בידוד מהיר וטיהור של מיטוכונדריה להשתלה על ידי דיסוציאציה רקמות ודיפרנציאל סינון

Summary

שיטה לבידוד מהיר של המיטוכונדריה מביופסיות רקמות יונקים מתוארת. כבד חולדה או תכשירי שרירי שלד היה הומוגני עם Dissociator רקמה מסחרי ומיטוכונדריה היו מבודדת על ידי סינון ההפרש דרך מסנני רשת ניילון. זמן בידוד מיטוכונדריאלי הוא <30 דקות בהשוואה ל60-100 דקות תוך שימוש בשיטות אלטרנטיביות.

Abstract

שיטות בידוד המיטוכונדריה שתוארו קודם לכן באמצעות צנטריפוגה ההפרש ו / או צנטריפוגה שיפוע Ficoll דורשות 60 עד 100 דקות כדי להשלים. אנו מתארים שיטה לבידוד המהיר של המיטוכונדריה מביופסיות של יונקים באמצעות Dissociator רקמה מסחרי וסינון ההפרש. בפרוטוקול זה, הומוגניזציה ידנית הוחלפה במחזור הומוגניזציה הסטנדרטי של Dissociator הרקמה. זה מאפשר למדים ולתפעול עקבי של רקמה שאינה מושגת בקלות עם הומוגניזציה ידנית. בעקבות ניתוק רקמות, homogenate מסונן דרך מסנני רשת ניילון, אשר מבטלים צעדי צנטריפוגה חוזר על עצמו. כתוצאה מכך, בידוד המיטוכונדריה יכול להתבצע בפחות מ 30 דקות. פרוטוקול בידוד זה תשואה של כ 2 x 10 ¹⁰ מיטוכונדריה מוסמכת קיימא ונשימה מ0.18 ± 0.04 גרם דגימת רקמה (משקל רטובה).

Introduction

מיטוכונדריה קיימת בכל תא ותא בגוף מלבד תאי דם אדומים ומעורבים במספר רב של תהליכים תאיים וחילוף חומרים חשובים ^1-4. בגלל פונקציות רבות אלה, נזק המיטוכונדריה יכול להיות השפעות מזיקות ^3. על מנת לחקור מספר שיטות בידוד המיטוכונדריה פונקציה ותפקוד הלקוי של המיטוכונדריה תוארו. החשבונות הראשונים שפורסמו ממועד בידוד המיטוכונדריה ל1940s ^5-8. הניסיון המתועד הראשון הפגין בידוד המיטוכונדריה על ידי שחיקה רקמת כבד במכתש ואחריו צנטריפוגה בתמיסת מלח במהירות נמוכה ^5,8. מאוחר יותר, קבוצות אחרות הרחיבו בעניין ההליך המקורי והפגינו חלוקה רקמות מבוססת על צנטריפוגה ההפרש ^6-8. שיטות המוקדמות אלה היוו את הבסיס לטכניקות הנוכחיות אשר לעתים קרובות לשלב הומוגניזציה, ו / או צנטריפוגה ההפרש ^9-15. מספר homogenizatiובצנטריפוגה צעדים משתנה בין פרוטוקולים. צעדים חוזרים ונשנים אלה להגדיל את הזמן לבידוד המיטוכונדריה וסופו של דבר להפחית את הכדאיות. בנוסף, הומוגניזציה ידנית יכולה לגרום לתוצאות נזק ועולה בקנה אחד המיטוכונדריה אם לא מבוקרת ^10,16 כראוי.

לאחרונה, השתמשנו צנטריפוגה הומוגניזציה וההפרש לבודד את המיטוכונדריה להשתלה לרקמת שריר לב ^17,18. הליך בידוד ממושך זה נדרש כ 90 דקות והיישום הקליני של שיטה זו היה אפוא מוגבל. כדי לאפשר שימוש טיפולי אקוטי בטיפול קליני וכירורגים שפיתחנו הליך בידוד המיטוכונדריה מהיר שניתן לבצע בפחות מ 30 דקות.

היתרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם כי ניתוק רקמה סטנדרטי מאפשר למדים ולתפעול עקבי של רקמה שאינה מושגת בקלות עם הומוגניזציה ידנית. בadditיון, השימוש בסינון ההפרש במקום של צנטריפוגה ההפרש מבטל זמן רב וצעדי צנטריפוגה חוזר על עצמו ומאפשרים לבידוד מהיר יותר של מיטוכונדריה המוסמכת נקיה במיוחד, בת קיימא ונשימה.

היכולת לבודד מיטוכונדריה המוסמכת קיימא ונשימה בפחות מ 30 דקות מאפשרת ליישום קליני. יש פרוטוקול בידוד זה פוטנציאל לשימוש בניתוח מעקפי השתלה (CABG) ונהלים טיפוליים אחרים.

Protocol

הכנה

1. הכן 1 M K-HEPES מלאי פתרון (כדי להתאים את pH 7.2 עם KOH).
2. הכן 0.5 M K-EGTA מניות פתרון (כדי להתאים את pH 8.0 עם KOH).
3. הכן 1 M KH ₂ PO ₄ פתרון מניות.
4. הכן 1 M MgCl ₂ מניות פתרון.
5. הכן homogenizing מאגר 300 סוכרוז מ"מ, 10 מ"מ K-HEPES, ו1 מ"מ K-EGTA (pH 7.2). חנות ב 4 ° C..
6. הכן סוכרוז 250 מ"מ נשימת הצפת, 2 מ"מ KH ₂ PO _4, 10 מ"מ MgCl _2, 20 מ"מ K-HEPES חוצץ (pH 7.2) ו0.5 מ"מ K-EGTA (pH 8.0). חנות ב 4 ° C..
7. הכן 10x PBS מלאי פתרון על ידי המסת 80 גרמו של NaCl, 2 גרם של KCl, 14.4 גרם של Na ₂ HPO _4, ו2.4 גרם של KH ₂ PO ₄ לH 1 ליטר מזוקק פעמיים ₂ O (pH 7.4).
8. הכן PBS 1x ידי pipetting 10x מ"ל 100 PBS לתוך H 1 ליטר מזוקק פעמיים ₂ O.
9. הכן מלאי Subtilisin על ידי שקילת 4 מ"ג של Subtilisin בלצינור 1.5 מ"ל microfuge. אחסן ב-20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
10. הכן מלאי BSA על ידי שקילת 20 מ"ג של BSA לתוך צינור 1.5 מ"ל microfuge. אחסן ב-20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

בידוד מיטוכונדריאלי (איור 1)

1. מייד לפני הבידוד, לפזר Subtilisin ב 1 מ"ל של homogenizing הצפת.
2. מייד לפני הבידוד, לפזר BSA ב 1 מ"ל של homogenizing הצפת.
3. לאסוף שתי דגימות רקמה טריות באמצעות אגרוף 6 מ"מ דגימת ביופסיה וחנות ב1x PBS בצינור צנטריפוגות 50 מ"ל חרוטי על קרח.
4. העבר את שני 6 האגרופים מ"מ של רקמה לצינור C ניתוק המכיל 5 מ"ל של קר כקרח homogenizing הצפת.
5. Homogenize הרקמות על ידי התאמת צינור C ניתוק על Dissociator הרקמה ובחר את המחזור שנקבע מראש המיטוכונדריה הבידוד (60 הומוגניזציה שניות).
6. הסר את צינור C הניתוק לדלי קרח.
7. הוסף 250 μl של Subtilisin מלאי פתרון לhomogenate, מערבב על ידי היפוך ודגירת homogenate על קרח עבור 10 דקות.
8. מניחים מסנן רשת 40 מיקרומטר על צינור צנטריפוגות 50 מ"ל חרוטי על קרח ומראש רטוב המסנן עם homogenizing הצפת ולסנן homogenate לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ"ל חרוטי על קרח.
9. הוסף 250 μl של מוכן טרי BSA מלאי פתרון לתסנין ומערבבים על ידי היפוך.
   הערה: השמט שלב זה אם נדרש נחישות חלבון המיטוכונדריה.
10. מניחים מסנן 40 מיקרומטר על צינור צנטריפוגות 50 מ"ל חרוטי על קרח ומראש רטוב המסנן עם homogenizing הצפת ולסנן homogenate לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ"ל חרוטי על קרח.
11. מניחים מסנן 10 מיקרומטר על צינור צנטריפוגות 50 מ"ל חרוטי על קרח ומראש רטוב המסנן עם homogenizing הצפת ולסנן homogenate לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ"ל חרוטי על קרח.
12. העבר את התסנין לשני 1.5 מ"ל צינורות microfuge מראש צונן צנטריפוגות ב 9,000 XG 10 דקות ב4 ºC.
13. הסר supernatant מחדש להשעות ולשלב כדורים ב 1 מ"ל של קרח נשימת מאגר קר.

ATP Assay

הערה: כדי לקבוע את הפעילות המטבולית של מיטוכונדריה המבודדת assay הארה ATP יכול להתבצע באמצעות ערכת assay ATP. הפרוטוקול, חומרים כימיים ותקנים סופקו בערכת assay. סיכום של ההליך מתואר להלן.

1. לאזן ריאגנטים ערכה לRT.
2. הכן 10 מ"מ ATP מלאי פתרון על ידי המסת גלולה ATP lyophilized ב1,170 μl מים מזוקקים פעמיים. לאחסן ATP פתרון סטנדרטי צילומים ודגימות של המיטוכונדריה מוכנות על קרח.
3. הוסף 5 מ"ל של תמיסת מצע הצפת לבקבוקון של פתרון מצע lyophilized. מערבבים בעדינות ומניח בחושך.
4. הוספה של נשימת הצפת 100 μl לכל הבארות של חלק תחתון שחור, אטום, 96 צלחת גם.
5. הוסף 10 μl של המיטוכונדריה מהדגימות מוכנות היטב כל oשחור fa, תחתון אטום, 96 צלחת גם. הערה: דוגמאות הם מצופים בשלושה עותקים. כולל שורה לסטנדרטים ושלוש בארות לביקורת השלילית (נשימת הצפת).
6. הוסף 50 μl של פתרון תמוגה תא של יונקים לכל הבארות, לרבות תקנים ובקרות.
7. דגירה את הצלחת על 37 ºC למשך 5 דקות על שייקר מסלולית ב125 סל"ד.
8. במהלך הדגירה להכין סטנדרטים ATP בריכוזים של 0.1 מ"מ, 0.05 מ"מ, 0.01 מ"מ, 0.005 מ"מ, 0.001 מ"מ, ו0.0001 מ"מ ATP מ10 מ"מ ATP מלאי הפתרון. סטנדרטים חנות על קרח.
9. לאחר הדגירה, להוסיף 10 μl של תקני ATP למתאימים בארות כמצוין במפת הצלחת. הערה: תקנים מבוצעים בשני עותקים.
10. הוסף 50 μl של פתרון המצע מחדש היטב כל אחד.
11. דגירה את הצלחת על 37 ºC בייקר מסלולית במשך 5 דקות ב125 סל"ד.
12. תוכנה פתוחה Gen5 1.11 במחשב מקושר עם ספקטרופוטומטר.
13. תחת "צור פריט חדש ", לחץ על" ניסוי ".
14. לחץ על "פרוטוקול ברירת מחדל". לחץ על "אישור".
15. בעמודה השמאלית, בחר באפשרות "פרוטוקול", ואז "סדר דין".
16. בחר "עיכוב". הגדר ל0:10:00. לחץ על "אישור".
17. בחר "קראו". בחר "הארה" מתפריט הנפתח. התאם את הגדרות אחרות לפעולות הבאות: קראו סוג Endpoint, אינטגרציה שעת 0: 01.00 MM: SS.ss, סינון סטי 1, פליטת חור, אופטיקה מיקום עליון, רגישות 100, למעלה Probe אנכי אופסט 1.00 מ"מ.
18. כאשר הצלחת מוכנה להיות מנותח, לחץ על הסמל "קרא פלייט" בשורה העליונה. לחץ על "קרא". כאשר ספקטרופוטומטר נפתח, למקם את הצלחת למגש עם גם A1 בפינה השמאלית העליונה. תיבה עם הטמפרטורה תיפתח. לחץ על "קרא". הערה: ערכים גבוהים יותר לתאם עם רמות ATP מוגברות ופעילות המטבולית גבוהה יותר.

תוצאות

דמות מתארת ​​את הצעדים פרוצדורליים בבידוד של המיטוכונדריה באמצעות ניתוק רקמות וסינון ההפרש מוצגת באיור 1. זמן פרוצדורליים סה"כ הוא פחות מ 30 דקות.

דגימות רקמה התקבלו באמצעות ביופסית 6 מ"מ. משקל רקמה היה 0.18 ± 0.04 g (משקל...

Discussion

כדי לבודד בהצלחה מיטוכונדריה תוך שימוש בפרוטוקול זה הוא חיוני כדי לשמור על כל הפתרונות ודגימות רקמה על קרח כדי לשמור על יכולת קיום של המיטוכונדריה. גם כאשר שמר על קרח, מיטוכונדריה המבודדת תפגין ירידה בפעילות תפקודית לאורך זמן ^19. אנו ממליצים שכל הפתרונות והתוספ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sucrose	Sigma Aldrich	84100
HEPES	Sigma Aldrich	H4034
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
Substilsin A	Sigma Aldrich	P5380
BSA	Sigma Aldrich	A7906
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5379
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266
NaCl	Sigma Aldrich	S6191
KCl	Fisher Scientific	P2173
Na2HPO4	Fisher Scientific	S374
ATPlite Luminescence Assay System, 1000 Assay Kit	Perkin Elmer	6016941
Equipment
50 mL Conical Tubes	BD	352098
40 μm Nylon Filters	BD	352340
GentleMACS C tube	Miltenyl Biotech	120-005-331
1.5 mL Eppendorf tube	Fisher Scientific	05-408-129
6 mm biopsy punch	Miltex	33-36
10 μm Pluristrainer	Pluriselect	43-500-10-03
Eppendorf Centrifuge 5415C	Marshall Scientific	EP-5415C
GentleMACS Dissociator	Miltenyl Biotech	130-093-235
96-well plates, tissue culture treated	VWR	82050-732
Rotomax 120 orbital shaker	Heidolph	544-41200-00
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode  Microplate Reader	BioTek
Multisizer 4 Coulter Counter	Beckman Coulter	A63076
Oxytherm System	Hansatech Instruments
Hemacytometer	Fisher Scientific	267110