准和控制。
7. 孵育板在37℃5分钟，在定轨摇床上以125转每分钟。
8. 在孵育制备的0.1毫米，0.05毫米，0.01毫米，0.005毫米，0.001毫米，和0.0001毫摩尔ATP从10毫摩尔ATP储备溶液浓度的ATP标准。商店的标准在冰上。
9. 温育后，加入10微升的三磷酸腺苷标准，以相应的孔中的板图上标明。注意:标准进行双份。
10. 加入50微升重组的底物溶液的各孔中。
11. 孵育板在37℃在定轨振荡器进行5分钟，在125转每分钟。
12. 打开GEN5 1.11软件与分光光度计相连的计算机上。
13. 在"创建新项目"，点击"实验"。
14. 点击"默认协议"。单击"确定"。
15. 在左侧列中，选择"协议"，然后选择"程序"。
16. 选择"延迟"。设置为00:10:00。单击"确定"。
17. 选择"读取"。从下拉菜单中选择"发光"。调整其他设置如下:读取类型的端点，积分时间0:01.00 MM:SS.SS，过滤器设置1，发射孔，光学部位顶部，感光度100，顶探头垂直偏移1.00毫米。
18. 当板已准备好进行分析，点击最上面一排的"阅读板块"图标。点击"读取"。当分光光度计打开后，将板与A1孔在左上角的托盘。随着温度的对话框将打开。点击"读取"。注:值越高，关联与增加ATP水平和较高的代谢活动。

结果

一个数字，概述采用组织分离和鉴别过滤线粒体的隔离程序步骤如图1。总过程时间小于30分钟。

组织样品用6毫米活检穿孔获得。组织的重量为0.18±0.04克（湿重）。线粒体分离为通过粒径数量确定的数目为^{2.4×10 10±0.1×10} 10线粒体对骨骼肌和^{2.75×10 10±0.1×10} 10线粒体肝制剂（ 图2A）。以允许比较线粒体数目也通过血细胞计数器确定。线?...

讨论

成功地分离出使用该协议，必须保持所有的解决方案和组织样品在冰上保持线粒体活力线粒体。在冰上保持甚至当，分 ​​离线粒体将表现出随着时间的推移¹⁹的功能活性的降低。我们建议所有的解决方案和补充预先做好准备。我们预先称重并存储枯草杆菌蛋白酶A在4毫克等分试样在1.5ml微量离心管中，并将其存储在-20℃。同样的BSA被预先称重并存储在在1.5ml微量离心管20毫克等分，可以储...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sucrose	Sigma Aldrich	84100
HEPES	Sigma Aldrich	H4034
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
Substilsin A	Sigma Aldrich	P5380
BSA	Sigma Aldrich	A7906
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5379
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266
NaCl	Sigma Aldrich	S6191
KCl	Fisher Scientific	P2173
Na2HPO4	Fisher Scientific	S374
ATPlite Luminescence Assay System, 1000 Assay Kit	Perkin Elmer	6016941
Equipment
50 mL Conical Tubes	BD	352098
40 μm Nylon Filters	BD	352340
GentleMACS C tube	Miltenyl Biotech	120-005-331
1.5 mL Eppendorf tube	Fisher Scientific	05-408-129
6 mm biopsy punch	Miltex	33-36
10 μm Pluristrainer	Pluriselect	43-500-10-03
Eppendorf Centrifuge 5415C	Marshall Scientific	EP-5415C
GentleMACS Dissociator	Miltenyl Biotech	130-093-235
96-well plates, tissue culture treated	VWR	82050-732
Rotomax 120 orbital shaker	Heidolph	544-41200-00
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode  Microplate Reader	BioTek
Multisizer 4 Coulter Counter	Beckman Coulter	A63076
Oxytherm System	Hansatech Instruments
Hemacytometer	Fisher Scientific	267110