Nötrofil Hicret altında Fizyolojik Akış sırasında endotel hücre-hücre Eklemlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

Özet

Lökositler paraselüler veya transselüler yolu kullanarak endotel tek tabaka çapraz. Biz endojen junctional dağıtım VE-kaderin ve PECAM-1 lökosit transendotelyal göç sırasında fizyolojik akış altında iki âlemden yolları arasında ayrım için takip basit bir deney geliştirildi.

Özet

Inflamasyon sırasında, lökositler dolaşımını bırakın ve alttaki dokularda işgalci patojenlere mücadele endotelyumu çapraz. Bu süreç lökosit transendotelyal göç olarak bilinir. Endotel tek tabaka geçmeye lökositler için iki yol tarif edilmiştir: yani hücre-hücre kavşaklarda ve transselüler rota aracılığıyla paraselüler rota, yani, endotel hücre vücuda. Bununla birlikte, para- ve transsellüler yol arasında ayrım yapmak teknik olarak zor olmuştur. Biz endojen dağılımı VE-kaderin ve PECAM-1 fizyolojik akış koşulları altında nötrofil transendotelyal göç sırasında incelemek için basit in vitro testi geliştirdi. Nötrofil perfüzyon önce, endotel hücreleri kısa bir süre için VE-cadherin ve PECAM-1 karşı floresan ile etiketlenmiş antikorlar ile tedavi edilmiştir. Elektrik hücre substra ile saptandığı gibi, bu antikorlar hem proteinlerin işlevine müdahale etmedite empedans algılama ve sıkı bağlamak ölçümleri. Bu analizi kullanarak, endojen dağılımı akış koşulları altında transendotelyal göç sırasında ve PECAM-1-kaderin VE ve endotelyumda lökositlerin para- ve transselüler göç yolları ayırt takip başardık.

Giriş

Verimli ve sıkı bir şekilde kontrol lökosit transendotelyal göç (TEM) gibi bağışıklık gözetim ve akut inflamasyon gibi fizyolojik süreçlerde önemli bir yer tutmaktadır. Bununla birlikte, bazı pato-fizyolojik koşullar altında, kontrol edilemeyen ve aşırı TEM kronik iltihaplı hastalıklar (örneğin, romatoid artrit, ateroskleroz, astım) elde görülmektedir. Tümör hücreleri ^1-3 metastaz için kan dolaşımını bırakmak için aynı zamanda, tümör hücre metastazı sırasında transendoteliyal taşınması işleminde etkili olduğunu. Özellikle aşırı lökosit ya da tümör hücresi TEM müdahale etmek için, bu işlemin düzenlenmesinde ayrıntılı bir anlaşılması gerekmektedir.

TEM sürecinin farklı adımlarda meydana geldiğine inanılır. Butcher ve Springer tarafından iki yıl önce yorumlanan Seminal çalışmaları, TEM ^4,5 sürecini anlatan çok basamaklı modeline yol açtı. Bu model, her ne kadar hala bazı reklamdan, geçerlidirditional adımlar ⁶ dahil edilmiştir. Alon ve diğ. Endotel ⁷ yüzeyi üzerinde hareketsiz kemokinlerin yer alması ihtiyacı tanımlamışlardır. Son zamanlarda, onlar endotel kendisi endotel apikal yüzeyinde ^8'de sunulmaktadır kemokinlerle üretir olduğunu gösterdi. Ayrıca, aynı grup TEM sırasında ⁷ akış koşullarının önemini ortaya koymak. Son zamanlarda, iki farklı güzergahlar lökositler odaklanan çeşitli yayınlar TEM son diyapedez aşamada alabilir. Onlar, yani, hücre-hücre kavşaklarda aracılığıyla paraselüler göç rota gitmek, ya da transselüler göç rotası ⁹ olarak bilinen endotel hücre gövdesi aracılığıyla geçebilir ya. Carman ve meslektaşları detaylı olarak bu yolları okudu ve göbek ven endotel tektabaka ¹⁰ geçerken lökositler tercihen transselüler rota (% 10) üzerinde paraselüler göç güzergahı (% 90) tercih sonucuna varmıştır.Bununla birlikte, diğer kaynaklardan gelen endotel hücreleri kullanıldığı zaman, örneğin, beyin ya da kılcal daha lökositler transsellüler yol (% 30) ¹¹ kullanılır. Bir VE-kaderin-alfa-katenin için şimeri Vestweber grup son hücre-hücre kavşaklar endojen yerine, bir darbe-hayvan modeli kullanarak birbirinden ayırmak koyamadık o zaman VE-kaderin gösterdi, lökosit TEM tam ¹² engellendi . Şaşırtıcı, yazarlar TEM birkaç engellendi ama hepsi değil, dokular olduğunu fark ettim. Genel olarak, bu zarif deneyler bu kararı tetikleyen düzenleyici sinyaller hala bilinmiyor olsa da lökositler, transselüler güzergahın üzerinde paraselüler rotayı tercih ettiğini belirtti.

Lökositlerin çoğunluğu paraselüler göç yolu tercih olsa da, her iki yollar arasında ayrım hala zordur. Endotel hücre-hücre ayr rolü üzerine odaklanan bazı çalışmalarda rağmen bu ek olarak,iyonlar, bu kavşak dinamikleri, özellikle kavşak proteinler VE-kaderin ve PECAM-1, lökosit geçiş tartışma halen sırasında. Biz, bu birleşim moleküller flüoresan etiketli antikorlar kullanılarak akış koşulları altında, fizyolojik lökosit diyapedezin boyunca gerçek zamanlı olarak izlenmesini mümkün kılan nispeten basit bir deney geliştirildi. Bu antikorlar müdahale veya hedeflenen proteinlerin kavşak bütünlüğü veya hareketlilik bloke etmedi. Bu deney, bize paraselüler TEM sürecinde kavşak proteinlerin dinamiklerini takip etmesini sağlar. Ayrıca, bu testte de para- ve transselüler göç yolları arasında ayrımcılık verir.

Protokol

Nötrofiller bir bilgilendirilmiş onam imzaladı sağlıklı gönüllülerden izole edilmiştir. Araştırma, insan refahı için kurumsal ve ulusal rehberlere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Kaplama ve İnsan Göbek Daman Endotel Hücrelerinde bakımı

1. Üreticinin talimatlarına göre Kültürü İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde (HUVECler). Fıbronektin üzerinde büyümeye HUVECler (FN) ortam kullanılarak (demineralize su içinde çözülmüş 10 mg / ml) yemekler -kaplı (Endotel Büyüme Ortamı (EGM-2) ile takviye edilmiş endotel singlequots Bazal Ortam (EBM-2) ortamı). Deneyler için 4-8 geçişleri arasında hücre kültür kullanın.
2. Gün 1: 37 ° C'de en az 2 saat boyunca 100 ul fibronektin (PBS içinde 10 ug / ml) ve% 5 _CO2 ile kaplayın akış odaları.
3. 2. Gün: hücreleri% 80-90 ulaştığında, OS fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkandıktan sonra dikkatli Hücreleri tripsinize edin (pBS), pH 7.4, medyayı kullanarak 800.000 hücre / ml 800 xg santrifüj ve tekrar süspansiyon. Plaka 80000 FN-kaplanmış akış odalarından her kanal için hücreler yavaşça yukarı ve aşağı hücre süspansiyonu pipetle. Bir 37 ° C'de inkübatör ve% 5 _CO2 içinde kültür göre O / N.
4. 3. Gün: yavaşça 45 ° açıyla slayt eğerek akış slaytı medyayı yenileyin. (Şekil 1A bakınız).
   NOT: Sadece rezervuarlarda değil kanalında kendisi ortamı kaldırmak için tavsiye edilir. Kanallardaki ortam çıkarılması nedeniyle pipetleme neden ortamın sürükleme kuvveti endotel hücre kaybına ve ölüme yol açabilir.
5. Endotel hücreler, bir tek tabaka (yani,% 100 ortak akışlı) meydana varsa faz kontrast mikroskobu ile kontrol edin. Hücreler% 100 birleşik değilse onlar% 100 izdiham ulaşana kadar, bir gün Ortamı iki kez değiştirin.
6. Hücrelerin birleşik hale gelmesinden sonra, (yukandaki adım ortam ile hücrelerini uyarır1.1), iltihabi aracı madde (TNF-α (10 ng / ml) ihtiva etmektedir). , Endotel iltihabik bir fenotipe, TNF-α sonuçlarla HUVECler O / N (örneğin, 12 saat), yani teşvik., Üst-düzenlemenin, örneğin ICAM-1 ve VCAM-1 ¹³ gibi hücre yapışma moleküllerinin.

Perkol Degradeleri kullanma 2. Polimorfonükleer Lökosit izolasyonu

1. Polimorfonükleer lökositler (PMN) izole önce N-2-hidroksietilpiperazin-N'-2-etansülfonik asit (akış tamponu bundan sonra da adlandırılır) (HEPES) Tampon hazırlayın. Akış tamponu izole PMN yıkamak için kullanılır ve bu akış deneyinde tampon olarak. Akış tamponu hazırlamak için: 7.72 g NaCl (132 mM), 4.76 g HEPES (20 mM), 0.45 g KCl (6 mM), 0.25 gr MgSO ₄ • 7H _H2O (1 mM), K ₂ HPO ₄ • 3H seyreltik ₂ O minerali giderilmiş su, 1 L (1.2 mM) ve (bu stok birkaç hafta boyunca 4 ° C de muhafaza edilebilir), pH 7.4 ayarlanır.
2. Taze 100 ul 1 M _{CaCl2 & #} ekle160 (1 mM), 2.5 mi, 200 g / L'stok konsantrasyonu, 100 ml (0.5% h / h), ve 0.1 g glikoz, insan albümini (% 0.1 a / ​​h) akış tamponu. Daha sonra, bir 0.45 um filtre kullanılarak, akış tamponu filtre. NOT: Bu akış-tampon her bir deney için taze olarak hazırlanması gerekir.
3. Önceki PMN izolasyonu, PBS, pH 7.4 içinde% 10 trisodyum sitrat (TNC) solüsyon hazırlanır.
4. Sağlıklı bir gönüllüden sodyum heparin vacuettes tüm kanın 20 ml toplayın. 50 ml tüpler içinde% 10, PBS / TNC 1 ve pipet 20 mi ((gr / ml 1,130 bir yoğunluğu olan su içinde bir koloidal çözelti) bir a / a% 23) 12.5 ml Percoll üzerine dikkatli bir şekilde kan seyreltildi: Tam kan 1 seyreltin Yeni bir 50 ml tüp içinde. Dikkatlice santrifüj tüpleri ve 800, düşük bir ivme ile xg ve oda sıcaklığında belirlenen kırılma yok, 20 dakika boyunca dönerler.
   Not: Percoll seyreltilmiş kan eklerken, bir 45 ° açıda Percoll içeren tüp eğme ve yavaşça tüp wit seyreltilmiş kan pipetleh yavaş pipet çocuk ayarı.
5. Tüm sıvı çıkarın ve daha sonra, 500 ml buz soğukluğunda eritrosit lizis tamponu (4.15 g _NH4CI [0.155 M], 0.5 gr ₃ KHCO [0.01 M] ve 18.5 mg EDTA (üç katlı III) [0.1 mm] tüpün doldurulması ) buz soğukluğunda _H2O eritrositleri lizise uğratmak üzere. Süspansiyon etkin sonları ile, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x santrifüj, ardından koyu kırmızı, olana kadar, bazen Tersine tüp, tüp buz üzerinde bırakın.
   Not: topak parçası eritrositleri ile birlikte PMN (nötrofiller, eozinofiller, bazofiller) içerir.
6. Süpernatantı ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de, buz sıcaklığında lizis tamponu içinde iki kez yıkayın pelet.
7. RT'de akış tamponu ile pelet ve hemositometer ya da otomatik hücre sayıcı kullanarak PMN konsantrasyonunu belirlemek. 1 x 10 ⁶ hücre / ml akış tamponu içinde askıya alma PMN ve oda sıcaklığında tutun.

Endotel Junction 3. EtiketlemeEl VE-kaderin ve PECAM-1

1. 1 de PECAM Alexa Fluor 647 antikoru (klon WM59) ekleyin: 1:50 seyreltme HUVEC kültür ortamı 100 seyreltme ile kalsiyuma bağlı VE-kaderin-FITC antikoru (klon 55-7H1), (adım 1.1) ve önceki fizyolojik akış koşulları altında nötrofil trans sırasında endotel hücre birleşim dinamiklerini görselleştirmek için akış deney başlamadan 30 dakika inkübe edilir.
   NOT: akış odalarına doğrudan etiketli antikorlar eklemeden önce, her bir kanal hacim 100 ul aşmamasını sağlamak. Bu, mümkün olduğunca düşük antikor giderleri tutmanıza yardımcı olur.

4. PMN Deney TEM altında Akış

1. Önce akış sistem içine enjekte edilmesinden 37 ° C'de 15 dakika boyunca bir su banyosu içine PMN yerleştirin.
2. Th kurarken boş bir akış odasına boru bağlayın ve oluşumunu engellemek için (örneğin, 37 ° C) akış tampon sıcak (bkz adım 4.3) ile doldurun hava-kabarcıklarE akış sistemi.
3. 20 ml'lik bir şırınga ihtiva eden silikon tüp kullanılarak şırınga pompası akış sistemine boş bir akış odasının bir tarafında bağlayın ve mikroskop kademesine akış odasına koyun.
4. 37 ° C akış tamponu (Şekil 1B) ile dolu hazne şişeye boş bir akış odasının diğer tarafını ve akış tamponu ile her borunun doldurmak için şırınga pompası başlar. Pompa şırıngaya akış bölmesi boyunca rezervuardan akış-tampon çeker. Not: Bu boru da akışının kesilmesi ve hava kabarcıkları oluşturmadan PMN çalışan bir deneye bir iğne ile enjekte edilmesi için izin veren bir hat-içi enjeksiyon ağzının luer içerir.
5. TNF-α-muamele edilmiş HUVECler içeren akış bölmesi ile boş akış bölmesi yerine, akış tamponu ihtiva eden boru bağlantı ve bir mikroskop kademesine (Şekil 1C) içine yerleştirin. Çıkarmadan ve tekrar bağlamadan önce tüplerini çimdikkapalı kısma değil, HUVECler içeren odalarına m boru ve / veya akış odası içinde hava kabarcıklarının oluşmasına neden olabilir.
6. Sonraki kılcal venüllerin fizyolojik akış hızına uygun olarak, 1 dyn / cm ² akış hızını ayarlamak (1-5 din / cm ^2).
7. Tutanak Diferansiyel Girişim Kontrast (DIC), FITC (488 nm) ve Alexa Fluor 647 (647 nm) aynı anda odaklı lazer tarama mikroskobu kullanılarak.
8. PMN 1 mi şırıngalar kullanılarak hat-içi luer enjeksiyon ağzından (Şekil 1D) ile yavaş yavaş akış sistemi (adım 4.1) enjekte edilir.
9. Bir kaç dakika sonra, lökositler yapışan ve göçmek, görünür. Akış odasına akış odasının ve pipetleme fiksatif (PBS içerisinde% 3.7 formaldehit) boruların sökülmesini tarafından arzu edilen herhangi bir an deney durdurun. 10 dakika boyunca tespit Veren, PBS ile yıkanması işlemi uygulanır. Veri görüntüleme yazılımı (malzeme ve ekipman tabloya bakınız) kullanılarak analiz edilmektedir.
   NOT: 37 ° C,% 5 _CO2 olan bir sabit sıcaklığa sahip bir klima kabini ile teçhiz edilmiş bir odaklı lazer tarama mikroskopu ve 63X ile de deneme amaçlı yağ gerçekleştirin.

Sonuçlar

Antikorlar endotel bariyer fonksiyonu ile müdahale etmedi eğer ilk test. Biz elektrik hücre alt-tabaka empedans algılama (ECIS) ile endotel tek katmanlarının direnci ölçüldü. Ayrıntılar için, Van Buul ve diğ. ¹³ anti-VE-cadherin floresan etiketli antikor hücreleri (Şekil 2A) ilave edildi, dirençli herhangi bir değişiklik gözlenmedi bkz. Engellemek için çok iyi bilinen bir anti-VE-cadherin antikor fonksiyonu önemli ölçüde (Şekil 2A) direncini azaltır VE-cadherin. Aynı zamanda, dinamiklerini değiştirmeyen, görüntüleme için kullanılan antikorlar, VE-cadherin, foto-ağartıcı (sıkı bağlamak) sonra flüoresan iyileşme ölçülerek değerlendirildi (Şekil 2B)-kaderin-GFP VE.

1-2 dakika sonra, nötrofiller DIC kanalı (Şekil 3A) olarak sunulacak bir görüntü olarak aktive edilmiş endotel tabakasına yapıştırılır. 5-30 se için tarama sonrac nötrofillerin büyük çoğunluğu PECAM-1 a'ya karşı yönlendirilen antikorlar ile etiketlenmiş ve VE-cadherin olan hücre-hücre birleşme yoluyla endotel tek tabaka ile transmigrant. Diyapedezin sürecinde, dağıtım VE-cadherin ve PECAM-1 ile gerçek zamanlı (Şekil 3B) olarak izlenmiştir. Nötrofil diyapedezin sahalarında, VE-kaderin yerel bozulur ve PECAM-1, daha halka benzeri bir yapı gösterdi. Diyapedezin tamamlanmasından sonra, kapat ve bir kam VE-cadherin ve PECAM-1 açıkça diyapedezin sahalara (Şekil 3C) yeri değiştirilir. Nötrofil endotelinin baso-yan kenar ulaştıktan sonra, anti-PECAM-1 antikor parçaları nötrofil yüzeyinde tespit edilmiştir unutmayın. Bununla birlikte, bu, endoteli geçmesini nötrofiller engellemedi. Nötrofil transendotelyal göç sırasında gerçek zamanlı olarak gözlenen dinamikleri VE-kaderin Shaw ve arkadaşları tarafından çalışmaları ile anlaşmaya vardı kimkonfokal mikroskopi kullanılarak, gösterdi ve VE-kaderin-GFP-transfekte VE-kaderin-GFP lökositler endotel hücre-hücre kavşakları ¹⁴ geçtiklerinde yanal dağınık endotel hücreleri,. Su ve arkadaşları PECAM-1 bizim gözlemlerini vurguladı tarafından da çalışırlar. Onlar lökosit geçişi üzerine yanal yanında, bu VE-kaderin difüzyon gösterdi, PECAM-1 lokal transmigrating nötrofil ¹⁵ etrafında bir halka içine dağıtıldı.

In vitro akış odasında Şekil 1. (A). Ok orta yenilenmesi gerekiyor hangi depoyu gösterir. Boru sistemi (ok başı) bağlantısını kesmeden PMN enjekte etmek için kullanılan aynı doğrultuda luer enjeksiyon ağzı ile akış odacığına bağlayan (B) Silikon boru. (C), Conn37 ° C akış tamponu (ok başı) ile dolu hazne şişeye boş bir akış odasının ection. (D) akış tamponu ihtiva eden boru TNF-α-muamele edilmiş HUVECler ile akış odasının bağlanması ve bir mikroskop kademesine (ok başı) içine yerleştirilmiştir.

Şekil 2. VE-cadherin birleşim dinamikleri ya da işlev ile karışmaz antikor (A). Endotelyal hücre tek empedans ECIS kullanılarak ölçülür. Y-ekseni Ohm empedansı ifade ve x-ekseni saat zamanı gösterir. Antikor, CL75 (siyah çizgi) bloke VE-cadherin ise VE-cadherin antikor Alexa647 (mavi çizgi) ile etiketlenmiş klon 55-7H1 veya empedansını azaltmak, endotelyal hücre tek empedansını değiştirebilir olmayan IgG Alexa647 kontrol (kırmızı çizgi) ki izotipini . (B ) HUVEC ifade edildi kaderin-GFP-VE konfokal mikroskopi kullanılarak sıkı bağlamak analizi, varlığında veya yokluğunda, floresan kurtarma değişiklik görülmemiştir VE-cadherin 55-7H1 antikor.

Şekil 3. VE-cadherin ve PECAM-1 dağılımı gerçek zamanlı olarak nötrofil TEM sırasında (A). Nötrofil endotelyum üzerinde yapışma ve dağılımını etkilemeden hücre-hücre birleşme yerini geçen (beyaz çizgi ile işaretlenmiştir) VE-cadherin ve PECAM -1. (B), nötrofil hücre-hücre birleşme yoluyla endotel tek tabaka kapısı. Yerel bir dispersiyon VE-cadherin nötrofil hücre-hücre birleşme sayesinde çıkıntı yaptığında ve PECAM-1 ile gözlenebilir. Beyaz çizgi endotel üstüne hala nötrofil varlığını göstermektedir. Sarı çizgi nötrofil membran tha gösterirt endoteline altında zaten. (C) Nötrofil tamamen endotel tek tabaka geçti. VE-kaderin ve PECAM-1 diyapedezin bölgelerinde taşındı. Sarı çizgi transmigrant nötrofil sınırlarını göstermektedir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Bu, hücre apoptozu ve bir tek tabaka kesintiye neden olacağından, bu protokol için, bu akış odalarına hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için çok önemlidir. Bunu önlemek için, tüpler akış odasının bağlı adımlar 4.2 ve 4.5, özellikle faiz ödemek için vurgulamak istiyorum. Protokolde Diğer önemli adım önce akış odasının (aşama 4,1) injekte için 37 ° C'de 15-30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilerek bunları tutulur PMNs astarlı. Bu da onları, endotel de ICAM-1 ya da VCAM-1 gibi yapışma molekülü uygun sağlayan lökosit bütünleyicilerinin astarlanması ile sonuçlanır.

Bu protokol, nötrofil göçü incelemek için sınırlı değildir. , Monositler veya lenfositler gibi diğer lökosit tipleri kullanılabilir. Lökosit tipleri arasında farklılık olabilir lökositler emişli, yani bu adımı 4.1, unutmayın. Aynı zamanda, endotelyal hücrelerin diğer tür de kullanılabilir. Bunun için kritik kalırTNF-α ya da IL-1β gibi uygun, enflamatuar uyarılara ile endotelyal hücrelerini uyarmak için. Nötrofiller transmigrating yanıt yoksa, bir N-formil-L-metionil-L-leusil-L-fenilalanin (fMLP) ile peptit ¹⁶ ile nötrofiller kısa bir süre (5 dakika) muamele edilmesi düşünülebilir. Bu endotele uymak için onları daha eğilimli hale daha da, özellikle kendi integrinler de, nötrofiller teşvik edecek.

Tipik olarak 1 din / cm ² akış hızı kullanılır. Bu akış hızı post-kapiller venüllerin, en lökosit transendoteliyal göç ¹⁷ oluşur sitelerinde ölçülür. Tarif edilen akış odaları kullanılarak, 10 din / cm ² akış hızı kadar artırmak mümkündür. Bununla birlikte, daha da geliştirmek için kesme tavsiye edilmez. Bu akış odasından hücrelerin tüp ve dekolmanı istenmeyen sızıntısına neden olabilir.

Şekil 3 içinde tarif edilen sonuçlar, bu göstermektedirantikorlar görselleştirmek ve lökosit diyapedezin sırasında endotel hücre-hücre birleşme bölgesinin dinamikleri üzerinde çalışmak için de kullanılabilir. Özellikle, mevcut göçü deneylerinde ek olarak, bu iletişim kuralı, gerçek zamanlı olarak fizyolojik akış şartları altında hücre üzerinden taşıma arası paraselüler ayırt sağlar. Antikorlar, hücre-hücre kavşaklar leke dolayı, bir / PECAM-1-kaderin the VE pozitif olmayan karşı VE-cadherin / PECAM-1 ile pozitif bağlantı yerlerine çapraz lökosit sayısı tam olabilir. Bu şekilde, transselüler göç paraselüler göç ayırt edilebilir.

Bu çalışmada kullanılan PECAM-1 antikoru, ikinci hücre-dışı domenine karşı yöneliktir: Bu antikorlar bağlanan proteinlerin işlevine müdahale etmeyen olduğunu vurgulamak önemlidir. Antikor en az vermediği anlamına yayma veya bir tek tabaka oluşturan herhangi bir bozukluğun göstermedi antikorun mevcudiyetinde kaplandı Endotel hücreleri,endotel hücreleri arasındaki homotipik etkileşimleri ile müdahale. buna ek olarak, her iki antikorun endotel tek tabaka boyunca göç etme yeteneği nötrofillerin bozmamaktadır. Buna ek olarak, ya da yokluğunda, antikorların varlığında endotel tek tabaka üzerinde göç etmek nötrofil sayısının (veriler gösterilmemiştir) değişmez. Önemlisi, odaklı lazer tarama mikroskopisi bize aynı anda farklı floresan kanalları ve DIC kayıt imkanı verir.

Bir nötrofil endotel hücre-hücre birleşme yerini geçer ve lökosit hücre üzerinden karşı, diğer, yani paraselüler üzerinden bir yol tercih anlamak yardımcı olacaktır Dolayısıyla, bu deney aynı zamanda VE-cadherin ve PECAM-1 dinamiğini çalışmak sağlar.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
μ-Slide VI	IBIDI	80606	Flow-chamber
0.45 μm filter	Whatman/GE Lifesciences	10462100
1 mL syringe	BD Plastipak	300013
20 mL syringe	BD Discardit II	366296
21G needle	BD Microlance	301155
Albumin	Sanquin	15522644
Ammunium chloride (NH4Cl)	Merck	1009245000
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	449709
EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors	Lonza	CC-3156 + CC-4176	media
EDTA (Titriplex III)	Merck	1370041000
Falcon tubes	Corning Life Sciences	352096
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141-2MG	FN
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
In-line Luer Injection port	IBIDI	10820
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)	Merck	105886
PECAM-1-ALEXA-647	BD Pharmingen	561654	clone WM59 stock concentration 0.1mg/mL
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	17-0891-09
Phosphate Buffered Saline	Fresenius Kabi  Nederland	M090001/01NL	PBS
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Potassium hydrogen carbonate (KHCO3)	Merck	1048540500
Potassium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4)	Sigma-Aldrich	P5504
Silicone Tygon 3350 tubing	VWR	228-4331	tubing
Sodium chloride (NaCl)	Calbiochem (Millipore)	567441
Syringe pump	Harvard Apparatus	model number 55-5920
TNFα	Peprotech	300-01A	tumor necrosis factor
trisodium citrate	Merck	1.06447.5000	TNC
Vacuettes	Greiner, Germany	980044
VE-Cadherin-FITC	BD Pharmingen	560411	clone 55-7H1	stock concentration 0.5mg/mL
Zeiss LSM510 META	Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany
Zen Software 2008	Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany