Schnelle Isolierung und Reinigung von Mitochondrien für die Transplantation von Gewebe-Dissoziation und Differential Filtration

Zusammenfassung

Ein Verfahren zur schnellen Isolierung von Mitochondrien aus Säugergewebebiopsien beschrieben. Rattenleber-oder Skelettmuskelpräparate wurden mit einem kommerziellen Gewebe Dissociator homogenisiert und Mitochondrien wurden durch Differentialfiltration durch Nylon-Mesh-Filter isoliert. Mitochondriale Isolation Zeit <30 min im Vergleich zu 60 bis 100 min mit alternativen Methoden.

Zusammenfassung

Zuvor beschriebenen mitochondrialen Isolationsverfahren unter Verwendung differentieller Zentrifugation und / oder Ficoll-Gradienten-Zentrifugation erfordert 60 bis 100 min in Anspruch. Wir beschreiben ein Verfahren zur schnellen Isolierung von Mitochondrien aus Säugetierbiopsien unter Verwendung eines kommerziellen Gewebe Dissociator und Differentialfiltration. In diesem Protokoll ist eine manuelle Homogenisierung mit standardisierten Zyklus der Homogenisierung des Gewebes Dissociator ersetzt. Dies ermöglicht eine einheitliche und konsequente Homogenisierung von Gewebe, das wird nicht leicht mit Hand Homogenisierung erreicht. Nach Gewebedissoziation wird das Homogenat durch Nylon-Mesh-Filter, die sich wiederholenden Zentrifugationsschritten beseitigen gefiltert. Als Ergebnis kann die mitochondriale Isolierung in weniger als 30 min durchgeführt werden. Diese Isolation Protokoll ergibt etwa 2 x 10 ¹⁰ lebensfähige und Atmung zuständige Mitochondrien von 0,18 ± 0,04 g (Nassgewicht) Gewebeprobe.

Einleitung

Mitochondrien existieren in jeder Zelle des Körpers mit Ausnahme der roten Blutzellen und in einer Vielzahl von wichtigen zellulären Stoffwechselprozesse und ^1-4 involviert. Aufgrund dieser vielen Funktionen können mitochondriale Schäden schädlichen Wirkungen ³ aufweisen. Um die Funktion der Mitochondrien und mitochondriale Dysfunktion mehrere Isolationsmethoden zu untersuchen, wurden beschrieben. Die frühesten veröffentlichten Konten von mitochondrialen Isolierung Datum auf den 1940er ^5-8. Der erste dokumentierte Versuch demonstriert mitochondrialen Isolierung durch Schleifen Lebergewebe in einem Mörser, gefolgt von Zentrifugation in einer Salzlösung, bei niedriger Geschwindigkeit ^5,8. Später erweiterte anderen Gruppen auf dem ursprünglichen Verfahren und demonstrierte Gewebe Fraktionierung basierend auf differentielle Zentrifugation ^6-8. Diese frühen Methoden bildeten die Grundlage der aktuellen Techniken, die oft zu integrieren Homogenisierung und / oder differenzielle Zentrifugation ^9-15. Die Anzahl der homogenizatiauf und Zentrifugationsschritte variiert zwischen den Protokollen. Diese sich wiederholenden Schritten erhöhen die Zeit für mitochondriale Isolation und letztlich reduzieren Lebensfähigkeit. Darüber hinaus können manuelle Homogenisierung mitochondriale Schäden und inkonsistenten Ergebnissen führen, wenn nicht richtig gesteuert ^10,16.

Kürzlich haben wir Homogenisierung und differentielle Zentrifugation Mitochondrien für die Transplantation in Herzmuskelgewebe ^17,18 isolieren. Dieser langwierige Isolierungsverfahren benötigt ungefähr 90 min, und die klinische Anwendbarkeit dieses Verfahrens war daher begrenzt. Zur therapeutischen Verwendung bei akuten klinischen und chirurgischen Behandlung zu ermöglichen haben wir eine schnelle mitochondrialen Isolierungsverfahren, die in weniger als 30 min durchgeführt werden kann, entwickelt.

Die wichtigsten Vorteile dieses Protokolls sind, dass standardisierte Gewebedissoziation ermöglicht einheitliche und konsequente Homogenisierung von Gewebe, das wird nicht leicht mit Hand Homogenisierung erreicht. In additIonen, die Verwendung von Differentialfiltration anstelle der differentielle Zentrifugation eliminiert zeitraubende und wiederholte Zentrifugation Schritte ermöglichen eine schnellere Isolierung von hoch gereinigten, lebensfähige und kompetente Atmung Mitochondrien.

Die Fähigkeit, tragfähige und Atmung zuständige Mitochondrien in weniger als 30 min zu isolieren können für die klinische Anwendbarkeit. Diese Isolation Protokoll hat Potenzial für den Einsatz in koronarer Bypass-Chirurgie (CABG) und andere Therapieverfahren.

Protokoll

Vorbereitung

1. Bereiten 1 M K-HEPES-Stammlösung (einstellen mit KOH pH-Wert auf 7.2).
2. Bereiten 0,5 M K-EGTA-Stammlösung (einstellen mit KOH pH-Wert auf 8,0).
3. Bereiten 1 M KH ₂ PO ₄ Stock Lösung.
4. Bereiten 1 M MgCl _{2-Stammlösung.}
5. Vorbereitung Homogenisierungspuffer (pH 7,2) 300 mM Saccharose, 10 mM K-HEPES, 1 mM K-EGTA. Lagerung bei 4 ° C.
6. Vorbereitung Respiration Puffer 250 mM Saccharose, 2 mM KH ₂ PO _4, 10 mM MgCl _2, 20 mM K-HEPES-Puffer (pH 7,2) und 0,5 mM K-EGTA (pH 8,0). Lagerung bei 4 ° C.
7. Vorbereitung 10x PBS-Stammlösung hergestellt durch Lösen von 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na ₂ HPO ₄ und 2,4 g KH ₂ PO ₄ in 1 l doppelt destilliertem H ₂ O (pH 7,4).
8. Bereiten 1x PBS pipettiert 100 ml 10x PBS in 1 l doppelt destilliertem H ₂ O.
9. Bereiten Subtilisin A Stock durch Auswiegen 4 mg Subtilisin A inin ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Lagerung bei -20 ° C bis zur Verwendung.
10. Vorbereitung BSA Vektor durch Einwaage von 20 mg BSA in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Lagerung bei -20 ° C bis zur Verwendung.

Mitochondriale Isolation (Abbildung 1)

1. Unmittelbar vor der Isolation, auflösen Subtilisin A in 1 ml Homogenisierungspuffer.
2. Unmittelbar vor der Isolation, auflösen BSA in 1 ml Homogenisierungspuffer.
3. Sammeln Sie zwei frische Gewebeproben mit einem 6 mm Biopsieprobe Punsch und speichern in 1x PBS in einem 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen auf Eis.
4. Übertragen Sie die zwei 6 mm Stempeln von Gewebe zu einer Dissoziation C-Rohr mit 5 ml eiskaltem Homogenisierungspuffer.
5. Homogenisieren des Gewebes durch Anpassen der Dissoziation C-Rohr auf das Gewebe Dissociator und wählen Sie den voreingestellten mitochondrialen Isolierung Zyklus (60 Sekunden Homogenisierung).
6. Entfernen Sie die Dissoziation C-Rohr zu einem Eimer Eis.
7. Fügen Sie 250 ul Subtilisin A Stock Lösung, um dieHomogenat, mischen durch Umdrehen und Inkubation des Homogenats auf Eis für 10 min.
8. Legen Sie ein 40 um-Sieb-Filter auf eine 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen auf Eis und nassen vorge dem Filter mit Homogenisieren Buffer und filtern das Homogenat in die 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen auf Eis.
9. Fügen Sie 250 ul frisch zubereitet BSA-Stammlösung zu dem Filtrat und mischen durch Umdrehen.
   Hinweis: Lassen Sie diesen Schritt, wenn mitochondrialen Proteinbestimmung erforderlich ist.
10. Legen Sie eine 40-um-Filter auf eine 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen auf Eis und nassen vorge dem Filter mit Homogenisieren Buffer und filtern das Homogenat in die 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen auf Eis.
11. Legen Sie eine 10-um-Filter auf eine 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen auf Eis und nassen vorge dem Filter mit Homogenisieren Buffer und filtern das Homogenat in die 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen auf Eis.
12. Das Filtrat zwei vorgekühlte 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 9000 × g für 10 min bei4 ° C.
13. Überstand entfernen und wieder aussetzen und kombinieren Pellets in 1 ml eiskaltem Puffer Atmung.

ATP-Assay

Anmerkung: Zur Bestimmung der metabolischen Aktivität von isolierten Mitochondrien eine ATP-Lumineszenz-Assay kann unter Verwendung eines ATP-Assay-Kits durchgeführt werden. Das Protokoll, wurden Reagenzien und Standards in der Assay-Kit geliefert. Eine Zusammenfassung des Verfahrens wird nachfolgend beschrieben.

1. Ins Gleichgewicht Kit-Reagenzien auf RT.
2. Herstellung von 10 mM ATP-Stammlösung durch Auflösen von gefriergetrockneten ATP Pellet in 1.170 ul doppelt destilliertem Wasser. Speichern ATP-Standardstammlösung und bereit mitochondrialen Proben auf Eis.
3. 5 ml Substratpuffer Lösung für ein Fläschchen lyophilisierte Substrat-Lösung. Vorsichtig mischen und legen in der Dunkelheit.
4. 100 l Puffer Atmung zu allen Vertiefungen einer schwarzen, undurchsichtigen Boden, 96 Well-Platte.
5. Fügen Sie 10 ul der Mitochondrien aus den vorbereiteten Proben in jede Vertiefung ofa schwarz, undurchsichtig unten, 96-Well-Platte. Hinweis: Die Proben werden in dreifacher Ausfertigung überzogen. Fügen Sie eine Zeile für Standards und drei Brunnen für die Negativkontrolle (Atmung Buffer).
6. Fügen Sie 50 ul von Säugetierzell Lyse-Lösung in alle Vertiefungen, einschließlich der Normen und Kontrollen.
7. Die Platte bei 37 ° C für 5 min auf einem Orbitalschüttler bei 125 Umdrehungen pro Minute.
8. Während der Inkubation herzustellen ATP-Standards in Konzentrationen von 0,1 mM, 0,05 mM, 0,01 mM, 0,005 mM, 0,001 mM und 0,0001 mM ATP aus 10 mM ATP-Stammlösung. Shop-Standards auf Eis.
9. Nach der Inkubation werden 10 ul der ATP-Standards mit entsprechenden Vertiefungen wie auf der Platte Karte angezeigt. Anmerkung: Standards werden in doppelter Ausführung durchgeführt.
10. Dann werden 50 ul des rekonstituierten Substratlösung in jede Vertiefung.
11. Inkubieren der Platte bei 37 ° C auf dem Schüttler für 5 Minuten bei 125 Upm.
12. Offene Gen5 1.11-Software auf einem Computer mit dem Spektrophotometer verbunden ist.
13. Unter "Neues Element erstellen ", klicken Sie auf" Experiment ".
14. Klicken Sie auf "Standardprotokoll". Klicken Sie auf "OK".
15. In der linken Spalte, wählen Sie "Protokoll", dann "Vorgehensweise".
16. Wählen Sie "Delay". Eingestellt, 00.10.00. Klicken Sie auf "OK".
17. Wählen Sie "Lesen". Wählen Sie "Lumineszenz" aus der Drop-Down-Menü. Passen Sie andere Einstellungen auf die folgenden: Lesen Typ Endpoint, Integrationszeit 0: 01.00 MM: SS.ss, Filter-Sets 1, Emission Loch, Optik Top Position, Empfindlichkeit 100, Offset Top Probe Vertikal 1,00 mm.
18. Wenn die Platte ist bereit, analysiert werden, klicken Sie auf das Symbol "Lesen Plate" in der oberen Reihe. Klicken Sie auf "Lesen". Wenn das Spektralphotometer öffnet, legen Sie die Platte in das Fach mit gut A1 in der oberen linken Ecke. Eine Box mit der Temperatur wird geöffnet. Klicken Sie auf "Lesen". Hinweis: Höhere Werte korrelieren mit erhöhten ATP-Spiegel und höhere Stoffwechselaktivität.

Ergebnisse

Eine Figur skizziert die Verfahrensschritte bei der Isolierung von Mitochondrien mit Gewebedissoziation und Differenz Filtration ist in Abbildung 1 dargestellt. Gesamtverfahrensdauer weniger als 30 min.

Gewebeproben wurden mit einem 6 mm-Biopsie Punch erhalten. Gewebegewicht betrug 0,18 ± 0,04 g (Feuchtgewicht). Die Anzahl der Mitochondrien isoliert, wie durch die Teilchengröße Zählung bestimmt war 2,4 x ¹⁰ 10 ± 0,1 x ¹⁰ 10 Mitochondrien für Skele...

Diskussion

Um erfolgreich zu isolieren Mitochondrien mit diesem Protokoll ist es wichtig, alle Lösungen und Gewebeproben auf Eis zu halten, um die mitochondriale Lebensfähigkeit bewahren. Auch wenn auf Eis gehalten wird isolierten Mitochondrien eine Abnahme der funktionellen Aktivität im Laufe der Zeit ¹⁹ aufweisen. Wir empfehlen, dass alle Lösungen und Ergänzungen vor, vorbereitet werden. Wir voraus wiegen und zu speichern Subtilisin A in 4 mg Aliquots in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und speichern sie bei -20 ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sucrose	Sigma Aldrich	84100
HEPES	Sigma Aldrich	H4034
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
Substilsin A	Sigma Aldrich	P5380
BSA	Sigma Aldrich	A7906
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5379
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266
NaCl	Sigma Aldrich	S6191
KCl	Fisher Scientific	P2173
Na2HPO4	Fisher Scientific	S374
ATPlite Luminescence Assay System, 1000 Assay Kit	Perkin Elmer	6016941
Equipment
50 mL Conical Tubes	BD	352098
40 μm Nylon Filters	BD	352340
GentleMACS C tube	Miltenyl Biotech	120-005-331
1.5 mL Eppendorf tube	Fisher Scientific	05-408-129
6 mm biopsy punch	Miltex	33-36
10 μm Pluristrainer	Pluriselect	43-500-10-03
Eppendorf Centrifuge 5415C	Marshall Scientific	EP-5415C
GentleMACS Dissociator	Miltenyl Biotech	130-093-235
96-well plates, tissue culture treated	VWR	82050-732
Rotomax 120 orbital shaker	Heidolph	544-41200-00
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode  Microplate Reader	BioTek
Multisizer 4 Coulter Counter	Beckman Coulter	A63076
Oxytherm System	Hansatech Instruments
Hemacytometer	Fisher Scientific	267110