In tempo reale Imaging del endoteliali giunzioni cellula-cellula Durante neutrofili Trasmigrazione Sotto fisiologico flusso

Riepilogo

I leucociti attraversano il monostrato endoteliale utilizzando il paracellulare o il percorso transcellulare. Abbiamo sviluppato un test semplice per seguire la distribuzione di giunzionale endogena VE-caderina e PECAM-1 durante la migrazione dei leucociti transendoteliale sotto flusso fisiologico di discriminare tra le due vie di trasmigrazione.

Abstract

Durante l'infiammazione, leucociti lasciano la circolazione e attraversano l'endotelio a combattere invasori patogeni nei tessuti sottostanti. Questo processo è noto come migrazione leucocitaria transendoteliale. Sono stati descritti due percorsi per leucociti per attraversare il monostrato endoteliale: il percorso paracellulare, cioè, attraverso le giunzioni cellula-cellula e il percorso transcellulare, cioè, attraverso il corpo delle cellule endoteliali. Tuttavia, è stato tecnicamente difficile discriminare tra il paragrafo e itinerario transcellulare. Abbiamo sviluppato un semplice test in vitro per studiare la distribuzione di endogeno VE-caderina e PECAM-1 durante la migrazione dei neutrofili transendoteliale in condizioni di flusso fisiologiche. Prima di perfusione neutrofili, cellule endoteliali sono stati brevemente trattati con anticorpi fluorescenza marcata nei confronti di VE-caderina e PECAM-1. Questi anticorpi non interferiscono con la funzione di entrambe le proteine, come è stato determinato elettrico cellula-substrarilevamento impedenza te e FRAP misure. Usando questo test, siamo stati in grado di seguire la distribuzione dei endogeno VE-caderina e PECAM-1 durante la migrazione transendoteliale in condizioni di flusso e distinguere le parametri e migrazione transcellulare percorsi dei leucociti attraverso l'endotelio.

Introduzione

Efficiente e strettamente controllato migrazione dei leucociti transendoteliale (TEM) è di fondamentale importanza nei processi fisiologici quali la sorveglianza immunitaria e l'infiammazione acuta. Tuttavia, in determinate condizioni fisiopatologiche, TEM incontrollata ed eccessiva si osserva traduce in malattie infiammatorie croniche (ad esempio, l'artrite reumatoide, aterosclerosi, asma). Anche durante metastasi tumorali delle cellule, il processo di migrazione transendoteliale è strumentale per le cellule tumorali di lasciare la circolazione di metastatizzare ^1-3. Al fine di interferire specificamente con eccessiva leucociti o TEM cellule tumorali, è necessaria una conoscenza dettagliata della regolazione di questo processo.

Si ritiene che il processo TEM avviene attraverso diverse fasi. Studi seminali, recensito due decenni fa da Butcher e Springer, hanno portato al modello multistep che descrive il processo di TEM ^4,5. Questo modello è ancora valido, anche se alcuni annuncipassi nali sono stati inclusi ^6. Alon et al. Descritto la necessità della presenza di chemochine immobilizzati sulla superficie dell'endotelio ^7. Di recente, hanno mostrato che l'endotelio si genera chemochine che sono presentati alla superficie apicale endoteliale ^8. Inoltre, lo stesso gruppo ha presentato l'importanza delle condizioni di flusso durante TEM ^7. Recentemente, diverse pubblicazioni incentrate sulle due rotte diverse leucociti possono prendere nella fase finale di diapedesi TEM. Essi possono sia passare attraverso le giunzioni cellula-cellula, cioè, il percorso di migrazione paracellulare, o attraversare il corpo delle cellule endoteliali, noto come il percorso di migrazione transcellulare ^9. Carman e colleghi hanno studiato queste vie in dettaglio e ha concluso che leucociti preferenzialmente scegliere il percorso di migrazione paracellulare (90%) sul percorso transcellulare (10%) quando attraversano una vena ombelicale monostrato endoteliale ^10.Tuttavia, quando sono stati utilizzati cellule endoteliali provenienti da altre origini, ad esempio, il cervello o microcircolo, più leucociti utilizzato il percorso transcellulare (30%) ^11. Il gruppo Vestweber di recente ha mostrato che quando le giunzioni cellula-cellula erano in grado di dissociarsi tra loro utilizzando un knock-in modello animale, sostituendo endogena VE-caderina per VE-caderina-alfa-catenina chimera, leucociti TEM è stato completamente bloccato ¹² . Sorprendentemente, gli autori hanno notato che il TEM è stato bloccato in alcuni, ma non tutti, i tessuti. Nel complesso, questi eleganti esperimenti hanno indicato che i leucociti preferito il percorso paracellulare sul percorso transcellulare, anche se i segnali regolatori che attivano questa decisione sono ancora sconosciute.

Anche se la maggior parte dei leucociti preferiscono la rotta migratoria paracellulare, è ancora difficile discriminare tra i due percorsi. In aggiunta a ciò, nonostante vari studi focalizzati sul ruolo del junct cellula-cellula endotelialeioni, le dinamiche di queste giunzioni, in particolare le proteine ​​giunzionali VE-caderina e PECAM-1, durante la traversata dei leucociti è ancora in discussione. Abbiamo sviluppato una relativamente semplice test in cui queste molecole di giunzione possono essere monitorati in tempo reale durante la diapedesi dei leucociti in condizioni di flusso fisiologiche mediante anticorpi fluorescente-etichettati. Questi anticorpi non interferire con o bloccare l'integrità giunzionale o mobilità delle proteine ​​target. Questo test ci permette di seguire la dinamica delle proteine ​​giunzionali durante il processo di paracellulare TEM. Inoltre, questo test permette anche di discriminare tra le rotte migratorie parametri e transcellulare.

Protocollo

I neutrofili sono stati isolati da volontari sani che hanno sottoscritto un consenso informato. La ricerca è stata effettuata in conformità con le linee guida istituzionali e nazionali per il benessere umano.

1 placcatura e manutenzione di ombelicale Cellule endoteliali Vena

1. Cellule Cultura ombelicale umano Vena endoteliali (HUVEC) secondo le istruzioni del produttore. Crescere HUVECs su fibronectina (FN) Rivestiti piatti (10 mcg / ml, disciolti in acqua demineralizzata) utilizzando supporti (Endothelial Basal Medium (EBM-2) media integrato con Endothelial Growth Medium (EGM-2) singlequots). Utilizzare coltura cellulare tra 4-8 passaggi per gli esperimenti.
2. 1 ° giorno: Cappotto portate camere con 100 ml di fibronectina (10 mg / ml in PBS) per almeno 2 ore a 37 ° C e 5% di CO _2.
3. Giorno 2: Quando le cellule raggiungono 80-90% di confluenza, trypsinize le cellule dopo il lavaggio accurato con RT tampone fosfato (PBS) pH 7,4, centrifugare a 800 xg e risospendere a 800.000 cellule / ml utilizzando supporti. Piatto 80.000 cellule in ogni singolo canale delle portate camere FN-rivestiti e delicatamente pipetta la sospensione cellulare su e giù. Cultura O / N in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO _2.
4. Giorno 3: Aggiornare i media nella diapositiva flusso camera inclinando delicatamente il vetrino con un angolo di 45 °. (Vedi Figura 1A).
   NOTA: Si raccomanda di rimuovere solo i media nei serbatoi e non nel canale stesso. Rimozione dei media nei canali può causare la perdita delle cellule endoteliali e la morte a causa della forza di trascinamento dei media causata da pipettaggio.
5. Controllare al microscopio a contrasto di fase se le cellule endoteliali hanno formato un monostrato (cioè, 100% confluenti). Se le cellule non sono al 100% confluenti, cambiare i media due volte al giorno fino a raggiungere il 100% di confluenza.
6. Una volta che le cellule hanno raggiunto la confluenza, stimolare le cellule con i media (vedere il passaggio1.1) contenente mediatore infiammatorio (TNF-α (10 ng / ml)). Stimolare HUVECs O / N (vale a dire, 12 ore) con risultati TNF-α in un fenotipo infiammatorio dell'endotelio, cioè., Up-regolazione delle molecole di adesione delle cellule, quali ICAM-1 e VCAM-1 ^13.

2. leucociti polimorfonucleati Isolamento Uso gradienti Percoll

1. Preparare N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acido (HEPES) -buffer (qui di seguito denominato: flow-buffer) prima di isolare leucociti polimorfonucleati (PMN). Flow-tampone è usato per lavare PMN isolati e come tampone nel saggio flusso. Per preparare flow-tampone: diluire 7.72 g di NaCl (132 mm), 4.76 g HEPES (20 mm), 0,45 g KCl (6 mm), 0,25 g _MgSO4 • 7H ₂ O (1 mM), K ₂ HPO ₄ • 3H ₂ O (1,2 mm) in 1 l di acqua demineralizzata e regolare a pH 7,4 (questo stock può essere conservato a 4 ° C per diverse settimane).
2. Aggiungere fresca 100 ml 1 M CaCl _{2 & #}160, (1 mM), 2,5 ml di albumina umana da una concentrazione di 200 g / L stock (0,5% v / v) e 0,1 g di glucosio per 100 ml (0,1% w / v) di flusso-buffer. Successivamente, filtrare il flusso buffer utilizzando un filtro da 0,45 micron. NOTA: Questo flusso-tampone deve essere preparato fresco per ogni esperimento.
3. Prima di isolamento di PMN, preparare una soluzione al 10% di citrato trisodico (TNC) in PBS, pH 7,4.
4. Raccogliere 20 ml di sangue intero in vacuettes eparina di sodio da un volontario sano. Diluire sangue intero 1: 1 con 10% PBS / TNC in provette da 50 ml e 20 ml pipetta diluiti attentamente sangue sul 12,5 ml di Percoll (un 23% (w / w) soluzione colloidale in acqua con una densità di 1.130 g / ml) in un nuovo tubo da 50 ml. Posizionare con cura le provette nella centrifuga e centrifugare per 20 minuti a 800 xg con bassa accelerazione e nessuna rottura fissato a RT.
   NOTA: Quando si aggiunge il sangue diluito al Percoll, inclinare il tubo di Percoll-contenente, in un angolo di 45 ° e pipettare delicatamente il sangue diluito l'arguzia tuboh il più lento impostazione pipetta ragazzo.
5. Rimuovere tutto il liquido e successivamente riempire il tubo con gelida lisi degli eritrociti-buffer (4.15 g di NH ₄ Cl [0.155 M], 0,5 g KHCO ₃ [0.01 M] e 18,5 mg di EDTA (triplex III) [0,1 mm] per 500 ml di ghiaccio-freddo H ₂ O) per lisare eritrociti. Lasciare provetta in ghiaccio, talvolta invertendo il tubo, finché la sospensione diventa rosso scuro, seguita da centrifugazione a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C con pause abilitati.
   NOTA: la frazione pellet contiene i PMN (neutrofili, eosinofili, basofili) insieme ai eritrociti.
6. Rimuovere il surnatante e lavare pellet due volte gelida lisi-buffer a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C.
7. Risospendere il pellet con flusso-buffer a RT e determinare la concentrazione di PMN utilizzando un emocitometro o contatore di cellule automatizzati. Sospendere i PMN nel flusso-buffer a 1 x 10 ⁶ cellule / ml e conservare a temperatura ambiente.

3 Etichettatura dei endoteliale Junctional VE-caderina e PECAM-1

1. Aggiungere il PECAM Alexa Fluor 647 anticorpi (clone WM59) ad una diluizione 1: 100 e l'anticorpo VE-caderina-FITC calcio-indipendente (clone 55-7H1) ad una diluizione 1:50 di HUVEC terreno di coltura (vedere il punto 1.1), e incubare per 30 minuti prima di iniziare l'esperimento flusso di visualizzare la dinamica giunzionali di cellule endoteliali durante neutrofili trasmigrazione in condizioni di flusso fisiologiche.
   NOTA: Prima di aggiungere gli anticorpi direttamente etichettati al flusso-camere, assicurarsi che il volume di ciascun canale non superi i 100 ml. Questo aiuta a mantenere le spese di anticorpi più basso possibile.

4. PMN TEM Assay Under flusso

1. Posizionare i PMN in un bagno di acqua per 15 min a 37 ° C prima di iniettarle nel flusso del sistema.
2. Collegare il tubo di un flusso-camera vuota e riempire con acqua calda (ad esempio, 37 ° C) Flusso-buffer (vedi punto 4.3) per evitare la formazione di bolle d'aria durante l'impostazione thsistema di flusso e.
3. Collegare un lato di un flusso camera vuota per il sistema di flusso pompa a siringa utilizzando tubi in silicone contenente una siringa da 20 ml, e mettere il flusso-camera nella fase microscopio.
4. Collegare l'altro lato di un flusso camera vuota nel pallone serbatoio riempito con 37 ° C di mandata-buffer (Figura 1B) e avviare la pompa a siringa per riempire tutte le tubazioni di flusso-buffer. La pompa tirerà il flusso buffer dal serbatoio attraverso il flusso camera nella siringa. NOTA: Questo tubo contiene anche una porta di iniezione in linea Luer, che permette PMN da iniettare con un ago in un esperimento in esecuzione senza arrestare il flusso e la creazione di bolle d'aria.
5. Sostituire il flusso-camera vuota con il flusso-camera contenente TNF-α-trattati HUVEC, collegare il tubo del flusso tampone contenente e posizionarlo nella fase di microscopio (Figura 1C). Pinch off i tubi prima di scollegare e ricollegare ilm alle camere contenenti il ​​HUVEC, come non pizzicare fuori può causare la formazione di bolle d'aria all'interno del tubo e / o velocità di flusso camere.
6. Regolare la velocità di flusso di 1 dyn / cm ^2, in conformità con le velocità del flusso fisiologico in venule post-capillari (1-5 dyn / cm ^2).
7. Record interferenza differenziale contrasto (DIC), FITC (488 nm) e Alexa Fluor 647 (647 nm) simultaneamente utilizzando un microscopio confocale a scansione laser.
8. Iniettare i PMN (passo 4.1) lentamente nel flusso attraverso il sistema in-linea Luer porta di iniezione (Figura 1D) con 1 ml siringhe.
9. Dopo pochi minuti, leucociti appaiono, aderire, e trasmigrare. Fermare l'esperimento in qualsiasi momento desiderato scollegando il tubo dal flusso-camera e pipettaggio fissativo (3,7% di formaldeide in PBS) nel flusso-camera. Lasciare fissazione per 10 minuti, seguita da un lavaggio con PBS. I dati vengono analizzati con il software di imaging (vedi Materiali e attrezzature tabella).
   NOTA: Eseguire la egli esperimento utilizzando un microscopio confocale a scansione laser dotata di una camera climatica a temperatura costante a 37 ° C, 5% di CO _2, e un olio 63X-obiettivo.

Risultati

Abbiamo prima testato se gli anticorpi non hanno interferito con la funzione di barriera dell'endotelio. Abbiamo misurato la resistenza di monostrati endoteliali mediante rilevamento impedenza cellula-substrato elettrico (ECIS). Per dettagli, vedere Van Buul et al. ¹³ Nessun cambiamento nella resistenza è stata osservata quando l'anticorpo anti-VE-caderina fluorescenza marcata è stato aggiunto alle cellule (Figura 2A). Un anticorpo anti-VE-caderina che è ben riconosciuto per bloccare VE-caderina funzione riduce drasticamente la resistenza (Figura 2A). Inoltre, gli anticorpi utilizzati per l'imaging non alterano le dinamiche della VE-caderina, come è stato valutato misurando il recupero fluorescente dopo fotometabolismo (FRAP) di VE-caderina-GFP (Figura 2B).

Dopo 1-2 minuti, neutrofili rispettate monostrato endoteliale attivato come potrebbe essere visualizzato nel canale DIC (Figura 3A). Dopo la scansione per 5-30 seC, la stragrande maggioranza dei neutrofili trasmigrato attraverso il monostrato endoteliale attraverso le giunzioni cellula-cellula che sono stati etichettati con gli anticorpi diretti contro PECAM-1 e VE-caderina. Durante il processo di diapedesi, la distribuzione di VE-caderina e PECAM-1 è stata seguita in tempo reale (Figura 3B). Nei siti di neutrofili diapedesi, VE-caderina è stato interrotto a livello locale e PECAM-1 ha mostrato una struttura più anulare. Dopo il completamento della diapedesi, le giunzioni strette e VE-caderina e PECAM-1 chiaramente trasferiti nei siti di diapedesi (Figura 3C). Si noti che le parti del anticorpo anti-PECAM-1 sono stati rilevati sulla superficie del neutrofilo, una volta raggiunta la neutrofili lato basolaterale dell'endotelio. Tuttavia, questo non ha impedito neutrofili di attraversare l'endotelio. Le dinamiche osservate del VE-caderina in tempo reale durante la migrazione dei neutrofili transendoteliale erano in accordo con il lavoro di Shaw e colleghi cheha mostrato, utilizzando la microscopia confocale e VE-caderina-GFP-trasfettate cellule endoteliali, che VE-caderina-GFP diffusa lateralmente quando leucociti attraversarono le giunzioni cellula-cellula endoteliali ^14. Lavorare anche da Su e colleghi hanno sottolineato le nostre osservazioni di PECAM-1. Essi hanno dimostrato che, accanto al laterale VE-caderina diffusione sul passaggio dei leucociti, è stato ridistribuito localmente PECAM-1 in un anello intorno al trasmigrante neutrofili ^15.

Figura 1 Nella camera di flusso vitro. (A) La freccia indica il serbatoio da cui il mezzo deve essere aggiornato. (B) tubo in silicone che collega la camera di flusso con la porta di iniezione Luer in-linea utilizzata per l'iniezione di PMN senza scollegare il tubo (punta di freccia). (C) Connezione di un flusso-camera vuota al pallone serbatoio riempito con 37 ° C di flusso-buffer (punta di freccia). (D) Collegamento del flusso da camera con i HUVECs TNF-α-trattate per il tubo-flow-tampone contenente e posto in palco microscopio (punta di freccia).

Figura 2 VE-caderina anticorpi non interferiscono con la dinamica o la funzione giunzionale. (A) delle cellule endoteliali impedenza monostrato viene misurata utilizzando ECIS. Y esprime impedenza in Ohm e asse x rappresenta il tempo in ore. VE-caderina anticorpi clone 55-7H1, marcato con ALEXA647 (linea blu) o isotipo di controllo IgG-ALEXA647 (linea rossa) non alterare l'impedenza monostrato di cellule endoteliali, mentre la VE-caderina blocco CL75 anticorpo (linea nera) si riduce l'impedenza . (B ) VE-caderina-GFP è stato espresso in HUVEC e analisi FRAP usando la microscopia confocale ha rivelato alcun cambiamento nel recupero di fluorescenza in presenza o assenza della VE-caderina 55-7H1 anticorpo.

Figura 3 VE-caderina e PECAM-1 durante la distribuzione dei neutrofili TEM in tempo reale. (A) dei neutrofili (contrassegnato con linea bianca) aderendo sull'endotelio e attraversando la giunzione cellula-cellula senza influenzare la distribuzione di VE-caderina e PECAM -1. (B) dei neutrofili attraversando il monostrato endoteliale attraverso le giunzioni cellula-cellula. Una dispersione locale di VE-caderina e PECAM-1 possono essere osservati quando una neutrofili sporge attraverso le giunzioni cellula-cellula. Linea bianca illustra la presenza di neutrofili ancora in cima dell'endotelio. Linea gialla mostra membrana dei neutrofili that è già sotto endotelio. (C) dei neutrofili ha completamente attraversato il monostrato endoteliale. VE-caderina e PECAM-1 sono trasferiti in siti di diapedesi. Linea gialla illustra confini neutrofili trasmigrato. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Per questo protocollo, è fondamentale per evitare la formazione di bolle d'aria nel flusso-camere, dal momento che questo si tradurrà in apoptosi cellulare e un monostrato perturbato. Per evitare questo, vogliamo sottolineare di prestare particolare interesse alle fasi 4.2 e 4.5, dove i tubi sono collegati al flusso-camera. Un altro punto critico nel protocollo è il priming dei PMN che vengono tenuti a RT da loro incubazione per 15-30 minuti a 37 ° C prima di iniettarle al flusso-camera (passo 4.1). Ciò si traduce in priming delle integrine leucocitarie, permettendo loro di aderire a molecole di adesione, quali ICAM-1 e VCAM-1 presso l'endotelio.

Questo protocollo non si limita a studiare la trasmigrazione dei neutrofili. Possono essere utilizzati anche altri tipi di leucociti quali monociti o linfociti. Si noti che passo 4.1, vale a dire, adescamento leucociti possono differire tra i vari tipi di leucociti. Inoltre, possono essere utilizzati altri tipi di cellule endoteliali. Per questo rimane criticoper stimolare le cellule endoteliali con opportuni stimoli infiammatori come il TNF-α e IL-1β. Se neutrofili non rispondono in trasmigrante, si può prendere in considerazione il trattamento della neutrofili brevemente (5 min) con N-formil-L-metionil-L-leucyl-L-fenilalanina (fMLP) peptide ^16. Ciò stimolerà i neutrofili, in particolare i loro integrine, ancora di più, che li rende più inclini ad aderire all'endotelio.

In genere viene utilizzato 1 dyn / cm ² velocità del flusso. Questa velocità di flusso si misura in venule post-capillari, luoghi dove avviene la maggior parte della migrazione leucocitaria transendoteliale ^17. Utilizzando le portate camere descritti, è possibile aumentare la velocità di flusso fino a 10 dine / cm ^2. Tuttavia, non è consigliabile per aumentare ulteriormente il taglio. Essa può causare perdite indesiderate del tubo e il distacco delle cellule dal flusso-camera.

I risultati descritti in figura 3 indicano che questiGli anticorpi possono essere utilizzati per visualizzare e studiare la dinamica del endoteliali giunzioni cellula-cellula durante diapedesi leucocitaria. In particolare, oltre ai saggi di trasmigrazione esistenti questo protocollo permette di discriminare paracellular dalla migrazione transcellulare in condizioni fisiologiche di flusso in tempo reale. Dal momento che gli anticorpi macchiano le giunzioni cellula-cellula, si può segnare il numero di leucociti che attraversano VE-caderina / giunzioni PECAM-1-positivi rispetto non positiva VE-caderina / PECAM-1 siti. In questo modo, la migrazione transcellulare può essere discriminato dalla migrazione paracellulare.

È importante sottolineare che questi anticorpi non interferiscono con la funzione delle proteine ​​che si legano a: la PECAM-1 anticorpo utilizzato in questo studio è diretto contro il secondo dominio extracellulare. Le cellule endoteliali che sono state piastrate in presenza dell'anticorpo non presentavano difetti di diffusione o formare un monostrato, suggerendo che l'anticorpo almeno non hainterferire con le interazioni omotipiche tra le cellule endoteliali. in aggiunta a ciò, entrambi gli anticorpi non compromettono la capacità dei neutrofili di migrare attraverso il monostrato endoteliale. Inoltre, il numero di neutrofili che trasmigrano attraverso il monostrato endoteliale in assenza o presenza di anticorpi non viene alterato (dati non mostrati). È importante sottolineare che, microscopio confocale a scansione laser ci dà la possibilità di registrare i canali fluorescenti diversi e DIC contemporaneamente.

Pertanto, questo test permette di studiare le dinamiche della VE-caderina e PECAM-1 nello stesso momento in cui una neutrofili attraversa la giunzione cellula-cellula endoteliale e vi aiuterà a capire perché i leucociti scegliere una rotta sopra l'altro, vale a dire, paracellulare contro transcellulare.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
μ-Slide VI	IBIDI	80606	Flow-chamber
0.45 μm filter	Whatman/GE Lifesciences	10462100
1 mL syringe	BD Plastipak	300013
20 mL syringe	BD Discardit II	366296
21G needle	BD Microlance	301155
Albumin	Sanquin	15522644
Ammunium chloride (NH4Cl)	Merck	1009245000
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	449709
EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors	Lonza	CC-3156 + CC-4176	media
EDTA (Titriplex III)	Merck	1370041000
Falcon tubes	Corning Life Sciences	352096
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141-2MG	FN
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
In-line Luer Injection port	IBIDI	10820
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)	Merck	105886
PECAM-1-ALEXA-647	BD Pharmingen	561654	clone WM59 stock concentration 0.1mg/mL
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	17-0891-09
Phosphate Buffered Saline	Fresenius Kabi  Nederland	M090001/01NL	PBS
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Potassium hydrogen carbonate (KHCO3)	Merck	1048540500
Potassium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4)	Sigma-Aldrich	P5504
Silicone Tygon 3350 tubing	VWR	228-4331	tubing
Sodium chloride (NaCl)	Calbiochem (Millipore)	567441
Syringe pump	Harvard Apparatus	model number 55-5920
TNFα	Peprotech	300-01A	tumor necrosis factor
trisodium citrate	Merck	1.06447.5000	TNC
Vacuettes	Greiner, Germany	980044
VE-Cadherin-FITC	BD Pharmingen	560411	clone 55-7H1	stock concentration 0.5mg/mL
Zeiss LSM510 META	Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany
Zen Software 2008	Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany