ДНК-аффинно очищенного Чип (DAP-чип) Метод определения целей гена для бактериальных двухкомпонентный регуляторных систем

Резюме

Это видео статье описывается микрочипов на основе метода в пробирке для определения целевых генов и сайты связывания для двухкомпонентных регуляторов срабатывания системы.

Аннотация

В методах естественных условиях, таких как чип-чип являются хорошо зарекомендовавшие себя методы, используемые для определения глобальных целей гена для транскрипционных факторов. Тем не менее, они имеют ограниченное применение в изучении бактериальных двухкомпонентных систем регулирования с неохарактеризованных условиях активации. Такие системы регулировать транскрипцию только при активации в присутствии уникальных сигналов. Так как эти сигналы часто неизвестно, пробирке микрочипов на основе метода в описано в этой статье видео может быть использован для определения генов цели и сайты связывания для регуляторов реагирования. Этот метод ДНК-аффинно очищенного-чип может быть использован для любого очищенного регулятора в любом организме с виртуализированного генома. Протокол включает позволяя очищают отмеченных белка для связывания с стриженой геномной ДНК, а затем очистки сродство ДНК связанной с белком, а затем флуоресцентного мечения ДНК и гибридизации в массив пользовательских плитки. Предыдущие шаги, которые могут быть использованы для оптимизации анализа для спецификациирегуляторы грн, также описаны. Пики, полученные в результате анализа данных массива используются для прогнозирования обязательные мотивы сайта, которые затем экспериментально проверенные. Предсказания мотив может быть дополнительно использован для определения генов целей ортологичных регуляторов реагирования в близкородственных видов. Мы продемонстрировать применимость этого метода путем определения генов цели и связывающие мотивы сайта и таким образом предсказывать функцию для sigma54 зависит от регулятора ответ DVU3023 в экологической бактерии Desulfovibrio обыкновенная Hildenborough.

Введение

Способность бактерий, чтобы выжить и процветать в решающей степени зависит от того, как хорошо они способны воспринимать и отвечать возмущений в их среде, а это, в свою очередь, зависит от их систем передачи сигнала. Количество сигнальных систем бактерия кодирует вектор был назван его "микробная IQ" и может быть признаком как изменчивости его среды и ее способность чувствовать несколько сигналов и тонкой настройки его отклика ^1. Два компонента системы передачи сигнала (TCS) являются наиболее распространенными системами сигнализации, используемые бактериями, и они состоят из гистидинкиназа (HK), что воспринимает внешний сигнал и передает через фосфорилирования к регулятору отклика эффектор (RR) ^2. ОР могут иметь различные выходных доменов и, следовательно, различные режимы эффекторные, но наиболее распространенным ответом является регуляция транскрипции с помощью ДНК-связывающего домена ^1. Сигналы зондирования и соответствующие функции протокат Большинство ТТС остаются неизвестными.

Хотя естественных условиях методы в таких, как чип-чип обычно используются для определения геномных сайтов связывания транскрипционных факторов ^3, они могут быть использованы только для бактериальных RR, двухкомпонентная система, если условия активирующие или сигналы известны. Часто экологические сигналы, которые активируют TCS труднее определить, чем их генов мишеней. Пробирке микрочипов в основе анализа, описанного здесь, могут использоваться для эффективного и быстрого определения генов цели и прогнозировать функции ТТС. Этот анализ имеет преимущество в том, что РП может быть фосфорилирован и, таким образом активированного в пробирке с использованием малых молекул доноров, таких как ацетил фосфата ^4.

В этом методе, названный DAP-чип для ДНК-аффинной очистке чипа (рис. 1), ген RR интересующий клонированный с His-меткой в Е. палочка, и отмеченных белок очищен разрешается биго по стриженой геномной ДНК. ДНК белком затем обогащается аффинной очистки, обогащенный и вход ДНК усиливаются, флуоресцентно меченных, объединяли и гибридизации с массивом плитки, которая на заказ для организма интереса (рис. 1). Microarray эксперименты подлежат артефактов и, следовательно, дополнительные шаги используются для оптимизации анализа. Одним из таких шагов является попытка определить одну цель для РР изучается с помощью электрофореза сдвига мобильность анализов (EMSA) (см. рабочий процесс на рисунке 2). Затем, после связывания с геномной ДНК и DAP шагов, ДНК белком и вход рассматриваются кПЦР чтобы увидеть, если положительный целевой обогащается во фракции белком относительно входного фракции, подтвердив тем самым оптимальное обязательные условия для RR (рис. 2). После массива гибридизации, данные анализируются, чтобы найти пиков высокой интенсивности сигнала, указывающие геномной локусов, где белок чобъявление связаны. Функции могут быть предсказаны на основе РР целевых генов, полученных. Целевые геномные локусы используются для прогнозирования обязательные мотивы сайта, которые затем экспериментально проверены с использованием EMSAs (рис. 2). Функциональные прогнозы и генные мишени для РР может быть продлен до близкородственных видов, которые кодируют ортологичные RRs путем сканирования эти геномы для аналогичных обязательных мотивов (рис. 2). Метод доступа DAP-чип может обеспечить большой объем информации для TCS, где ранее не было ни одного. Способ также может быть использован для любого транскрипционного регулятора, если белок может быть очищен и условиях связывания ДНК может быть определена, и для любого интересующего организма с последовательностью генома доступны.

Рисунок 1. ДНК-аффинно очищенного-чип (DAP-чип) Стратегия ^7. Ген RR от интересующего организма, клонируют с карбокси-концевой His-меткой в Е. Штамм выражение. Очищенный белок His-меченого активируется путем фосфорилирования с ацетил фосфата и смешивают с обрезной геномной ДНК. Аликвоту реакции связывания сохраняется в качестве входного ДНК, а остальные подвергают аффинной очистки с использованием Ni-NTA смолы. Входной и RR-связаны ДНК амплифицируют весь геном, и помечены с Cy3 и Cy5, соответственно. Меченый ДНК объединяли и гибридизовали в массив плитки, которую затем анализируют для определения генов мишеней. Рисунок изменен и перепечатана с помощью творческую лицензию общин от ^7.

Рисунок 2. Резюме процесса. Для любого очищенного меченого Proteiп, начать с определения цели использования Emsa. Разрешить белок связывать геномной ДНК, а затем ДНК-сродства-Purify (DAP) и весь геном усиления (WGA) обогатили и вход ДНК. Если ген-мишень, как известно, использовать КПЦР чтобы гарантировать, что известно целевой обогащен фракции белком. Если цель не могла быть определена, перейдем непосредственно к маркировке ДНК и массива гибридизации. Если обогащение кПЦР не могло быть обнаружено, а затем повторите белок-гДНК связывания и DAP-WGA шаги, используя различные количества белка. Используйте анализ массива найти пики и сопоставить их с генов-мишеней. Используйте вверх по течению регионы генов-мишеней для прогнозирования обязательные мотивы сайта. Подтвердить мотивы экспериментально с помощью EMSAs. Используйте мотив для сканирования геномы родственных видов, кодирующих Ортологи РР в стадии изучения, и предсказать гены целевых в тех видах, а также. На основе целей гена, полученных, физиологическая функция РР и его ортологов может быть предсказано. Рисунок изменен и перепечатана с помощью творческого грommons лицензировать с ^7.

протокол

Примечание: Протокол ниже предназначена для определения генов мишеней РР DVU3023 от бактерии Desulfovibrio обыкновенная Hildenborough. Это могут быть адаптированы к любой другой транскрипционного регулятора интереса.

1. Клон и очистить рублей

1. Клонировать ген RR, в частности DVU3023, от D. угри Hildenborough в палочки Escherichia экспрессирующий вектор таким образом, что ген C-терминально His-меткой и выражение под контролем промотора Т7.
   Примечание: Несколько методов клонирования могут быть использованы и определяется исследователем. Также могут быть использованы альтернативные метки сродства.
2. Transform выражение построить в E. палочка BL21 (DE3) выражение штамм.
3. Расти 1 л штамма экспрессии BL21 при 37 ° С В середины логарифмической фазы, добавляют IPTG до 0,5 мм для индуцирования экспрессии белка. Продолжить рост при комнатной температуре в течение 24 часов.
4. Центрифуга клетки при 5000 мкг в течение 10 мин при 4 ° С. Ресуспендируют клеток в буфере для лизиса (20 мМ фосфат натрия, рН 7,4, 500 мМ NaCl, 40 мМ имидазола, 1 мг / мл лизоцима, 1x Benzonase нуклеазы). Клетки лизируют с использованием французского пресса при 4 ° С.
5. Центрифуга лизат при 15000 х г в течение 30 мин при 4 ° С. Фильтр с использованием шприцевой фильтр 0,45 мкм.
6. Промыть 1 мл колонку Sepharose Ni на FPLC инструмента с использованием 10 мл промывочного буфера (фосфат 20 мМ натрий, рН 7,4, 500 мМ NaCl, 40 мМ имидазол).
7. Загрузите лизат на колонке. Промыть колонку с 20 мл промывочного буфера.
8. Элюировать DVU3023 с использованием градиента 0-100% элюирующего буфера (20 мМ фосфат натрия, рН 7,4, 500 мМ NaCl, 500 мМ имидазол).
9. Загрузить элюированных фракций на колонке обессоливания и промывают обессоливающей буфера (20 мМ фосфат натрия, рН 7,4, 100 мМ NaCl).
10. Центрифуга образец белка в высокой молекулярной массой среза фильтра центрифуги к концентрации белка. Добавить DTT до 0,1 мм и глицерина до 50% белка и хранить при -20 ° С.
    Примечание: методы очистки должны быть оптимизированы индивидуально для каждого белка на стадии изучения.

2. Определите гена-мишени для RR Использование электрофоретической подвижности Shift, анализ (EMSA)

1. ПЦР-амплификации 400 п.н. области выше гена-мишени кандидат DVU3025, используя D. угри Hildenborough геномной ДНК в качестве матрицы и вперед немеченого праймера и обратного 5'-биотин-меченый праймер.
   Примечание: Советы для выбора целевой ген-кандидат: Часто ОР связывать вверх по течению регионы собственной гена / оперона, или они могут регулировать проксимально закодированные гены. Если RR имеет ортологи в других видах, искать генов, которые сохраняются в районе. Альтернативные методы включают выбор генов-кандидатов на основе регулона предсказаний (например, RegPrecise ^5), или прогнозирования sigma54 зависит от промоутеров ⁶ для RR, которые сами sigma54-зависимыми.
2. Запуск ПЦР-продукта на 1% агарозном геле, вырезали 400 бр размера продукта и очистить ДНК с помощью экстракции геля очистить комплект.
3. Смешайте DVU3023 белок (0,5 пмоль) с 100 фмоль биотинилированного субстрата ДНК в 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 50 мМ KCl, 5 мМ MgCl _2, 1 мМ DTT, 25% глицерина и 1 мкг / мл поли dI.dC (не конкретной ДНК конкурента) в общем объеме 20 мкл. Также создана реакции без белка в качестве контроля. Инкубируйте реакции при комнатной температуре на скамейке в течение 20 мин.
4. Примечание: Это стандартные условия, перечисленные и другие компоненты реакции могут быть добавлены в зависимости от RR интересов. Если активация желательно добавить 50 мМ ацетил фосфата в реакции (ОР часто связывается ДНК в пробирке без активации).
5. Предварительно запустить сборного мини 6% полиакриламидном-0.5x TBE гель в 0,5 х КЭ буфера при 100 V в течение 30 мин. Добавьте 5 мкл 5x загрузки буфера (0,1% бромфеноловый синий, 0,1% ксилолцианола, 30% глицерина в 1x КЭ) в реакциях связывания и нагрузки 18 мкл реакции на в гэль. Запуск при 100 V в течение 2 часов.
   Примечание: Во избежание перегрева, что может привести к диссоциации комплексов белок-ДНК, заполнить внешнюю буферную камеру в системе электрофореза с рабочим буфером таким образом, что большинство из геля изолирован буфера. С другой стороны, гель может быть запущен при 4 ° С.
6. Cut заряженную нейлоновую мембрану с размером геля и замочить в 0,5 × ТВЕ по крайней мере десять минут. Снимите гель из кассеты. Вырезать любые хребты от геля и сэндвич гель и мембрану между двумя толстыми фильтровальной бумаги, пропитанные 0,5 х КЭ, и разместить в полусухого блоттинга аппарата и работать на 20 В в течение 30 мин.
7. Поместите мембрану внутри коммерческой ультрафиолетовый свет сшивателя инструмента и установите время до 3 мин.
   Примечание: Мембрана может теперь быть сохранены сухой при комнатной температуре в течение нескольких дней, прежде чем перейти к следующему шагу.
8. Используйте имеющийся в продаже хемилюминесцентную набора определения, который использует стрептавидин-хрен peroxidaсебе сопряжены развивать кляксу в соответствии с инструкциями изготовителя.
9. Изображение пятном с помощью компьютера подключены к CCD оборудован камерой и искать сдвига в мобильности подложки ДНК в присутствии РР, который указывает, что RR связывает ДНК проходит испытания.
   Примечание: Специфичность сдвига белок-ДНК может быть проверена в том числе в реакции избыток немеченого конкурента ДНК, которое должно устранить или уменьшить сдвиг видел.

3. Убедитесь, Target обогащение после геномную ДНК-связывания с белками

1. Геномная ДНК-белок Реакцию связывания
   1. Shear геномной ДНК со средним размером 500 п.н. обработкой ультразвуком 100 мкл геномной ДНК (при концентрации 100-200 нг / мкл) в 1,5 мл пробирке с использованием микронаконечник с 9 низких импульсов амплитудой до 1 сек, 2 сек с зазором между ними каждый.
      Примечание: Если брызги ДНК к сторонам трубки, спин вниз содержимое после каждых 3 импульсов. Точные условия, используемыеварьирует в зависимости от используемого инструмента обработки ультразвуком. В сдвиговых фрагменты ДНК может находиться в диапазоне от 100-1000 п.о., но средний размер должен быть в пределах 400-600 п.н.. Слишком много сдвига может привести к уменьшению числа неповрежденных участков связывания, и либо слишком много или слишком мало сдвига повлияет библиотеки подготовку в течение последующих целых шагов геном усиления.
   2. Смешайте 2-3 мкг геномной ДНК обрезной с RR белка (0,5 пмоль DVU3023) в 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 1 мМ DTT, 50 мМ KCl, 5 мМ MgCl _2, 25% глицерина, и 50 мМ ацетил фосфата. Инкубируйте реакции при 25 ° С в течение 30 мин. Передача 10 мкл этой реакции на 1,5 мл трубки и этикетки в качестве входных данных ДНК.
      Примечание: ацетил фосфат добавляется для активации фосфорилированием белка в пробирке. Фосфорилирование стимулирует ДНК-связывающие, но многие ОР также связывать ДНК в пробирке без активации ^7. Количество белка добавляют к реакционной смеси, будет зависеть от активности белка преп. EMSA могут быть использованы, чтобы выбратьimize эту сумму.
2. Affinity очистить ДНК связанной с белком
   1. Добавить 30 мкл Ni-NTA агарозы смолы в 0,6 мл пробирке. Центрифуга при 100 х г в течение 1 мин, чтобы собрать смолу на дне, и удалить супернатант. Добавить 100 мкл промывочного буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 5 мМ MgCl _2, 50 мМ KCl, 25% глицерина), фильм трубка смешивать и центрифуги при 100 мкг в течение 2 мин. Удалить супернатант.
   2. Добавить остальные 90 мкл реакции связывания с промытой Ni-NTA смолы и инкубировать в ротационном шейкере в течение 30 мин.
   3. Центрифуга при 100 мкг в течение 2 мин, и удалите супернатант (несвязанный ДНК). Добавить 100 мкл промывочного буфера, Флик трубку смешать содержимое, и центрифуге при 100 мкг в течение 2 мин. Удалить супернатант. Повторите стадии промывки в два раза больше.
   4. Добавить 35 мкл элюирующего буфера (фосфат 20 мМ натрий-буфера, рН 8, 500 мМ NaCl, 500 мМ имидазол) к смоле и перемешать на вортексе. Выдержите на скамейке при комнатной температуре в течение 5 мин. Центрифуга при 100 мкг в течение 2 мин. Передача супернатант в новую пробирку 1,5 мл и этикетки в виде фракции ДНК с белком.
   5. Кроме того, добавить 35 мкл элюирующего буфера с входным ДНК.
   6. Очищают вход и белковые фракции, связанного ДНК с использованием набора для очистки ПЦР.
3. Всего геном усилить вход и образцы ДНК белок граница.
   1. Добавить 10 мкл входе и белком ДНК, чтобы отделить ПЦР пробирки. Добавить 1 мкл 10x фрагментации буфера, 2 мкл Подготовка Библиотека буфера и 1 мкл Библиотека стабилизации решения каждого образца. Хорошо перемешать встряхиванием. Тепло в амплификаторе при 95 ° С в течение 2 мин, и охладить на льду.
      Примечание: исходное количество ДНК должна быть не менее 10 нг того, чтобы избежать введения смещения усиления.
   2. Добавить 1 мкл библиотеки ферментный препарат, перемешать с помощью пипетки, и инкубировать в термоциклер при 16 ° С/20 мин, 24 ° C/20 мин, 37 ° C в течение 20 мин, 75 ° C / 5 мин, И удерживайте при 4 ° С.
   3. В каждую пробирку добавляют 47,5 мкл воды, 7,5 мкл 10х амплификации мастер-смеси и 5 мкл полимеразы. Хорошо перемешать и тепла при температуре 95 ° C / 3 мин, а затем 20 циклов при 94 ° С/15 сек, 65 ° C / 5 мин. Держите реакции при 4 ° С.
   4. Очищают усиленные образцы ДНК с использованием набора для очистки ПЦР и измерить концентрацию ДНК спектрофотометрически.
4. Проверьте целевой обогащение в ДНК с белком с использованием КПЦР
   1. Дизайн КПЦР праймеров для амплификации 200 б.п. выше по потоку области EMSA-проверено гена-мишени (DVU3025), используя любой свободно распространяемый разработки программного обеспечения праймера.
   2. Настройка трех экземплярах КПЦР реакции для каждого шаблона ДНК с каждым набором праймеров. Подготовьте основной смеси для каждого набора праймеров. 1x мастер смесь содержит 10 мкл 2x Sybr Зеленый КПЦР смеси, 0,5 мкМ каждого праймера и воды в общей сложности 18 мкл. Алиготе 18 мкл мастер-микс на лунку в 96-луночный ПЦР планшет.
   3. Разбавлятьэ усиленный и очищенный вход и образцы ДНК белок связан с 5 нг / мкл водой и использовать в качестве ДНК-матрицы. Добавить 2 мкл ДНК-матрицы в лунки.
   4. Уплотнение тарелку с ультра ясной КПЦР уплотнительной пленкой, спин вниз пластину в центрифуге при 200g / 1 мин. Поместите пластинку в реальном времени КПЦР машины. Цикл следующим помощью связанных с ними КПЦР ПО: 95 ° C / 1 мин и 40 циклов 95 ° C/10 сек, 59 ° С/15 сек и 70 ° С/35 сек.
   5. Также настроен трех экземплярах реакции КПЦР с праймеров для амплификации вверх по течению регионы неродственного гена (отрицательный контроль).
   6. Рассчитать ΔC _Т путем вычитания значения C _т с белком ДНК, что входного ДНК. Рассчитать раза обогащение гена-мишени в ДНК с белком, как 2 ^ΔC _T.
      Примечание: Если на входе область цель была обогащена в ДНК с белком против входного ДНК, это означает, что связывание реакции и аффинной очистки были Successful. Перейдите к шагу 4. Если обогащение восходящем районе целевой не наблюдалось, повторите обязательные реакции (шаг 3.1) с различным количеством белка.

4. Маркировка ДНК и Массив Гибридизация

1. Этикетка Входной ДНК с Cy3 и обогащенного ДНК с Cy5
   ПРИМЕЧАНИЕ: Cy3 и Cy5 красители чувствительны к свету и следует позаботиться, чтобы сохранить освещенность до минимума.
   1. Смешайте 1 мкг ДНК с 40 мкл Cy3/Cy5-labeled 9-меры и регулировать громкость до 80 мкл водой.
   2. Тепло денатурация при 98 ° С в течение 10 мин в темноте (в амплификатор). Быстрый холод на льду в течение 2 мин.
   3. Добавить 2 мкл полимеразы Кленова (3'-5'-экзо ^-, 50000 ед / мл), 5 мМ дНТФ и 8 мкл воды для каждой реакции, хорошо перемешать и инкубировать при 37 ° С в течение 2 ч в темноте (в термоциклер).
   4. Добавить ЭДТА до 50 мМ, чтобы остановить реакцию и раствор NaCl до 0,5 М
   5. Образцы передачи до 1,5 мл пробирок CONTAining 0,9 объема изопропанола, инкубировать в темноте в течение 10 мин и центрифугируют при 12000 х г в течение 10 мин. Осадок должен быть розовый для Су3-меченого ДНК и синего для Су5-меченой ДНК.
   6. Промыть гранулу с 80%-ным этанолом (500 мкл) и центрифуге при 12000 х г в течение 2 мин. Воздушно-сухих гранул в течение 5-10 мин в темноте.
      Примечание: Гранулы можно хранить при -20 ° С.
   7. Ресуспендируют гранул в 25 мкл воды. Измерьте концентрацию ДНК спектрофотометрически.
   8. Бассейн вместе 6 мкг каждого из Cy-3 и Cy5-меченого ДНК в 1,5 мл трубки и сушат в вакууме с в центрифуге на медленном огне в темноте (покрытие крышки центрифуги, если она прозрачна).
      Примечание: Гранулы можно хранить при температуре от -20 ° С до готовности для гибридизации.
2. Микрочипов Гибридизация
   1. Включите систему гибридизации на 3-4 ч до использования и установить температуру до 42 ° C.
   2. Подготовьте гибридизации решение основной смеси такие, что решение 1x содержит 11,8 мкл 2x Hybridiзация буфера, 4,7 мкл Гибридизация Компонент А и 0,5 мкл выравнивание олиго.
   3. Ресуспендируют гранул в 5 мкл воды. Добавить 13 мкл этой смеси в образце. Vortex в течение 15 сек, инкубации при 95 ° С в сухом бане в течение 5 мин. Хранить образцы при 42 ° С в гибридизации системы до готовности к загрузке.
   4. Подготовьте микрочипов слайд-смесительной, в соответствии с протоколом производителя.
   5. Поместите смеситель-слайд-сборку в системе гибридизации. Нагрузка 16 мкл образца в заливное отверстие, герметизации порта с клейкой пленкой, повернуть на смешивание в системе, и гибридизуются в течение 16-20 ч при 42 ° С.
   6. Приготовьте 1х стирки буферы I (250 мл), II (50 мл) и III (50 мл) при разбавлении 10-кратного коммерчески доступные буферы в воде, и в каждый добавить DTT до 1 мм. Теплый буфера я до 42 ° С.
   7. Наденьте смеситель-слайд в разборки инструмента, и место внутри блюдо с теплым буфера I. Peel смеситель с, в то время активно шAking разборки инструмент вручную.
   8. Поместите слайд в контейнер с 50 мл промывочного буфера I и энергично встряхивают в течение 2 мин вручную.
   9. Передача слайд во вторую емкость с 50 мл промывочного буфера II и энергично встряхивают в течение 1 мин вручную.
   10. Передача слайд в третьем контейнере с 50 мл промывочного буфера III, и энергично встряхивают в течение 15 сек вручную.
   11. Быстро промокните края слайда на бумажное полотенце, и поместите в режиме слайд-стойку. Центрифуга при 200 мкг в течение 2 мин, чтобы высушить слайд. Поместите в случае слайд, оберните его фольгой, и хранить в эксикаторе.
3. Сканирование массива
   1. Поместите слайд в микрочипов сканера в соответствии с инструкциями инструмента.
   2. Используйте программное обеспечение сканера для установки длины волны, как 532 нм = Су3 и 635 нм = Cy5, а начальные успехи ФЭУ между 350 и 400.
   3. Предварительный просмотр слайд, чтобы найти массив на слайде. Выберите регион массива для сканирования.
   4. Сканирование массив и настроить параметры ФЭУ, так что особенности массива в основном желтого цвета. Гистограмма должна показать красные и зеленые кривые накладываются или как можно ближе друг к другу, насколько это возможно. Кривые должны закончить выше 10 ^-5 нормированных пунктам в насыщения.
   5. Сохраните оба 532 и 635 нм изображения отдельно.
4. Массив Анализ данных
   1. Импорт изображений в программное обеспечение для анализа массива. Использование программного обеспечения, создать два отчета пара (. Пара) для каждого массива (для Cy3 и Cy5 изображений). Создание масштабных журнал _{2 Отношение} файлы, используя парные файлы. Использование войти _{2 Отношение} файлов для поиска пиков с использованием скользящее окно 500 п.н.. Карта пиковую локусы в верховьях регионах генов мишеней.
   2. Убедитесь, что положительный цель (определяется с помощью EMSA и подтверждено кПЦР, DVU3025 в этом примере) появляется в лучших пиков.
      Примечание: Если положительная цель не среди лучших хитов, вполне возможно, что RR под Consiотменять имеет несколько целей генов и репликации DAP-чипы могут быть проведены и пики, общие для всех повторов может быть использован, чтобы генерировать целевой список.

5. Связывание сайта Мотив Прогнозирование и проверка

1. Получить последовательности для добывающих регионах (400 б.п.) для лучших целей генных как порожденная анализа DAP-чипов. Применить мем на этих последовательностей через Микробы онлайн (meme.nbcr.net) предсказать мотивы.
   Примечание: Enhancer связывающие белки, такие как sigma54-зависимых регуляторов могут связываться несколько сотен пар оснований выше начальной сайте. Для других транскрипционных регуляторов, короче область, такие как 200 п.н. выше будет достаточно.
2. Дизайн верхней и нижней ветви олигомеры ДНК, которые содержат предсказанный сайт связывания мотив в окружении 10 оснований на обоих концах. Заказать верхнюю прядь 5 'биотинилированного.
3. Смешайте верхнюю и нижнюю нити в олигонуклеотидов 1:1,5 соотношении в 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА и 50 мМ NaCl вОбщий объем реакционной смеси 20 мкл в ПЦР пробирок. Нагревают до 95 ° С в течение 5 мин в термоциклере, с последующим медленным охлаждением до 25 ° С. Развести в десять раз и использовать в качестве дикого типа двухцепочечной ДНК субстрата для EMSA.
4. Подготовка модифицированные субстраты, используя те же шаги, что и выше, но дизайн олигомеры нести 4-6 замен в консервативных основ обязательного мотив.
5. Настройка реакции связывания с РР и дикого типа или модифицированных субстратов и изучить с помощью EMSA, как описано в шаге 2.
6. Примечание: предсказал мотив проверяется если бы курс рубля связывает дикого типа подложки, но не изменение одного.

6. Сохранение Motif в других связанных с ними видов бактерий

1. Выберите геномы интерес, содержащие Ортологи DVU3023. Получить последовательность и аннотации файлов для геномов с сайта NCBI.
2. Используйте язык программирования, таких как Perl для написания сценариев, которые будут использовать мотив последовательности из целей DAP-чип построить позition взвешенная матрица и использовать матрицу забить подобные мотивы, присутствующие в других секвенированных геномов.

Результаты

Данный метод был применен для определения глобальных генных целей РРП в модельном сульфатвосстанавливающими бактерию Desulfovibrio обыкновенная Hildenborough ^7. Этот организм имеет большое количество ТТС, представленную более чем 70 RR, с указанием широкий спектр возможных сигналов, что ...

Обсуждение

Метод доступа DAP-чип описано здесь был успешно использован для определения генов цели в течение нескольких записей ресурсов в Desulfovibrio обыкновенная Hildenborough ^7, один из которых показан здесь как представитель результате. Для RR DVU3023, выбирая цель гена-кандидата был прямым. DVU3025 рас...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/Equipment	Company	Catalog number	Comments
HisTrapFF column (Ni-Sepharose column)	GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA	17-5255-01
Akta explorer (FPLC instrument)	GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA
HiPrep 26/10 Desalting column	GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA	17-5087-01
Qiaquick Gel extraction kit	Qiagen Inc, Valencia, CA, USA	28704
Biotin-labeled oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	N/A
6% polyacrylamide-0.5X TBE precast mini DNA retardation gel	Life Technologies, Grand Island, NY, USA	EC63652BOX	Alternately, you can pour your own gel.
Nylon membrane	EMD Millipore, Billerica, MA, USA	INYC00010
Trans-Blot SD Semi-dry electrophoretic transfer cell	Biorad, Hercules, CA, USA	170-3940
Extra thick blot paper, 8 x 13.5 cm	Biorad, Hercules, CA, USA	170-3967
UV crosslinker Model XL-1000	Fisher Scientific	11-992-89
Nucleic Acid chemiluminescent detection kit (Pierce)	Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA	89880
Ni-NTA agarose resin	Qiagen Inc, Valencia, CA, USA	30210
GenomePlex Whole genome amplification kit (Fragmentation buffer, library preparation buffer, library stabilization solution, library preparation enzyme, 10X amplification master mix, WGA polymerase )	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	WGA2-50RXN
Nanodrop ND-1000	Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA		For quantitation of DNA
Perfecta Sybr Green SuperMix, with ROX	Quanta biosciences	95055-500	Any Sybr Green PCR mix may be used
PlateMax Ultra clear heat sealing film for qPCR	Axygen
96 well clear low profile PCR microplate	Life Technologies, Grand Island, NY, USA	PCR-96-LP-AB-C
Applied Biosystems StepOne Plus Real time PCR system	Life Technologies, Grand Island, NY, USA	4376600	Any real time PCR system may be used
Qiaquick PCR purification kit	Qiagen Inc, Valencia, CA, USA	28104	Any PCR clean up kit may be used
Cy3/Cy5-labeled nonamers	Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USA	N46-0001, N46-0002
Klenow polymerase 50,000U/ml, 3'-5' exo-	New England Biolabs, Ipswich, MA	M0212M
Hybridization system	Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA	N/A	This company no longer makes arrays or related items, so alternate sources such as Agilent or Affymetrix will need to be used,
Custom printed microarrays and mixers	Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA	N/A
Hybridization kit (2X Hybridization buffer, Hybridization component A, Alignment oligo)	Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA	N/A
Wash buffer kit (10X Wash buffer I, II, III, 1 M DTT)	Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA	N/A
GenePix 4200A microarray scanner	Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA		This model has been replaced by superior ones
GenePix Pro microarray software	Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA
Nimblescan v.2.4, ChIP-chip analysis software	Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA	N/A