Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

توضح هذه المقالة الفيديو على ميكروأري يستند أسلوب في المختبر لتحديد أهداف الجينات ومواقع الربط لمدة المنظمين استجابة النظام المكون.

Abstract

في الأساليب فيفو مثل رقاقة رقاقة هي تقنيات راسخة المستخدمة لتحديد الأهداف الجين العالمية لعوامل النسخ. ومع ذلك، فإنها ليست ذات فائدة محدودة في استكشاف البكتيرية نظامين التنظيمية المكون مع الظروف تفعيل uncharacterized. هذه النظم تنظيم النسخ فقط عند تفعيلها في وجود إشارات فريدة من نوعها. منذ هذه الإشارات غالبا ما تكون غير معروفة، في المختبر ميكروأري تستند الطريقة الموضحة في هذه المقالة الفيديو يمكن استخدامها لتحديد الأهداف الجينات ومواقع الربط للمنظمين الاستجابة. هذا الأسلوب تنقية الحمض النووي تقارب رقاقة يمكن أن تستخدم لأي منظم تنقيته في أي كائن حي مع تسلسل الجينوم. ينطوي على بروتوكول يسمح البروتين الموسومة تنقيته لربط الحمض النووي الجيني المنفصمة ثم تنقية تقارب الحمض النووي المرتبط بالبروتين، يليه وضع العلامات الفلورية من الحمض النووي والتهجين لمجموعة وتبليط مخصصة. السابقة الخطوات التي يمكن استخدامها لتحسين مقايسة لspecifiكما وصف المنظمين ج. وتستخدم القمم الناتجة عن تحليل البيانات للتنبؤ مجموعة زخارف موقع الملزمة، والتي يتم بعد ذلك التحقق من صحة تجريبيا. التنبؤات عزر يمكن استخدامها لتحديد المزيد من الأهداف الجينات المنظمين استجابة orthologous في الأنواع ذات الصلة عن كثب. ونحن لشرح تطبيق هذه الطريقة من خلال تحديد أهداف ملزمة الجينات والزخارف الموقع وبالتالي توقع وظيفة لمنظم استجابة DVU3023 تعتمد على sigma54 في البكتيريا البيئية منتزعة الكبريت الشائع Hildenborough.

Introduction

قدرة البكتيريا على البقاء على قيد الحياة وتزدهر اعتمادا كبيرا على مدى وهم قادرون على إدراك والرد على الاضطرابات في بيئاتهم، وهذا بدوره يعتمد على أنظمتها نقل الإشارة. وقد دعا عدد من النظم يدل على تشفير بكتيريا في "الذكاء الميكروبي"، ويمكن أن يكون مؤشرا لكلا تنوع بيئتها وقدرتها على الإحساس إشارات متعددة وتهذيب ردها 1. نظامان مكون نقل الإشارة (TCS) هي أنظمة الإشارات الأكثر انتشارا التي تستخدمها البكتيريا، وأنها تتكون من كيناز الحامض الاميني (هونج كونج) تستشعر إشارة خارجية وينقل عبر الفسفرة إلى منظم استجابة المستجيب (RR) 2. يمكن سجلات المورد دينا مجموعة متنوعة من المجالات الانتاج وسائط المستجيب مما مختلفة، لكن الرد الأكثر شيوعا هو التنظيم النسخي عن طريق الحمض النووي نطاق 1 ملزمة. إشارات لمست وظائف المقابلة من خدمات القيمة المضافةر غالبية TCSs لا تزال مجهولة.

على الرغم من أن في الجسم الحي أساليب مثل رقاقة رقاقة تستخدم بشكل روتيني لتحديد مواقع الربط الجيني لعوامل النسخ 3، فإنها يمكن أن تستخدم إلا لاثنين من الممثلين الإقليميين النظام المكون الجرثومي إذا من المعروف أن الظروف تفعيل أو الإشارات. غالبا ما تكون العظة البيئية التي تنشيط TCS هي أصعب لتحديد الأهداف من الجينات الخاصة بهم. في المختبر ميكروأري مقايسة على أساس وصفها هنا يمكن أن تستخدم لتحديد بفعالية وبسرعة الأهداف الجينات والتنبؤ ظائف TCSs. هذا الاختبار يستفيد من حقيقة أن الممثلين الإقليميين يمكن فسفرته وبالتالي تفعيلها في المختبر باستخدام جزيء صغير المانحين مثل الاسيتيل الفوسفات 4.

في هذه الطريقة، واسمه DAP رقاقة الحمض النووي للتقارب منقى رقاقة (الشكل 1)، يتم استنساخ الجين RR من الفائدة مع صاحب العلامة في E. القولونية، ويسمح للبروتين الموسومة تنقيته بعد ذلك إلى ثنائيةالثانية لالمنفصمة الحمض النووي الجيني. ثم يتم إثراء الحمض النووي ملزمة البروتين تقارب تنقية، وتتضخم الحمض النووي المخصب والمدخلات، fluorescently المسمى، المجمعة معا، وتهجين لمجموعة والتبليط الذي هو العرف لكائن من الفائدة (الشكل 1). تجارب ميكروأري تخضع لالتحف، وبالتالي يعملون خطوات إضافية لتحسين الفحص. واحدة من هذه الخطوة هو محاولة لتحديد هدف واحد لRR قيد الدراسة باستخدام فحوصات الكهربي التحول التنقل (EMSA) (انظر سير العمل في الشكل 2). ثم، بعد الملزمة لالحمض النووي الجيني والخطوات مديرية إدارة السجون، ويتم فحص الحمض النووي المرتبط بالبروتين والمدخلات التي كتبها QPCR لمعرفة ما إذا تم تخصيب الهدف الإيجابي في جزء محدد من البروتين بالنسبة للجزء المدخلات، مؤكدة بذلك الشروط الملزمة الأمثل ل RR (الشكل 2). بعد مجموعة التهجين، يتم تحليل البيانات للعثور على قمم أعلى كثافة إشارة تشير إلى مواضع الجيني حيث البروتين حالإعلان ملزمة. يمكن توقع وظائف للRR على أساس أهداف الجينات التي تم الحصول عليها. يتم استخدام مواضع الجيني المستهدف للتنبؤ الزخارف موقع ملزمة، والتي يتم بعد ذلك التحقق من صحة تجريبيا باستخدام EMSAs (الشكل 2). ثم قد يتم تمديد التوقعات الوظيفية والأهداف الجينات لRR إلى الأنواع التي تكود الممثلين الإقليميين orthologous عن طريق مسح الجينوم لتلك الزخارف ملزمة مماثلة (الشكل 2) ترتبط ارتباطا وثيقا. يمكن طريقة DAP رقاقة توفر ثروة من المعلومات عن TCS حيث سبق وكان هناك لا شيء. ويمكن أيضا أن تستخدم أسلوب لأي منظم النسخي إذا كان البروتين يمكن تنقيته ويمكن تحديد شروط ملزمة الحمض النووي، ولأي كائن من الفائدة مع تسلسل الجينوم المتاحة.

figure-introduction-3486
الشكل 1. ورقاقة تنقية الحمض النووي تقارب (DAP-رقاقة) استراتيجية 7. يتم استنساخ الجين RR من كائن من الفائدة مع كربوكسي محطة صاحب العلامة إلى E. سلالة التعبير القولونية. يتم تنشيط البروتين تنقية صاحب الموسومة من قبل الفسفرة مع الاسيتيل الفوسفات، ومختلطة مع الحمض النووي الجيني المنفصمة. يتم حفظ قسامة من رد فعل ملزم ال DNA المدخلات، في حين يخضع الباقي لتنقية تقارب باستخدام الراتنج ني NTA. المدخلات والحمض النووي محددة RR هي الجينوم تضخيمها، والمسمى مع CY3 وCy5، على التوالي. يتم تجميع الحمض النووي المسمى معا، وتهجين لمجموعة وتبليط، والتي يتم بعد ذلك تحليلها لتحديد الأهداف الجين. الرقم تعديل وطبعها باستخدام رخصة المشاع الإبداعي من 7.

figure-introduction-4415
الشكل 2. ملخص سير العمل. للحصول على أي البروتينات الموسومة تنقيتهن، تبدأ من خلال تحديد الهدف باستخدام EMSA. تسمح البروتين لربط الحمض النووي الجيني ومن ثم الحمض النووي تقارب تنقية (DAP) والجينوم تضخيم (WGA) والحمض النووي والمدخلات المخصب. إذا كان من المعروف هدفا الجين، استخدم QPCR لضمان أن الهدف معروف غير المخصب في جزء محدد من البروتين. إذا لم يتسن تحديد الهدف، الانتقال مباشرة إلى وضع العلامات الحمض النووي ومجموعة التهجين. إذا التخصيب بحلول QPCR لا يمكن ملاحظة، ثم كرر ملزمة البروتين gDNA والخطوات DAP-WGA باستخدام كميات البروتين المختلفة. استخدام تحليل مجموعة للعثور على القمم ورسم خريطة لها لاستهداف الجينات. استخدام مناطق المنبع من الجينات المستهدفة للتنبؤ الزخارف موقع ملزمة. التحقق من صحة الزخارف تجريبيا باستخدام EMSAs. استخدام الحافز لمسح الجينوم من الأنواع ذات الصلة ترميز orthologs من لوائح الراديو قيد الدراسة، والتنبؤ الجينات المستهدفة في تلك الأنواع كذلك. استنادا إلى أهداف الجينات التي تم الحصول عليها، ويمكن توقع وظيفة فسيولوجية من لوائح الراديو وorthologs لها. الرقم تعديل وطبعها باستخدام ج الإبداعيةترخيص ommons من 7.

Protocol

ملاحظة: بروتوكول الواردة أدناه مصممة لتحديد الأهداف الجين من DVU3023 RR من البكتيريا الشائع Hildenborough منتزعة الكبريت. ويمكن أن تتكيف مع أي منظم النسخي الأخرى ذات الاهتمام.

1. استنساخ وتنقية RR

  1. استنساخ الجين RR، وتحديدا DVU3023، من D. الشائع Hildenborough إلى القولونية التعبير ناقلات من هذا القبيل أن الجين هو C-عضال صاحب الموسومة والتعبير هو تحت سيطرة المروج T7.
    ملاحظة: عدة طرق الاستنساخ ويمكن استخدام ويتم تحديدها من قبل الباحث. ويمكن أيضا استخدام علامات تقارب بديل.
  2. تحويل التعبير إلى بناء E. القولونية BL21 (DE3) سلالة التعبير.
  3. يكبر 1 L من سلالة التعبير BL21 في 37 درجة مئوية. في مرحلة منتصف السجل، إضافة إلى 0.5 ملي IPTG للحث على البروتين التعبير. يستمر النمو في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة.
  4. خلايا الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 10 ميلن في 4 درجات مئوية. خلايا resuspend في تحلل العازلة (20 ملي فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4، 500 مم كلوريد الصوديوم، و 40 ملي إيميدازول، 1 ملغ / مل الليزوزيم، 1x أداة benzonase نوكلياز). ليز خلايا باستخدام الصحافة الفرنسية في 4 درجات مئوية.
  5. المحللة أجهزة الطرد المركزي في 15،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. تصفية باستخدام 0.45 ميكرون تصفية حقنة.
  6. غسل 1 مل ني سيفاروز العمود على صك FPLC باستخدام 10 مل من غسل العازلة (20 ملي فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4، 500 مم كلوريد الصوديوم، و 40 ملي إيميدازول).
  7. تحميل المحللة على العمود. غسل العمود مع 20 مل من غسل العازلة.
  8. أزل DVU3023 باستخدام التدرج من 0-100٪ شطف العازلة (20 ملي فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4، 500 مم كلوريد الصوديوم، و 500 ملي إيميدازول).
  9. تحميل كسور مزال على عمود تحلية، ويغسل مع العازلة تحلية (20 ملي فوسفات الصوديوم ودرجة الحموضة 7.4، 100 مم كلوريد الصوديوم).
  10. الطرد المركزي عينة البروتين في الوزن الجزيئي قطع تصفية الطرد المركزي عالية لتركيز البروتين. إضافة إلى 0.1 ملي DTT والجلسرين إلى 50٪ والبروتين تخزينها في -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: ستكون بحاجة الى طرق تنقية ليكون الأمثل فردي لكل بروتين قيد الدراسة.

2. تحديد الجينات المستهدفة لRR طريق التحول الكهربي التنقل الفحص (EMSA)

  1. PCR تضخيم المنطقة 400 سنة مضت المنبع من DVU3025 مرشح الجينات المستهدفة، وذلك باستخدام D. الشائع Hildenborough الحمض النووي الجيني كقالب، وغير المسماة التمهيدي إلى الأمام وعكس 5'-البيوتين المسمى التمهيدي.
    ملاحظة: نصائح لاختيار مرشح الجينات المستهدفة: في كثير من الأحيان الممثلين الإقليميين ربط مناطق المنبع من الجينات الخاصة بهم / الاوبرون، أو أنها قد تنظم الجينات المشفرة قريب. إذا كان لديه RR orthologs في الأنواع الأخرى، والبحث عن الجينات التي يتم حفظها في الحي. وتشمل الطرق البديلة اختيار الجينات المرشحة استنادا إلى التنبؤات regulon (على سبيل المثال، RegPrecise 5)، أو التنبؤ التي تعتمد على sigma54 المروجين 6 لسجلات المورد التي هي نفسها التي تعتمد sigma54.
  2. تشغيل المنتج PCR على 1٪ agarose هلام، وقطع ال 400 بع المنتج الحجم، وتنقية الحمض النووي باستخدام استخراج جل تنظيف عدة.
  3. خلط البروتين DVU3023 (0.5 بمول) مع 100 fmol من الركيزة الحمض النووي البيروكسيديز في 10 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 50 ملي بوكل، 5 ملي MgCl 2، 1 ملم DTT، الجلسرين 25٪ و 1 ميكروغرام / مل بولي dI.dC (غير محددة الحمض النووي منافس) في حجم ما مجموعه 20 ميكرولتر. أيضا إعداد رد فعل من دون أي بروتين كمجموعة تحكم. احتضان ردود الفعل في درجة حرارة الغرفة على مقاعد البدلاء لمدة 20 دقيقة.
  4. ملاحظة: هذه هي الشروط القياسية المدرجة ويمكن إضافة مكونات أخرى اعتمادا على رد فعل لوائح الراديو من الفائدة. إذا كان المطلوب تفعيل، إضافة 50 ملي فوسفات الاسيتيل إلى رد فعل (غالبا الممثلين الإقليميين وربط الحمض النووي في المختبر دون تفعيل).
  5. قبل تشغيل الجاهزة مصغرة 6٪ بولكرلميد-0.5X هلام TBE في 0.5X العازلة TBE على 100 فولت لمدة 30 دقيقة. إضافة 5 ميكرولتر من العازلة 5X التحميل (0.1٪ برموفينول الزرقاء، 0.1٪ الزيلين cyanol، 30٪ الجلسرين في 1X TBE) إلى ردود فعل ملزمة وتحميل 18 ميكرولتر من ردود الفعل إلى زش. تشغيل في 100 فولت لمدة 2 ساعة.
    ملاحظة: من أجل تجنب ارتفاع درجة الحرارة، والتي يمكن أن تؤدي إلى تفارق من المجمعات الحمض النووي البروتين، وملء الغرفة العازلة الخارجي في النظام الكهربائي مع تشغيل العازلة مثل أن غالبية من هلام معزول عن طريق العازلة. بالتناوب، قد يتم تشغيل هلام في 4 درجات مئوية.
  6. قطع غشاء النايلون المحملة على حجم هلام ونقع عليه في 0.5X TBE لمدة عشر دقائق على الأقل. إزالة هلام من الكاسيت. قطع أي التلال قبالة هلام ساندويتش والجل والغشاء بين اثنين من أوراق الترشيح سميكة غارقة في 0.5X TBE، ووضع داخل الجهاز النشاف شبه الجافة وتشغيلها في 20 V لمدة 30 دقيقة.
  7. وضع غشاء داخل الصك ضوء الأشعة فوق البنفسجية crosslinker التجارية وضبط الوقت إلى 3 دقائق.
    ملاحظة: قد الآن الغشاء خزنها الجاف في درجة حرارة الغرفة لعدة أيام قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  8. استخدام مجموعة الكشف chemiluminescent المتاحة تجاريا التي توظف الفجل peroxida streptavidin الحصانحد ذاتها المترافقة لتطوير وصمة عار وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  9. صورة لطخة باستخدام الكمبيوتر التوصيل إلى كاميرا CCD مجهزة وابحث عن تحول في التنقل الركيزة DNA في وجود لوائح الراديو، مما يدل على أن RR يربط الحمض النووي التي يجري اختبارها.
    ملاحظة: خصوصية التحول الحمض النووي البروتين يمكن اختبارها من قبل بما في ذلك في رد فعل وجود فائض من الحمض النووي منافس غير المسماة، والتي ينبغي القضاء عليها أو إنقاصها التحول ينظر إليها.

3. تحقق الهدف التخصيب بعد الجينوم الحمض النووي والبروتينات ملزم

  1. رد فعل ملزمة الجيني DNA البروتين
    1. الحمض النووي الجيني القص بمتوسط ​​حجم 500 سنة مضت من قبل sonicating 100 ميكرولتر الحمض النووي الجيني (بتركيزات 100-200 نانوغرام / ميكرولتر) في أنبوب 1.5 مل microfuge باستخدام microtip مع 9 البقول السعة المنخفضة من 1 ثانية، مع 2 ثانية الفجوة بين لكل منهما.
      ملاحظة: إذا كان يرش الحمض النووي على الجانبين من الأنبوب، وتدور باستمرار محتويات بعد كل 3 البقول. الظروف الدقيقة المستخدمةسوف تختلف مع الصك sonicator المستخدمة. شظايا الحمض النووي المنفصمة قد تتراوح بين 100-1000 سنة مضت، ولكن يجب أن يكون متوسط ​​حجم 400-600 ضمن شركة بريتيش بتروليوم. الكثير من القص قد تؤدي إلى مواقع أقل ملزمة سليمة، وإما أكثر من اللازم أو قص القليل جدا سوف تؤثر على إعداد مكتبة خلال المصب الخطوات الجينوم التضخيم كله.
    2. مزيج 2-3 ميكروغرام من الحمض النووي الجيني المنفصمة مع البروتين RR (0.5 بمول من DVU3023) في 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 1 ملم DTT، 50 ملي بوكل، 5 ملي MgCl 2، 25٪ الجلسرين، و 50 ملي فوسفات الاسيتيل. احتضان ردود الفعل عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. نقل 10 ميكرولتر من رد الفعل هذا إلى أنبوب 1.5 مل والتسمية كما DNA المدخلات.
      ملاحظة: يتم إضافة الفوسفات الاسيتيل لتنشيط البروتين في المختبر الفسفرة. الفسفرة يحفز الحمض النووي ملزمة، ولكن العديد من الممثلين الإقليميين أيضا ربط الحمض النووي في المختبر دون تفعيل 7. فإن كمية البروتين وأضاف أن رد الفعل تعتمد على نشاط البروتين الإعدادية. وEMSA يمكن استخدامها لاختيارimize هذا المبلغ.
  2. تقارب تنقية الحمض النووي المرتبط بالبروتين
    1. إضافة 30 ميكرولتر من ني NTA الراتنج الاغاروز إلى أنبوب 0.6 مل microfuge. أجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 1 دقيقة لجمع الراتنج في الجزء السفلي، وإزالة طاف. إضافة 100 ميكرولتر من غسل العازلة (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 5 ملي MgCl 2، 50 ملي بوكل، 25٪ الجلسرين)، ونفض الغبار الأنبوب إلى المزيج، وأجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 2 دقيقة. إزالة طاف.
    2. إضافة 90 ميكرولتر المتبقية من رد فعل ملزم لغسلها راتنج ني NTA واحتضان في شاكر دوارة لمدة 30 دقيقة.
    3. أجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 2 دقيقة، وإزالة طاف (DNA غير منضم). إضافة 100 ميكرولتر من غسل العازلة، ونفض الغبار أنبوب لخلط محتويات، وأجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 2 دقيقة. إزالة طاف. كرر الخطوة غسل مرتين أكثر من ذلك.
    4. إضافة 35 ميكرولتر من شطف العازلة (20 ملي العازلة الفوسفات الصوديوم الهيدروجيني 8، 500 مم كلوريد الصوديوم، و 500 ملي إيميدازول) إلى الراتنج وتخلط من قبل vortexing. احتضان على مقاعد البدلاء في RT لمدة 5 دقائق. أجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 2 دقيقة. نقل طاف لأنبوب جديد 1.5 مل والتسمية باسم الحمض النووي جزء محدد من البروتين.
    5. أيضا إضافة 35 ميكرولتر من شطف العازلة على الحمض النووي المدخلات.
    6. تنقية المدخلات والكسور الحمض النووي المرتبط بالبروتين استخدام عدة تنقية PCR.
  3. الجينوم تضخيم المدخلات وعينات من الحمض النووي المرتبط بالبروتين.
    1. إضافة 10 ميكرولتر من المدخلات ومحددة بروتين الحمض النووي لفصل أنابيب PCR. إضافة 1 ميكرولتر من 10X العازلة تجزئة، 2 ميكرولتر من العازلة إعداد المكتبة، و 1 ميكرولتر من المكتبة لتحقيق الاستقرار حل لكل عينة. مزيج جيد من قبل vortexing ل. الحرارة في thermocycler في 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، والبرد على الجليد.
      ملاحظة: يجب أن يكون مقدار بدءا من الحمض النووي لا يقل عن 10 نانوغرام من أجل تجنب إدخال تحيز التضخيم.
    2. إضافة 1 ميكرولتر من مكتبة تحضير الانزيم، ومزيج من قبل pipetting، واحتضان في cycler الحرارية في 16 ° C/20 دقيقة، 24 ° C/20 دقيقة، 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، 75 ° C / 5 دقيقة، وعقد في 4 درجات مئوية.
    3. إلى كل أنبوب، إضافة 47.5 ميكرولتر من المياه، 7.5 ميكرولتر من 10X التضخيم مزيج الرئيسي، و 5 ميكرولتر من البلمرة. تخلط جيدا والحرارة في 95 درجة مئوية / 3 دقائق، تليها 20 دورات من 94 درجة C/15 ثانية، 65 ° C / 5 دقائق. عقد ردود الفعل في 4 درجات مئوية.
    4. تنقية عينات من الحمض النووي تضخيمها باستخدام طقم تنقية PCR وقياس تركيز الحمض النووي طيفيا.
  4. تحقق تخصيب الهدف في الحمض النووي ملزمة البروتين باستخدام QPCR
    1. الاشعال تصميم QPCR لتضخيم 200 نقطة أساس في المنطقة المنبع من الجين المستهدف (DVU3025) التحقق EMSA باستخدام أي التمهيدي تصميم البرمجيات المتاحة مجانا.
    2. إعداد ردود الفعل QPCR ثلاث نسخ لكل قالب الحمض النووي مع كل مجموعة التمهيدي. إعداد مزيج الرئيسي لكل مجموعة التمهيدي. 1X مزيج الرئيسي يحتوي على 10 ميكرولتر من 2X SYBR الأخضر QPCR المزيج، 0.5 ميكرومتر لكل التمهيدي والمياه إلى ما مجموعه 18 ميكرولتر. قسامة 18 ميكرولتر من مزيج الرئيسي لكل بئر من لوحة PCR 96 جيدا.
    3. مخففه وتضخيم وتنقية مدخلات وعينات من الحمض النووي المرتبط بالبروتين إلى 5 نانوغرام / ميكرولتر مع المياه واستخدامها كقالب الحمض النووي. إضافة 2 ميكرولتر من الحمض النووي القالب إلى الآبار.
    4. ختم لوحة واضحة جدا مع QPCR ختم الفيلم، وتدور أسفل لوحة في أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج / 1 دقيقة. وضع لوحة في الوقت الحقيقي QPCR الجهاز. دورة على النحو التالي باستخدام البرمجيات المرتبطة QPCR: 95 ° C / 1 دقيقة، و 40 دورات من 95 درجة C/10 ثانية، 59 ° C/15 ثانية، و 70 درجة C/35 ثانية.
    5. أيضا إعداد ردود الفعل QPCR ثلاث نسخ مع الاشعال لتضخيم مناطق المنبع من الجين لا علاقة لها (مراقبة سلبية).
    6. حساب ΔC T عن طريق طرح قيمة T C من الحمض النووي المرتبط بالبروتين عن ذلك من الحمض النووي المدخلات. حساب تخصيب أضعاف من الجينات المستهدفة في الحمض النووي المرتبط بالبروتين ك 2 ΔC T.
      ملاحظة: إذا تم التخصيب المنطقة المنبع الهدف في الحمض النووي المرتبط بالبروتين مقابل الحمض النووي المدخلات، فإنه يشير إلى أن ردود الفعل ملزمة وتنقية تقارب كانت التالىessful. انتقل إلى الخطوة 4. إذا لم يكن لوحظ إثراء المنطقة المنبع الهدف، كرر ردود فعل ملزمة (الخطوة 3.1) مع كمية مختلفة من البروتين.

4. صفها الحمض النووي والتهجين صفيف

  1. تسمية الحمض النووي DNA الإدخال مع CY3 والمخصب مع Cy5
    OTE: CY3 والأصباغ Cy5 خفيفة حساسة وينبغي توخي الحذر للحفاظ على التعرض للضوء إلى أدنى حد ممكن.
    1. مزيج 1 ميكروغرام الحمض النووي مع 40 ميكرولتر Cy3/Cy5-labeled 9-السائدة وضبط مستوى الصوت إلى 80 ميكرولتر مع الماء.
    2. الحرارة تفسد عند 98 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في الظلام (في thermocycler). البرد السريع على الجليد لمدة 2 دقيقة.
    3. إضافة 2 ميكرولتر Klenow البلمرة (3'-5'-إكسو -، 50،000 U / مل)، و 5 ملي dNTPs، و 8 ميكرولتر المياه إلى كل رد فعل، وتخلط جيدا، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في الظلام (في وthermocycler).
    4. إضافة إلى 50 ملي EDTA لوقف رد الفعل وحل كلوريد الصوديوم إلى 0.5 م.
    5. عينات نقل إلى 1.5 مل أنابيب تابعaining 0.9 حجم الأيزوبروبانول، واحتضان في الظلام لمدة 10 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي في 12،000 x ج لمدة 10 دقيقة. يجب أن يكون بيليه وردي لDNA CY3 المسمى DNA والأزرق للCy5 المسمى.
    6. غسل بيليه مع 80٪ من الإيثانول (500 ميكرولتر) وأجهزة الطرد المركزي في 12،000 x ج لمدة 2 دقيقة. الكريات الهواء الجاف لمدة 5-10 دقيقة في الظلام.
      ملاحظة: الكريات يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية.
    7. بيليه resuspend في 25 ميكرولتر المياه. قياس تركيز الحمض النووي طيفيا.
    8. تجمع معا 6 ميكروغرام كل من الحمض النووي CY3 وCy5 المسمى في أنبوب 1.5 مل والفراغ الجاف في جهاز للطرد المركزي على نار هادئة في الظلام (تغطية غطاء الطرد المركزي إذا كان شفافا).
      ملاحظة: الكريات يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية حتى جاهزة للتهجين.
  2. ميكروأري التهجين
    1. تحويل نظام التهجين في 3-4 ساعة قبل استخدامها وضبط درجة الحرارة إلى 42 درجة مئوية.
    2. إعداد التهجين الحل مزيج الرئيسي بحيث 1X الحل يحتوي 11.8 ميكرولتر 2X Hybridiاالنترنت العازلة، 4.7 ميكرولتر التهجين مكون A، و 0.5 ميكرولتر المحاذاة بنسبة ضئيلة.
    3. resuspend والكريات في 5 ميكرولتر المياه. إضافة 13 ميكرولتر من هذا الخليط للعينة. دوامة لمدة 15 ثانية، واحتضان عند 95 درجة مئوية في حمام جافة لمدة 5 دقائق. الحفاظ على العينات عند 42 درجة مئوية في نظام التهجين حتى جاهزة للتحميل.
    4. إعداد ميكروأري التجمع الشريحة خلاط، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    5. وضع التجمع خلاط الشريحة داخل منظومة التهجين. تحميل 16 ميكرولتر من العينة إلى ميناء التعبئة، وختم الموانئ مع الفيلم لاصقة، بدوره على الخلط في النظام، وهجن ل 16-20 ساعة عند 42 درجة مئوية.
    6. إعداد مخازن يغسل 1X الأول (250 مل)، والثاني (50 مل) والثالث (50 مل) من خلال تمييع 10X مخازن المتاحة تجاريا في الماء، وإلى كل DTT إضافة إلى 1 ملم. العازلة الدافئة أنا إلى 42 درجة مئوية.
    7. حرك خلاط الانزلاق إلى أداة التفكيك، ومكان داخل صحن يحتوي العازلة الدافئة أولا قشر خلاط حالا، في حين ركلات الترجيح بقوةتخاذ أداة التفكيك باليد.
    8. ضع الشريحة في وعاء مع 50 مل من غسل العازلة أنا ويهز بقوة لمدة 2 دقيقة باليد.
    9. نقل الشرائح في وعاء الثانية مع 50 مل غسل عازلة الثاني ويهز بقوة لمدة 1 دقيقة باليد.
    10. نقل الشرائح في وعاء ثالث مع 50 مل غسل عازلة الثالث، ويهز بقوة لمدة 15 ثانية باليد.
    11. وصمة عار بسرعة حواف الشريحة على منشفة ورقية، ووضع في رفوف الشريحة. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 2 دقيقة حتى يجف الشريحة. وضع ضمن حالة الانزلاق، ألفه مع احباط، وتخزينها في مجفف.
  3. مسح صفيف
    1. وضع الشريحة داخل الماسح الضوئي ميكروأري وفقا لتعليمات الصك.
    2. استخدام برنامج الماسح الضوئي لضبط موجات 532 نانومتر كما = 635 نانومتر CY3 و= Cy5، والمكاسب مضخم الأولي بين 350 و 400.
    3. معاينة الشريحة لتحديد موقع مجموعة على الشريحة. تحديد المنطقة مجموعة للمسح الضوئي.
    4. مسح مجموعة وضبط إعدادات مضخم بحيث ميزات مجموعة هي في معظمها الأصفر. الرسم البياني يجب أن تظهر منحنيات الأحمر والأخضر فرضه أو أقرب إلى بعضها البعض قدر الإمكان. يجب منحنيات إنهاء فوق 10 -5 التهم تطبيع في التشبع.
    5. حفظ كل 532 و 635 نانومتر الصور بشكل منفصل.
  4. مجموعة تحليل البيانات
    1. استيراد الصور إلى برنامج تحليل مجموعة. باستخدام البرمجيات، وإنشاء تقريرين الزوج (. الزوج) لكل مجموعة (لCY3 وCy5 الصور). إنشاء سجل تحجيم 2 ملفات نسبة استخدام الملفات الزوج. استخدام تسجيل 2 ملفات نسبة للبحث عن قمم باستخدام نافذة انزلاق 500 سنة مضت. خريطة ذروة مواضع إلى مناطق المنبع من الأهداف الجينات.
    2. تحقق من ظهور الهدف الإيجابي (تحديد باستخدام EMSA وأكدته QPCR، DVU3025 في هذا المثال) ضمن أفضل القمم.
      ملاحظة: إذا كان الهدف إيجابيا ليس بين أكبر الفعالية، فمن الممكن أن RR تحت consiالتخفيض المقنن لديه عدة أهداف الجينات وتكرار DAP-رقائق يمكن أن تجرى وقمم مشتركة بين جميع مكررات يمكن استخدامها لإنشاء قائمة الهدف.

5. ربط الحافز تنبؤ الموقع والتحقق من صحة

  1. استرداد تسلسل للمناطق المنبع (400 بي بي) للأهداف الجينات أعلى كما تم إنشاؤها بواسطة التحليل DAP رقاقة. MEME على تطبيق هذه التسلسلات من خلال الميكروبات عبر الإنترنت (meme.nbcr.net) للتنبؤ الزخارف.
    ملاحظة: يمكن محسن البروتينات ملزمة مثل المنظمين sigma54 التي تعتمد على ربط عدة مئات من أزواج قاعدة المنبع من موقع البداية. لالمنظمين النسخي الأخرى، وهي منطقة أقصر مثل 200 سنة مضت المنبع سوف يكون كافيا.
  2. أعلى وأسفل تصميم الأوليغومرات الحمض النووي حبلا التي تحتوي على توقع عزر موقع ملزم يحيط بها 10 قواعد على حد سواء. تأمر أعلى حبلا 5 'المعقدة البيروكسيديز.
  3. خلط oligos حبلا أعلى وأسفل في نسبة 1:1.5 في 10 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA، و 50 ملي مول كلوريد الصوديوم فيوحجم رد الفعل مجموعه 20 ميكرولتر في أنابيب PCR. الحرارة إلى 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في cycler الحرارية، تليها التبريد البطيء إلى 25 درجة مئوية. تمييع عشرة أضعاف واستخدام ذلك النوع البري dsDNA والركيزة لEMSA.
  4. إعداد ركائز تعديلها باستخدام نفس الخطوات المذكورة أعلاه، ولكن الأوليغومرات تصميم لتنفيذ 4-6 بدائل في قواعد الحفظ من عزر ملزمة.
  5. إعداد ردود الفعل ملزم مع لوائح الراديو والنوع البري أو تعديل ركائز ودراسة باستخدام EMSA كما هو موضح في الخطوة 2.
  6. ملاحظة: يتم التحقق من صحة عزر توقع إذا كان RR يربط نوع الركيزة البرية ولكن ليست واحدة تعديلها.

6. حفظ الحافز في ذات الأنواع البكتيرية الأخرى

  1. حدد العوامل الوراثية ذات الأهمية التي تحتوي على orthologs من DVU3023. الحصول على ملفات تسلسل والشرح عن الجينوم من موقع NCBI.
  2. استخدام لغة برمجة مثل بيرل لكتابة البرامج النصية التي سوف تستخدم تسلسل عزر من الأهداف DAP رقاقة لبناء نقاط البيعition مصفوفة المرجح واستخدام مصفوفة ليسجل زخارف مماثلة موجودة في الجينوم التسلسل الأخرى.

النتائج

تم تطبيق الأسلوب أعلاه لتحديد الأهداف الجين العالمية من الممثلين الإقليميين في الحد من كبريتات نموذج بكتيريا منتزعة الكبريت الشائع Hildenborough 7. هذا الكائن لديها عدد كبير من TCSs يمثلها أكثر من 70 سجلات المورد، مما يدل على تشكيلة واسعة من إشارات الممكن أنه يستشع...

Discussion

تم استخدام أسلوب DAP رقاقة الموصوفة هنا بنجاح لتحديد الأهداف الجين لعدة سجلات المورد في منتزعة الكبريت الشائع Hildenborough 7 من الذي يظهر واحد هنا نتيجة ممثل. لRR DVU3023، واختيار الهدف الجين مرشح كان مباشرة. يقع DVU3025 المصب على الفور من الجين RR، ويتم حفظها لوائح الرادي...

Disclosures

والكتاب ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها.

Acknowledgements

نشكر ايمي تشن لمساعدتها في التحضير لتصوير الفيديو ولإظهار هذه التقنية. هذا العمل الذي قامت به ENIGMA: النظم البيئية والشبكات المتكاملة مع الجينات الجزيئية وجمعيات (http://enigma.lbl.gov)، وهو برنامج مجال التركيز العلمي في مختبر لورنس بيركلي الوطني، وبدعم من مكتب العلوم ومكتب البيولوجية و البحوث البيئية، من وزارة الطاقة في الولايات المتحدة بموجب العقد رقم DE-AC02-05CH11231.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Name of Material/EquipmentCompanyCatalog numberComments
HisTrapFF column (Ni-Sepharose column)GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA17-5255-01
Akta explorer (FPLC instrument)GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA
HiPrep 26/10 Desalting columnGE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA17-5087-01
Qiaquick Gel extraction kitQiagen Inc, Valencia, CA, USA28704
Biotin-labeled oligonucleotidesIntegrated DNA TechnologiesN/A
6% polyacrylamide-0.5X TBE precast mini DNA retardation gelLife Technologies, Grand Island, NY, USAEC63652BOXAlternately, you can pour your own gel.
Nylon membraneEMD Millipore, Billerica, MA, USAINYC00010
Trans-Blot SD Semi-dry electrophoretic transfer cellBiorad, Hercules, CA, USA170-3940
Extra thick blot paper, 8 x 13.5 cmBiorad, Hercules, CA, USA170-3967
UV crosslinker Model XL-1000Fisher Scientific11-992-89
Nucleic Acid chemiluminescent detection kit (Pierce)Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA89880
Ni-NTA agarose resinQiagen Inc, Valencia, CA, USA30210
GenomePlex Whole genome amplification kit (Fragmentation buffer, library preparation buffer, library stabilization solution, library preparation enzyme, 10X amplification master mix, WGA polymerase )Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAWGA2-50RXN
Nanodrop ND-1000Thermo Scientific, Wilmington, DE, USAFor quantitation of DNA
Perfecta Sybr Green SuperMix, with ROXQuanta biosciences95055-500Any Sybr Green PCR mix may be used
PlateMax Ultra clear heat sealing film for qPCRAxygen
96 well clear low profile PCR microplateLife Technologies, Grand Island, NY, USAPCR-96-LP-AB-C
Applied Biosystems StepOne Plus Real time PCR systemLife Technologies, Grand Island, NY, USA4376600Any real time PCR system may be used
Qiaquick PCR purification kitQiagen Inc, Valencia, CA, USA28104Any PCR clean up kit may be used
Cy3/Cy5-labeled nonamersTrilink biotechnologies, San Diego, CA, USAN46-0001, N46-0002
Klenow polymerase 50,000U/ml, 3'-5' exo-New England Biolabs, Ipswich, MAM0212M
Hybridization systemRoche-Nimblegen, Madison, WI, USAN/AThis company no longer makes arrays or related items, so alternate sources such as Agilent or Affymetrix will need to be used,
Custom printed microarrays and mixersRoche-Nimblegen, Madison, WI, USAN/A
Hybridization kit (2X Hybridization buffer, Hybridization component A, Alignment oligo)Roche-Nimblegen, Madison, WI, USAN/A
Wash buffer kit (10X Wash buffer I, II, III, 1 M DTT)Roche-Nimblegen, Madison, WI, USAN/A
GenePix 4200A microarray scannerMolecular Devices, Sunnyvale CA, USAThis model has been replaced by superior ones
GenePix Pro microarray softwareMolecular Devices, Sunnyvale CA, USA
Nimblescan v.2.4, ChIP-chip analysis softwareRoche-Nimblegen, Madison, WI, USAN/A

References

  1. Galperin, M. Y. Diversity of structure and function of response regulator output domains. Curr Opin Microbiol. 13, 150-159 (2010).
  2. Casino, P., Rubio, V., Marina, A. The mechanism of signal transduction by two-component systems. Curr Opin Struct Biol. 20, 763-771 (2010).
  3. Aparicio, O., Geisberg, J. V., Struhl, K. Chromatin immunoprecipitation for determining the association of proteins with specific genomic sequences in vivo. Curr Protoc Cell Biol. 17 (17), (2004).
  4. McCleary, W. R., Stock, J. B. Acetyl phosphate and the activation of two-component response regulators. J Biol Chem. 269, 31567-31572 (1994).
  5. Novichkov, P. S., et al. RegPrecise web services interface: programmatic access to the transcriptional regulatory interactions in bacteria reconstructed by comparative genomics. Nucleic Acids Res. 40, 604-608 (2012).
  6. Studholme, D. J., Buck, M., Nixon, T. Identification of potential sigma(N)-dependent promoters in bacterial genomes. Microbiology. 146 (12), 3021-3023 (2000).
  7. Rajeev, L., et al. Systematic mapping of two component response regulators to gene targets in a model sulfate reducing bacterium. Genome Biol. 12, 99 (2011).
  8. Crooks, G. E., Hon, G., Chandonia, J. M., Brenner, S. E. WebLogo: a sequence logo generator. Genome Res. 14, 1188-1190 (2004).
  9. Barbieri, C. M., Mack, T. R., Robinson, V. L., Miller, M. T., Stock, A. M. Regulation of response regulator autophosphorylation through interdomain contacts. J Biol Chem. 285, 32325-32335 (2010).
  10. Bourret, R. B. Receiver domain structure and function in response regulator proteins. Curr Opin Microbiol. 13, 142-149 (2010).
  11. Gao, R., Stock, A. M. Molecular strategies for phosphorylation-mediated regulation of response regulator activity. Curr Opin Microbiol. 13, 160-167 (2010).
  12. Hung, D. C., et al. Oligomerization of the response regulator ComE from Streptococcus mutans is affected by phosphorylation. J Bacteriol. 194, 1127-1135 (2012).
  13. Ladds, J. C., et al. The response regulator Spo0A from Bacillus subtilis is efficiently phosphorylated in Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett. 223, 153-157 (2003).
  14. Wen, Y., Feng, J., Scott, D. R., Marcus, E. A., Sachs, G. Involvement of the HP0165-HP0166 two-component system in expression of some acidic-pH-upregulated genes of Helicobacter pylori. J Bacteriol. 188, 1750-1761 (2006).
  15. Liu, X., Noll, D. M., Lieb, J. D., Clarke, N. D. DIP-chip: rapid and accurate determination of DNA-binding specificity. Genome Res. 15, 421-427 (2005).
  16. Gossett, A. J., Lieb, J. D. DNA Immunoprecipitation (DIP) for the Determination of DNA-Binding Specificity. CSH Protoc. 2008, (2008).
  17. Mascher, T., et al. The Streptococcus pneumoniae cia regulon: CiaR target sites and transcription profile analysis. J Bacteriol. 185, 60-70 (2003).
  18. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).
  19. Lefrancois, P., Zheng, W., Snyder, M. ChIP-Seq using high-throughput DNA sequencing for genome-wide identification of transcription factor binding sites. Methods Enzymol. 470, 77-104 (2010).
  20. Ho, J. W., et al. ChIP-chip versus ChIP-seq: lessons for experimental design and data analysis. BMC Genomics. 12, 134 (2011).
  21. Liu, X., Lee, C. K., Granek, J. A., Clarke, N. D., Lieb, J. D. Whole-genome comparison of Leu3 binding in vitro and in vivo reveals the importance of nucleosome occupancy in target site selection. Genome Res. 16, 1517-1528 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

89

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved