التصوير في الوقت الحقيقي من غشائي المفارق خلايا العدلات خلية أثناء التهجير تحت الفسيولوجية تدفق

Summary

الكريات البيض تعبر أحادي الطبقة البطانية باستخدام paracellular أو الطريق العابر للخلايا. وضعنا مقايسة بسيطة لمتابعة توزيع موصلي الذاتية VE كادهيرين وPECAM-1 خلال الكريات البيض transendothelial الهجرة تحت تدفق الفسيولوجية للتمييز بين طرق التهجير اثنين.

Abstract

أثناء الالتهاب، الكريات البيض تترك الدورة الدموية وتعبر البطانة لمكافحة غزو مسببات الأمراض في الأنسجة الكامنة. وتعرف هذه العملية باسم هجرة الكريات البيض transendothelial. وقد وصفت طريقين عن الكريات البيض لعبور أحادي الطبقة البطانية: الطريق paracellular، أي من خلال تقاطعات خلية خلية والطريق العابر للخلايا، أي من خلال جسم الخلية البطانية. ومع ذلك، فقد كان من الصعب من الناحية الفنية على التمييز بين بارا والطريق العابر للخلايا. وضعنا مقايسة بسيطة في المختبر لدراسة توزيع الذاتية VE كادهيرين وPECAM-1 خلال العدلات transendothelial الهجرة في ظل ظروف تدفق الفسيولوجية. قبل العدلات نضح، تم علاج الخلايا البطانية لفترة وجيزة مع الأجسام المضادة fluorescently المسمى ضد VE كادهيرين وPECAM-1. لم هذه الأجسام المضادة لا تتداخل مع وظيفة كل من البروتينات، كما يحددها الكهربائية خلية substraالشركة المصرية للاتصالات مقاومة الاستشعار عن بعد وFRAP القياسات. باستخدام هذا الاختبار، تمكنا من متابعة توزيع الذاتية VE كادهيرين وPECAM-1 أثناء الترحيل transendothelial تحت ظروف التدفق ويميز بين الطرق بارا والهجرة العابر للخلايا من الكريات البيض في البطانة.

Introduction

كفاءة ورقابة مشددة هجرة الكريات البيض transendothelial (TEM) ذات أهمية رئيسية في العمليات الفيزيولوجية مثل المراقبة المناعة والتهاب حاد. ومع ذلك، تحت بعض الظروف الفسيولوجية patho، TEM غير المنضبط والمفرط لوحظ الناتجة في الأمراض الالتهابية المزمنة (مثل التهاب المفاصل وتصلب الشرايين والربو). أيضا خلال الانبثاث ورم الخلايا، وعملية الهجرة transendothelial هي مفيدة لخلايا الورم لمغادرة تعميمها على metastasize ^1-3. من أجل التدخل على وجه التحديد مع الكريات البيض المفرطة أو TEM الخلايا السرطانية، لا بد من فهم مفصل لتنظيم هذه العملية.

ويعتقد أن عملية TEM تحدث من خلال الخطوات المختلفة. دراسات المنوية، استعرض قبل عقدين من الزمن من قبل جزار والوثاب، أدى إلى نموذج متعددة الخطوات واصفا عملية TEM ^4،5. هذا النموذج لا يزال صحيحا، رغم أن بعض الإعلاناتوقد شملت الخطوات المشروط ^6. ألون وآخرون وصفت الحاجة إلى وجود كيموكينات يجمد على سطح البطانة ^7. مؤخرا، أنها أظهرت أن البطانة نفسها تولد كيموكينات التي يتم تقديمها في السطح القمي البطانية ^8. وعلاوة على ذلك، وضعت الجماعة نفسها إلى الأمام أهمية ظروف تدفق خلال TEM ^7. مؤخرا، يمكن أن العديد من المنشورات ركزت على طريقين الكريات البيض مختلفة تأخذ في المرحلة النهائية من انسلال TEM. إما أنها يمكن أن تذهب من خلال تقاطعات خلية خلية، أي طريق الهجرة paracellular، أو عبور من خلال جسم الخلية البطانية، والمعروفة باسم العابر للخلايا طريق الهجرة ^9. درس كارمان وزملاؤه هذه المسارات بالتفصيل وخلص إلى أن الكريات البيض تفضيلي اختيار طريق الهجرة paracellular (90٪) عبر الطريق العابر للخلايا (10٪) عند عبور الوريد السري البطانية أحادي الطبقة ^10.ومع ذلك، عندما استخدمت الخلايا البطانية من أصول أخرى مثل المخ أو الأوعية الدموية الدقيقة، وتستخدم المزيد من الكريات البيض الطريق العابر للخلايا (30٪) ^11. أظهرت مجموعة Vestweber مؤخرا أنه عندما كانت غير قادرة على فصل عن بعضها البعض باستخدام طرق في نموذج حيواني، لتحل محل الذاتية تقاطعات خلية خلية VE كادهيرين لVE كادهيرين ألفا catenin الوهم، تم حجب الكريات البيض TEM بالكامل ¹² . والمثير للدهشة، لاحظ المؤلفون أن TEM تم حجب في العديد، ولكن ليس كل شيء، والأنسجة. عموما، أشارت هذه التجارب الأنيقة التي الكريات البيض فضل الطريق paracellular على الطريق العابر للخلايا، على الرغم من الإشارات التنظيمية التي تؤدي هذا القرار لا تزال غير معروفة.

على الرغم من أن الغالبية العظمى من الكريات البيض يفضلون طريق الهجرة paracellular، فإنه لا يزال من الصعب التمييز بين كل من المسارات. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من العديد من الدراسات التي تركز على دور البطانية junct خلية خليةالأيونات، وديناميات هذه التقاطعات، ولا سيما البروتينات صلي VE كادهيرين وPECAM-1، خلال معبر الكريات البيض لا يزال قيد النقاش. وضعنا مقايسة بسيطة نسبيا والتي تقاطع هذه الجزيئات يمكن رصدها في الوقت الحقيقي خلال انسلال الكريات البيض تحت ظروف تدفق الفسيولوجية باستخدام الأجسام المضادة fluorescently المسمى. لم هذه الأجسام المضادة لا يتداخل أو عرقلة سلامة صلي أو التنقل من البروتينات المستهدفة. هذا الاختبار يسمح لنا لمتابعة ديناميكية البروتينات صلي أثناء عملية paracellular TEM. بالإضافة إلى ذلك، يسمح هذا الاختبار أيضا تمييزا بين طرق الهجرة شبه النظامية والعابر للخلايا.

Protocol

تم عزل العدلات من المتطوعين الأصحاء الذين وقعوا على الموافقة المسبقة. وقد أجريت الأبحاث في الامتثال للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية لرفاهية الإنسان.

1. الطلاء والصيانة من الوريد السري الإنسان خلايا غشائي

1. خلايا الثقافة الوريد السري الإنسان غشائي (HUVECs) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تنمو HUVECs على فبرونيكتين (FN) -coated الأطباق (10 ميكروغرام / مل، يذوب في الماء المنزوع المعادن) باستخدام وسائل الإعلام (غشائي بصل متوسطة (EBM-2) متوسطة تستكمل مع غشائي متوسط ​​النمو (EGM-2) singlequots). استخدام زراعة الخلايا بين 4-8 الممرات للتجارب.
2. يوم 1: معطف تدفق غرف مع 100 ميكرولتر من فبرونيكتين (10 ميكروغرام / مل في PBS) لمدة 2 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2.
3. يوم 2: عندما تصل خلايا التقاء 80-90٪، يعرض للتريبسين الخلايا بعد الغسيل حذرا مع الفوسفات مخزنة المالحة RT (PBS) درجة الحموضة 7.4، أجهزة الطرد المركزي في 800 x ج و resuspend في 800،000 خلية / مل باستخدام وسائل الإعلام. لوحة 80،000 الخلايا في كل قناة واحدة من FN المغلفة تدفق غرف وماصة بلطف تعليق الخلية صعودا وهبوطا. ثقافة O / N في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2.
4. يوم 3: تحديث وسائل الإعلام في الشريحة تدفق الغرفة عن طريق إمالة بلطف الشريحة في زاوية 45 درجة. (انظر الشكل 1A).
   ملاحظة: من المستحسن لإزالة فقط وسائل الإعلام في الخزانات وليس في القناة نفسها. إزالة وسائل الإعلام في القنوات قد يؤدي إلى فقدان الخلية البطانية والموت بسبب قوة سحب وسائل الإعلام تسبب قبل pipetting.
5. تحقق من النقيض من المرحلة المجهري إذا شكلت الخلايا البطانية أحادي الطبقة (أي 100٪ متموجة). إذا كانت الخلايا ليست 100٪ متموجة، تغيير وسائل الإعلام مرتين في اليوم حتى تصل إلى 100٪ التقاء.
6. مرة واحدة وقد وصلت الخلايا confluency، وتحفيز الخلايا مع وسائل الإعلام (راجع الخطوة1.1) تحتوي على الوسيط التهابات (TNF-α (10 نانوغرام / مل)). تحفيز HUVECs O / N (أي 12 ساعة) مع نتائج TNF-α في النمط الظاهري التهاب البطانة، مثال.، يصل تنظيم جزيئات التصاق الخلية مثل ICAM-1 وVCAM-1 ^13.

2. كرية بيضاء متعددة النوى العزل عن طريق التدرجات Percoll

1. إعداد N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic حمض (HEPES) -buffer (وتسمى فيما يلي: تدفق العازلة) قبل عزل الكريات البيض النوى (السوداء). يستخدم تدفق العازلة لغسل PMNs معزولة وكما عازلة في فحص التدفق. لإعداد تدفق العازلة: تمييع 7.72 جم كلوريد الصوديوم (132 ملم)، 4.76 غرام HEPES (20 ملم)، 0.45 ز بوكل (6 ملم)، 0.25 غرام MgSO ₄ • 7H ₂ O (1 ملم)، K ₂ هبو ₄ • 3H ₂ O (1.2 ملم) في 1 لتر من الماء المنزوع المعادن وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 (يمكن أن تبقى هذه الأسهم في 4 درجات مئوية لعدة أسابيع).
2. إضافة الطازج 100 ميكرولتر 1 M CaCl _{2 & #}160؛ (1 ملم)، 2.5 مل الألبومين البشري من تركيز الأسهم 200 غرام / لتر (0.5٪ V / V) و 0.1 غرام السكر إلى 100 ​​مل (0.1٪ ث / ت) من تدفق العازلة. المقبل، تصفية العازلة تدفق باستخدام فلتر 0.45 ميكرون. ملاحظة: يحتاج هذا العازلة تدفق لتكون على استعداد طازجة لكل تجربة.
3. قبل عزل PMN، وإعداد 10٪ صوديوم سترات (TNC) حل في برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4.
4. جمع 20 مل من الدم الكامل في vacuettes heparine الصوديوم من المتطوعين الأصحاء. تمييع الدم الكامل 1: 1 مع 10٪ PBS / الشركات عبر الوطنية في 50 مل أنابيب و 20 ماصة مل مخففة الدم بعناية على 12.5 مل من Percoll (أ 23٪ (وزن / وزن) حل الغروية في المياه مع كثافة 1.130 جم / مل) الجديد في أنبوب 50 مل. وضع بعناية الأنابيب في جهاز الطرد المركزي وتدور لمدة 20 دقيقة في 800 x ج مع انخفاض تسارع وعدم انقطاع وضعت في RT.
   ملاحظة: عند إضافة الدم المخفف إلى Percoll، إمالة أنبوب Percoll التي تحتوي في زاوية 45 درجة وماصة بلطف الدم المخفف في الطرافة أنبوبح أبطأ إعداد ماصة الصبي.
5. إزالة جميع السوائل وملء الأنبوب في وقت لاحق مع الجليد الباردة تحلل كرات الدم الحمراء العازلة (4.15 ز NH ₄ الكلورين [0.155 م]، 0.5 غرام KHCO ₃ [0.01 M] و 18.5 ملغ EDTA (ثلاثي III) [0.1 ملي] إلى 500 مل من الجليد الباردة H ₂ O) إلى ليز كريات الدم الحمراء. ترك أنبوب على الجليد، عكس بعض الأحيان الأنبوب، حتى يتحول تعليق الأحمر الداكن، تليها الطرد المركزي 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية مع فواصل تمكين.
   ملاحظة: جزء بيليه يحتوي على PMNs (العدلات، الحمضات، الخلايا القاعدية) مع الكريات الحمراء.
6. إزالة طاف ويغسل بيليه مرتين في الجليد الباردة تحلل العازلة في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
7. resuspend الكرية مع تدفق العازلة على RT وتحديد تركيز PMNs باستخدام عدادة الكريات أو خلية مكافحة الآلي. تعليق PMNs في تدفق العازلة في 1 × 10 ⁶ خلية / مل والحفاظ على RT.

3. وصفها من غشائي مفرقآل VE كادهيرين وPECAM-1

1. إضافة PECAM اليكسا فلور 647 الضد (استنساخ WM59) في التخفيف 1: 100 والكالسيوم مستقل-VE كادهيرين-FITC الأجسام المضادة (استنساخ 55-7H1) في 1:50 التخفيف إلى HUVEC مستنبت (راجع الخطوة 1.1)، واحتضان لمدة 30 دقيقة قبل بدء التجربة تدفق لتصور ديناميات صلي الخلايا البطانية أثناء التهجير العدلات في ظل ظروف تدفق الفسيولوجية.
   ملاحظة: قبل إضافة الأجسام المضادة المسمى مباشرة إلى التدفق من الدوائر، وضمان أن حجم في كل قناة لا يتجاوز 100 ميكرولتر. هذا يساعد على إبقاء نفقات الأجسام المضادة عند أدنى مستوى ممكن.

4. PMN TEM الفحص تحت التدفق

1. وضع PMNs في حمام الماء لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل حقنها في نظام التدفق.
2. ربط أنابيب إلى غرفة فارغة تدفق وملء مع الدافئة (على سبيل المثال، 37 ° C) تدفق العازلة (راجع الخطوة 4.3) لمنع تشكيل فقاعات الهواء عند إعداد اله نظام التدفق.
3. ربط جانب واحد من فارغة تدفق الغرفة إلى حقنة نظام تدفق المضخة باستخدام أنابيب السيليكون التي تحتوي على حقنة 20 مل، ووضع للغرفة التدفق إلى مرحلة المجهر.
4. ربط الجانب الآخر من الغرفة فارغة تدفق إلى الخزان قارورة مملوءة 37 ° C تدفق العازلة (الشكل 1B) وبدء ضخ حقنة من أجل سد جميع الأنابيب مع تدفق العازلة. فإن مضخة سحب تدفق العازلة من الخزان خلال تدفق غرفة في حقنة. ملاحظة: يحتوي هذا الأنبوب أيضا يور ميناء حقن في خط، والذي يسمح PMNs ليتم حقنه بإبرة في تجربة تشغيل دون توقف تدفق وخلق فقاعات الهواء.
5. استبدال فارغة تدفق غرفة مع تدفق غرفة تحتوي على تعامل TNF-α-HUVECs، قم بتوصيل أنابيب تحتوي على تدفق العازلة ووضعه في المرحلة المجهر (الشكل 1C). قرصة قبالة الأنابيب قبل قطع الاتصال وإعادة توصيلم إلى غرف تحتوي على HUVECs، لا معسر قبالة قد يؤدي إلى تكون فقاعات الهواء داخل أنابيب و / أو تدفق غرف.
6. ضبط سرعة التدفق إلى 1 داين / سم ^2، وفقا الفسيولوجية سرعة التدفق في الأوردة الشعرية بعد (1-5 داين / سم ^2).
7. سجل التفاضلية التدخل التباين (DIC)، FITC (488 نانومتر) واليكسا فلور 647 (647 نانومتر) في وقت واحد باستخدام مجهر المسح الضوئي ليزر متحد البؤر.
8. حقن PMNs (الخطوة 4.1) ببطء في نظام التدفق عبر خط يور في ميناء حقن (الشكل 1D) باستخدام المحاقن 1 مل.
9. بعد بضع دقائق، تظهر الكريات البيض، والتمسك، وtransmigrate. إيقاف التجربة في أي لحظة المطلوب عن طريق قطع من أنابيب التدفق من الغرفة ومثبت pipetting ل(3.7٪ الفورمالديهايد في PBS) إلى منطقة غرفة التدفق. السماح التثبيت لمدة 10 دقيقة، تليها الغسيل مع برنامج تلفزيوني. ويتم تحليل البيانات باستخدام برامج التصوير (انظر الجدول المواد والمعدات).
   ملاحظة: إجراء التجربة أنه باستخدام متحد البؤر المجهر المسح الضوئي ليزر مجهزة غرفة المناخ مع درجة حرارة ثابتة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2، و63X نفط الهدف.

النتائج

اختبرنا أولا إذا الأجسام المضادة لا تتداخل مع وظيفة حاجز البطانة. قمنا بقياس المقاومة من الطبقات الوحيدة البطانية الكهربائية باستخدام الخلايا الركيزة مقاومة الاستشعار (ECIS). لمزيد من التفاصيل، انظر فان Buul وآخرون ¹³ ولم يلاحظ أي تغيير في المقاومة عندما أضيف الأجسام المضادة المناهضة لل-VE كادهيرين fluorescently المسمى إلى الخلايا (الشكل 2A). الأجسام المضادة لمكافحة VE كادهيرين معترف بها جيدا لمنع VE كادهيرين خفضت وظيفة المقاومة بشكل كبير (الشكل 2A). كما أن الأجسام المضادة المستخدمة في التصوير لا تغير ديناميات-VE كادهيرين، كما تم تقييم من خلال قياس الفلورسنت الانتعاش بعد صورة تبيض (FRAP) من VE كادهيرين-GFP (الشكل 2B).

بعد 1-2 دقائق، العدلات انضمت إلى أحادي الطبقة البطانية تفعيلها كما يمكن تصوره في القناة DIC (الشكل 3A). بعد الزحف ل5-30 حد ذاتهج، فإن الغالبية العظمى من العدلات transmigrated من خلال أحادي الطبقة البطانية من خلال تقاطعات خلية خلية التي وصفت مع الأجسام المضادة الموجهة ضد PECAM-1-VE وكادهيرين. خلال عملية انسلال، وأعقب وPECAM-1 في الوقت الحقيقي (الشكل 3B) توزيع كادهيرين VE. في مواقع العدلات انسلال، VE كادهيرين تعطلت محليا وأظهر PECAM-1 تشبه حلقة هيكل أكثر. بعد الانتهاء من انسلال، وتقاطعات وثيقة و-VE كادهيرين وPECAM-1 نقلهم بوضوح في مواقع انسلال (الشكل 3C). لاحظ أنه تم الكشف عن أجزاء من الأجسام المضادة لمكافحة PECAM-1 على سطح العدلات مرة واحدة وصلت العدلات الجانب باسو الوحشي من البطانة. غير أن هذا لا يمنع العدلات من عبور البطانة. كانت ديناميات وحظ من VE كادهيرين في الوقت الحقيقي أثناء الترحيل العدلات transendothelial بالاتفاق مع العمل من قبل شو وزملاؤه الذينأظهرت، باستخدام متحد البؤر المجهري و-VE كادهيرين-GFP transfected الخلايا البطانية، التي VE كادهيرين-GFP تنتشر أفقيا عندما عبرت الكريات البيض في البطانية تقاطعات خلية خلية ^14. عمل أيضا سو وزملاء العمل أكدت ملاحظاتنا من PECAM-1. وأظهر الباحثون أن، بجانب الوحشي VE كادهيرين نشر على الكريات البيض مرور، تم توزيع PECAM-1 محليا في حلقة حول transmigrating العدلات ^15.

الرقم 1. في غرفة تدفق المختبر. (A) يشير السهم الخزان من المتوسط ​​الذي يحتاج إلى تحديث. (B) سيليكون أنابيب يربط غرفة التدفق مع في خط ميناء حقن يور تستخدم لحقن PMNs دون فصل أنابيب (رأس السهم). (C) كونيتيكتection من تدفق غرفة فارغة إلى قارورة خزان مملوء 37 ° C تدفق العازلة (رأس السهم). (D) اتصال للغرفة التدفق مع HUVECs تعامل TNF-α إلى الأنابيب التي تحتوي على تدفق العازلة وضعت في مرحلة المجهر (رأس السهم).

الشكل 2.-VE كادهيرين الأجسام المضادة لا تتداخل مع ديناميات صلي أو وظيفة. يقاس (A) مقاومة الخلايا البطانية أحادي الطبقة باستخدام ECIS. Y محور يعبر عن مقاومة في أوم ومحور س يمثل الوقت بالساعات. VE كادهيرين الأجسام المضادة استنساخ 55-7H1، وصفت مع ALEXA647 (الخط الأزرق) أو نمط إسوي السيطرة مفتش-ALEXA647 (خط أحمر) لا تغير أحادي الطبقة البطانية مقاومة الخلايا، في حين أن كادهيرين VE-CL75 منع الأجسام المضادة (الخط الأسود) لم تقلل من مقاومة . (B ) وأعرب في HUVEC-VE كادهيرين GFP وتحليل FRAP باستخدام متحد البؤر المجهري كشف أي تغيير في الانتعاش مضان في وجود أو عدم وجود VE كادهيرين 55-7H1 الأجسام المضادة.

الرقم 3.-VE كادهيرين وPECAM-1 التوزيع خلال TEM العدلات في الوقت الحقيقي. (A) العدلات (ملحوظ مع خط أبيض) الالتزام على البطانة وعبور تقاطع خلية خلية دون التأثير على توزيع VE كادهيرين وPECAM -1. (B) العدلات عبور أحادي الطبقة البطانية من خلال تقاطعات خلية خلية. وPECAM-1 يمكن ملاحظتها عندما يبرز على العدلات من خلال تقاطعات خلية خلية وتشتت المحلي كادهيرين VE. ويوضح خط أبيض جود العدلات لا يزال على رأس البطانة. يظهر خط أصفر ثا غشاء العدلاتر هي بالفعل تحت البطانة. (C) العدلات عبرت تماما أحادي الطبقة البطانية. VE كادهيرين ونقلت وPECAM-1 في مواقع انسلال. يوضح الخط الأصفر حدود العدلات transmigrated. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

لهذا البروتوكول، فمن الأهمية بمكان لمنع تشكيل فقاعات الهواء في التدفق من الدوائر، لأن هذا سوف يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج الخلية وأحادي الطبقة تعطلت. لتجنب هذا، نود أن نؤكد لدفع فوائد خاصة الخطوات 4.2 و 4.5، حيث يتم توصيل الأنابيب إلى غرفة التدفق. آخر خطوة حاسمة في البروتوكول هي فتيلة من PMNs التي يتم الاحتفاظ بها في RT التي تفرخ لهم ل15-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل حقنها إلى تدفق غرفة (الخطوة 4.1). هذه النتائج في فتيلة من integrins الكريات البيض، مما يتيح لهم الانضمام إلى جزيئات الالتصاق مثل ICAM-1 أو VCAM-1 في البطانة.

لا يقتصر هذا البروتوكول لدراسة التهجير من العدلات. أيضا أنواع أخرى مثل الكريات البيض وحيدات الخلايا اللمفية أو يمكن استخدام. لاحظ أن الخطوة 4.1، أي فتيلة الكريات البيض قد تختلف بين أنواع الكريات البيض. أيضا، وأنواع أخرى من الخلايا البطانية يمكن استخدامها. لهذا فإنها لا تزال حرجةلتحفيز الخلايا البطانية مع المحفزات المناسبة التهابات مثل TNF-α أو IL-1β. إذا العدلات لا تستجيب في transmigrating، يمكن للمرء النظر علاج لفترة وجيزة العدلات (5 دقائق) مع N-فورميل-L-methionyl-L-لوسيل-L-فينيل ألانين (fMLP) الببتيد ^16. وهذا تحفيز العدلات، ولا سيما integrins، وأبعد من ذلك، مما يجعلها أكثر عرضة للالتمسك البطانة.

وعادة ما تستخدم 1 داين / سم ² سرعة التدفق. يتم قياس هذه السرعة في تدفق الأوردة بعد الشعرية، المواقع التي يحدث فيها معظم هجرة الكريات البيض transendothelial ^17. استخدام وصف تدفق غرف، فمن الممكن زيادة سرعة تدفق تصل إلى 10 داين / سم ^2. ومع ذلك، فمن غير المستحسن لزيادة القص أبعد من ذلك. فإنه قد يؤدي إلى تسرب غير مرغوب فيه من الأنابيب ومفرزة من الخلايا الموجهة من غرفة التدفق.

نتائج موضح في الشكل (3) تدل على أن هذهالأجسام المضادة يمكن استخدامها لتصور ودراسة ديناميات البطانية تقاطعات خلية خلية خلال انسلال الكريات البيض. على وجه الخصوص، بالإضافة إلى فحوصات التهجير القائمة هذا البروتوكول يسمح للتمييز paracellular من الهجرة العابر للخلايا في ظل الظروف الفسيولوجية تدفق في الوقت الحقيقي. منذ الأجسام المضادة وصمة عار على تقاطعات خلية خلية، يمكن للمرء أن يسجل عدد الكريات البيض التي تعبر VE كادهيرين / تقاطعات PECAM-1-الإيجابية مقابل nonpositive-VE كادهيرين / PECAM-1 المواقع. بهذه الطريقة، والهجرة العابر للخلايا يمكن تمييز من الهجرة paracellular.

من المهم التأكيد على أن هذه الأجسام المضادة لا تتداخل مع وظيفة من البروتينات التي تربط ل: الأجسام المضادة PECAM-1 المستخدمة في هذه الدراسة موجهة ضد المجال خارج الخلية الثانية. الخلايا البطانية التي كانت مطلية في وجود الأجسام المضادة لم تظهر أي عيوب في نشر أو تشكيل أحادي الطبقة، مما يشير إلى أن الجسم المضاد لم يقل لاتتداخل مع التفاعلات بين الخلايا البطانية مثلي النمط. بالإضافة إلى ذلك، كل من الأجسام المضادة لا يضعف قدرة العدلات على الهجرة من خلال أحادي الطبقة البطانية. بالإضافة إلى ذلك، لا يتم تغيير عدد العدلات أن transmigrate عبر أحادي الطبقة البطانية في غياب أو وجود الأجسام المضادة (لا تظهر البيانات). الأهم من ذلك، متحد البؤر المسح المجهري بالليزر يعطي لنا إمكانية لتسجيل القنوات الفلورسنت مختلفة ومدينة دبي للإنترنت في وقت واحد.

وبالتالي، يسمح هذا الاختبار دراسة ديناميات-VE كادهيرين وPECAM-1 في نفس الوقت عندما تعبر على العدلات والبطانية تقاطع خلية خلية، وسوف تساعد على فهم لماذا الكريات البيض اختيار طريق واحد على الآخر، أي paracellular مقابل العابر للخلايا.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
μ-Slide VI	IBIDI	80606	Flow-chamber
0.45 μm filter	Whatman/GE Lifesciences	10462100
1 mL syringe	BD Plastipak	300013
20 mL syringe	BD Discardit II	366296
21G needle	BD Microlance	301155
Albumin	Sanquin	15522644
Ammunium chloride (NH4Cl)	Merck	1009245000
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	449709
EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors	Lonza	CC-3156 + CC-4176	media
EDTA (Titriplex III)	Merck	1370041000
Falcon tubes	Corning Life Sciences	352096
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141-2MG	FN
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
In-line Luer Injection port	IBIDI	10820
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)	Merck	105886
PECAM-1-ALEXA-647	BD Pharmingen	561654	clone WM59 stock concentration 0.1mg/mL
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	17-0891-09
Phosphate Buffered Saline	Fresenius Kabi  Nederland	M090001/01NL	PBS
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Potassium hydrogen carbonate (KHCO3)	Merck	1048540500
Potassium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4)	Sigma-Aldrich	P5504
Silicone Tygon 3350 tubing	VWR	228-4331	tubing
Sodium chloride (NaCl)	Calbiochem (Millipore)	567441
Syringe pump	Harvard Apparatus	model number 55-5920
TNFα	Peprotech	300-01A	tumor necrosis factor
trisodium citrate	Merck	1.06447.5000	TNC
Vacuettes	Greiner, Germany	980044
VE-Cadherin-FITC	BD Pharmingen	560411	clone 55-7H1	stock concentration 0.5mg/mL
Zeiss LSM510 META	Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany
Zen Software 2008	Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany