Doku Ayrışma Ve Diferansiyel süzülerek Nakli İçin Mitokondri Of Rapid İzolasyon ve saflaştırma

Özet

Memeli Doku biyopsilerinden mitokondri hızlı izole edilmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Sıçan karaciğer, iskelet kası ya da preparat, ticari ayrıştırıcı doku homojenize edildi ve mitokondri naylon gözenekli filtrelerden geçerek, süzme ile izole edilmiştir. Seçenek yöntemler kullanılarak da 100 dakika - Mitokondriyal izolasyon süresi 60 kıyasla <30 dk.

Özet

Diferansiyel santrifüjleme ve / veya, Ficoll gradyan santrifüj kullanılarak daha önce anlatıldığı mitokondriyal izolasyon yöntemleri tamamlamak için 60-100 dakika gerektirir. Bir ticari doku Dissociator ve ayırıcı filtrasyon kullanılarak memeli biyopsilerinden mitokondri hızlı izolasyonu için bir yöntem tarif eder. Bu protokol, el homojenleştirme doku ayrıştırıcı, en standart homojenizasyon döngüsü ile değiştirilir. Bu düzgün ve kolay bir manuel homojenizasyon ile elde edilemez doku tutarlı bir homojenizasyon işleminin uygulanmasına izin verir. Doku ayrışma sonra, homojenat tekrarlanan santrifüj adımları ortadan naylon örgü filtreler aracılığıyla filtre edilir. Bunun bir sonucu olarak, yalıtım mitokondriyal az 30 dk içinde gerçekleştirilebilir. Bu izolasyon protokol 0.18 ± 0.04 g (ıslak ağırlık) ya da doku numunesinden yaklaşık 2 ¹⁰ x 10 uygulanabilir ve solunum yetkili mitokondri verir.

Giriş

Mitokondri kırmızı kan hücreleri hariç, vücuttaki her hücrede mevcuttur ve önemli hücresel ve metabolik süreçleri ^1-4 arasında bir sayıda katılmaktadırlar. Çünkü bu birçok fonksiyonun, mitokondriyal hasar zararlı etkileri ³ olabilir. Mitokondriyal fonksiyon ve disfonksiyonu birkaç mitokondriyal izolasyon yöntemleri araştırmak amacıyla tarif edilmiştir. 1940'larda ^5-8 mitokondriyal izolasyon tarihten erken yayınlanmış hesaplar. Ilk belgelenmiş girişim düşük hızda ^5,8 bir tuz çözeltisi içinde ve ardından merkezkaçlama uygulanarak, bir havan içinde karaciğer doku öğüterek mitokondriyal izolasyonu gösterdi. Daha sonra, diğer gruplar orijinal prosedürü üzerine genişletilmiş ve diferansiyel santrifüj ^6-8 dayalı doku ayrımlaştığını gösterdi. Bu ilk yöntemlerin sık sık homojenizasyon ve / veya diferansiyel santrifüj ^9-15 dahil güncel tekniklerin temelini oluşturmuştur. Homogenizati sayısıadımlar ve santrifüj protokolleri arasında değişir. Bu tekrarlı adımlar mitokondriyal izolasyon süresini artırmak ve sonuçta canlılığını azaltır. Düzgün ^10,16 kontrollü değilse Ayrıca, manuel homojenizasyon mitokondriyal hasar ve tutarsız sonuçlara neden olabilir.

Son zamanlarda, biz miyokard dokusu ^17,18 içine nakli için mitokondri izole etmek için homojenizasyon ve diferansiyel santrifüj kullanılır. Bu izolasyon prosedürü, uzun, yaklaşık 90 dakika gerekli ve bu yöntemin klinik uygulanabilirliği dolayısıyla sınırlı kalmıştır. Klinik ve cerrahi tedavi akut terapötik kullanım için izin vermek için daha az bir süre, 30 dakika içinde yapılabilir hızlı bir mitokondriyal izolasyon işlemi geliştirdik.

Bu protokolün büyük faydalar standart doku ayrışma üniforma ve kolayca manuel homojenizasyon ile elde edilmez doku tutarlı homojenizasyon için izin verdiğini vardır. Additiyon, diferansiyel santrifüj yerine diferansiyel filtrasyon kullanımı zaman alıcı ve son derece saflaştırılmış yaşayabilir ve solunum yetkili mitokondri daha hızlı izolasyonu için izin tekrarlayan santrifüj adımları ortadan kaldırır.

30 dakikadan az yaşayabilen ve solunum yetkili mitokondri izole yeteneği klinik uygulanabilirlik sağlar. Bu izolasyon protokol koroner arter bypass cerrahisi (KABG) ve diğer tedavi işlemlerinde kullanılmak üzere bir potansiyele sahiptir.

Protokol

Hazırlık

1. 1 M K-HEPES stok çözeltisi (KOH ile pH 7.2 ayarlayın) hazırlayın.
2. , 0.5 M EGTA K stok çözeltisi (KOH ile 8.0 pH ayarlayın) hazırlayın.
3. 1 M KH ₂ PO ₄ stok çözelti hazırlayın.
4. , 1 M _MgCl2 stok çözelti hazırlayın.
5. Homojenizasyon tampon maddesi (pH 7.2), 300 mM sakaroz, 10 mM K-Hepes ve 1 mM EGTA K hazırlayın. 4 ° C'de saklayın.
6. Solunum Tampon 250 mM sakaroz, hazırlama 2 mM KH ₂ PO _4, 10 mM _MgCI2, 20 mM K-HEPES tamponu (pH 7.2) ve 0.5 mM K-EGTA (pH 8.0). 4 ° C'de saklayın.
7. NaCl 80 g, KCl 2 g Na ₂ HPO _4, 14.4 g ve 1 L'lik iki kez damıtılmış _H2O (pH 7.4), KH ₂ PO ₄ 2.4 g eritilmesi ile 10x, PBS stok çözelti hazırlayın.
8. 1 L çift distile H ₂ O içine 100 ml 10x PBS pipetleyerek 1x PBS hazırlayın
9. Subtilisin A 4 mg dışarı ağırlığında tarafından Subtilisin bir Stok hazırlayın1.5 ml mikrofüj tüpüne. Kullanılana kadar -20 ° C'de saklayın.
10. 1.5 ml mikrofüj tüpüne BSA 20 mg tartılarak BSA Stok hazırlayın. Kullanılana kadar -20 ° C'de saklayın.

Mitokondriyal İzolasyon (Şekil 1)

1. Izolasyon hemen önce, homojenizasyon tampon maddesi içinde 1 ml subtilisin A çözülür.
2. Izolasyon hemen önce, homojenizasyon tampon maddesi içinde 1 ml BSA çözülür.
3. Buz üzerinde bir 50 ml konik santrifüj tüpüne 1x PBS içinde 6 mm biyopsi örneği yumruk ve mağaza kullanarak iki taze doku örneklerini toplar.
4. Homojenleştirme tamponu buz gibi soğuk 5 ml ihtiva eden bir ayırma tüpüne C dokusunun iki adet 6 mm delikler aktarın.
5. Doku dissociator üzerindeki ayrışma C tüpü takarak doku homojenize ve önceden ayarlanmış mitokondriyal izolasyon döngüsü (60 sn homojenizasyon) seçin.
6. Bir buz kovası ayrışma C tüpü çıkarın.
7. Subtilisin için bir stok çözeltisi 250 ulHomojenat, çevirerek karıştırın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe Homojenat.
8. Homojenleştirme Tamponu ile buz ve önceden nemli filtre üzerinde bir 50 mL konik santrifüj tüpü üzerine 40 mikron gözenekli bir filtre yerleştirilmesi ve buz üzerinde 50 ml konik santrifüj tüpüne Homojenat filtre.
9. Filtrata taze hazırlanmış BSA Stok Çözüm 250 ul ekleyin ve çevirerek karıştırın.
   Not: mitokondriyal protein tayini gerekli ise, bu adımı atlayın.
10. Homojenleştirme Tamponu ile buz ve önceden nemli filtre üzerinde 50 ml konik santrifüj tüpü üzerine bir 40 mikron filtre yerleştirin ve buz üzerinde 50 ml konik santrifüj tüpüne Homojenat filtre.
11. Homojenleştirme Tamponu ile buz ve önceden nemli filtre üzerinde 50 ml konik santrifüj tüpü üzerine bir 10 mikron filtre yerleştirin ve buz üzerinde 50 ml konik santrifüj tüpüne Homojenat filtre.
12. 10 dk boyunca 9000 x g'de iki önceden soğutulmuş 1.5 ml mikrofüj tüplerine ve santrifüj filtrat aktarın4 ºC.
13. Süpernatantı ve yeniden askıya ve buz soğuk Solunum Tampon 1 ml pelet birleştirir.

ATP Deneyi

Not: bir ATP parlaklık deney ATP deney kiti kullanılarak gerçekleştirilebilir izole mitokondri metabolik aktivitesini belirlemek. Protokol, reaktifler ve standartlar deney kiti içinde temin edilmiştir. Yöntemin özeti, aşağıda tarif edilmiştir.

1. Oda sıcaklığına kiti reaktifler dengelenmesi.
2. Çifte damıtılmış su, 1.170 ul ATP liyofilize pelet eritilmesi ile, 10 mM ATP stok çözelti hazırlayın. ATP buz üzerinde standart Stok Çözüm ve hazırlanan mitokondriyal örnekleri saklamak.
3. Liyofilize edilmiş alt-tabaka çözeltisinin bir şişeye Yüzey Tampon çözelti 5 ml. İyice karıştırın ve karanlıkta yerleştirin.
4. Siyah, ışık geçirmeyen alt, 96 gözlü bir levhanın tüm oyuklara Solunum tampon 100 ul ilave edin.
5. Her hazırlanmış örneklerinden o iyi mitokondri 10 ul eklefa Siyah, ışık geçirmeyen alt, 96 çukurlu levha. Not: Numuneler üç kopya halinde plakalanır. Standartları ve negatif kontrol (Solunum Tampon) için üç kuyu için bir satır içerir.
6. Standartlar ve kontroller de dahil olmak üzere, tüm oyuklara memeli hücre lizis çözeltisinin 50 ul ekle.
7. 125 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
8. İnkübasyon sırasında, 10 mM ATP stok çözeltisinden 0.1 mM, 0.05 mM, 0.01 mM, 0.005 mM, 0.001 mM ve 0.0001 mM ATP konsantrasyonlarda ATP standartlar hazırlandı. Buz üzerinde saklayın standartları.
9. İnkübasyondan sonra, plaka haritada gösterildiği gibi karşılık gelen kuyu ATP standartların 10 ul ekle. Not: standartlar iki kopya halinde gerçekleştirilir.
10. Her bir oyuğa substrat çözeltisinin sulandırılmış 50 ul ekle.
11. 125 rpm'de 5 dakika boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde 37 ° C'de inkübe edin.
12. Spektrofotometre ile bağlantılı bir bilgisayarda açık Gen5 1.11 yazılımı.
13. "AltındaYeni Öğe Oluştur Experiment "", "tıklayın.
14. "Varsayılan Protokolü" üzerine tıklayın. "Tamam" ı tıklayın.
15. Sol sütunda, daha sonra, "Prosedür" "Protocol" seçeneğini seçin.
16. "Gecikme" seçeneğini seçin. 00:10:00 ayarlayın. "Tamam" ı tıklayın.
17. Seç "Oku". Açılan menüden gelen "Lüminesans" seçeneğini seçin. Aşağıdaki diğer ayarları yapın: tipi Endpoint, Entegrasyon Zaman 0 okuyun: 01.00 MM: SS.ss, Filtre 1 Takımları, Emisyon Hole, Optik Pozisyonu Top, Hassasiyet 100, En Sonda Dikey 1.00 mm Ofset.
18. Plaka analiz hazır olduğunda, üst satırda "Plakasını oku" simgesini tıklatın. "Oku" tıklayın. Spektrofotometre açıldığında, sol üst köşede de A1 ile tepsiye tabak yerleştirin. Sıcaklığına sahip bir kutu açılacaktır. "Oku" tıklayın. Not: Daha yüksek değerler artmış ATP seviyeleri ve daha yüksek metabolik aktivite ile ilişkilidir.

Sonuçlar

Doku Ayrışma ve diferansiyel filtrasyon kullanılarak mitokondri izolasyonu ile işlem adımları özetleyen bir şekil, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Toplam işlem süresi 30 dakikadan daha azdır.

Doku örnekleri 6 mm biyopsi zımbası kullanılarak elde edilmiştir. Doku ağırlığı 0.18 ± 0.04 g (ıslak ağırlık). Parçacık boyutu sayımı ile belirlenmiştir olarak izole mitokondri sayısı 2.4 oldu ¹⁰ x 10 x 10 ± 0.1, iskelet kası boyunca

Tartışmalar

Başarıyla mitokondriyal canlılığını korumak için buz üzerinde tüm çözümleri ve doku örnekleri tutmak için önemli olan bu protokolü kullanarak mitokondri izole etmek için. Buz üzerinde muhafaza bile, izole mitokondri zaman ¹⁹ vasıtasıyla işlevsel aktivitesinde bir azalma sergiler. Hepimiz çözümleri ve eklemeler önceden hazırlanmış öneririz. Biz önceden tartılır ve 1.5 ml mikrofüj tüpler 4 mg parçalar halinde saklayın ve subtilisin A -20 ° C'de saklayın. Benzer şekild...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sucrose	Sigma Aldrich	84100
HEPES	Sigma Aldrich	H4034
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
Substilsin A	Sigma Aldrich	P5380
BSA	Sigma Aldrich	A7906
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5379
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266
NaCl	Sigma Aldrich	S6191
KCl	Fisher Scientific	P2173
Na2HPO4	Fisher Scientific	S374
ATPlite Luminescence Assay System, 1000 Assay Kit	Perkin Elmer	6016941
Equipment
50 mL Conical Tubes	BD	352098
40 μm Nylon Filters	BD	352340
GentleMACS C tube	Miltenyl Biotech	120-005-331
1.5 mL Eppendorf tube	Fisher Scientific	05-408-129
6 mm biopsy punch	Miltex	33-36
10 μm Pluristrainer	Pluriselect	43-500-10-03
Eppendorf Centrifuge 5415C	Marshall Scientific	EP-5415C
GentleMACS Dissociator	Miltenyl Biotech	130-093-235
96-well plates, tissue culture treated	VWR	82050-732
Rotomax 120 orbital shaker	Heidolph	544-41200-00
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode  Microplate Reader	BioTek
Multisizer 4 Coulter Counter	Beckman Coulter	A63076
Oxytherm System	Hansatech Instruments
Hemacytometer	Fisher Scientific	267110