JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

التقنيات التقليدية لتصنيع بولي أكريلاميد (PA) المواد الهلامية التي تحتوي على تحقيقات الفلورسنت تتضمن يقحم هلام بين سطح ملتصقة وشريحة زجاجية. هنا، وتبين لنا أن هذه الشريحة مع طلاء بولي-D-يسين (PDL) وتحقيقات الفلورسنت يموضع تحقيقات في حدود 1.6 ميكرون من سطح هلام.

Abstract

ولطالما استخدمت المواد الهلامية السلطة الفلسطينية كمنصة لدراسة قوات الجر الخلية بسبب سهولة تصنيع والقدرة على ضبط خصائصها المرنة. عند الركيزة المغلفة مع بروتين المصفوفة خارج الخلية، وخلايا تلتزم جل وتنطبق القوات، مما تسبب في هلام لتشويه. تشوه يعتمد على الجر الخلية وخصائص المرونة من هلام. إذا كان من المعروف مجال تشوه السطح، سطح الجر يمكن حسابها باستخدام نظرية مرونة. يتم قياس هلام تشوه عادة عن طريق دمج الخرز علامة فلوري بشكل موحد في هلام. تحقيقات تهجير ويشوه هلام. يتم تعقب تحقيقات بالقرب من سطح هلام. تعتبر النزوح التي أبلغ عنها هذه التحقيقات والتشريد السطح. يتم تجاهل أعماقها من السطح. يقدم هذا الافتراض خطأ في التقييمات قوة الجر. لقياس الدقيق للقوات خلية، من المهم جدا للموقع من الخرز ليكون معروفا. طورناوهي تقنية تستخدم الكيمياء بسيط لحصر الخرز علامة فلوري، 0.1 و 1 ميكرون في القطر، والمواد الهلامية في السلطة الفلسطينية، ضمن 1.6 ميكرون من السطح. نحن معطف ساترة مع بولي-D-يسين (PDL) والخرز الفلورسنت. ثم محصورة بين السلطة الفلسطينية حل هلام ساترة وسطح ملتصقة. نقل حبات الفلورسنت إلى حل خلال هلام علاج. بعد البلمرة، PA هلام يحتوي على حبات الفلورسنت على مقربة الطائرة إلى سطح هلام.

Introduction

وعادة يتم دراستها التفاعل الميكانيكي للخلية الحية مع البيئة المحلية في استخدام المواد الهلامية السلطة الفلسطينية. هذه تعتمد على ركائز بسيط، بروتوكول جيدا اتسم أنشأها ديمبو وانغ في عام 1997 1. واحدة من المزايا الرئيسية لهذه ركائز هو أن صلابة بهم يمكن ضبطها عن طريق تعديل تركيزات مكونات محددة من الحل هلام. وهذا يوفر منصة مرغوبة لدراسة تفاعل الخلايا مع بيئات مختلفة من الجمود. عندما المواد الهلامية المغلفة السلطة الفلسطينية مع المصفوفة خارج الخلية (ECM) البروتينات، والخلايا التمسك بها، وتوليد القوة. نتيجة لقوة الخلية، وهلام يشوه كهيئة مرن. هذا التشوه يعتمد على مقدار القوة التي تطبقها الخلايا وخصائص المرونة من هلام. وقد استخدمت العديد من الدراسات والمواد الهلامية السلطة الفلسطينية للتحقيق في قوات الجر الخلوية.

الاختلاف في واحدة من السلطة الفلسطينية هلام تلفيق، هي جزء لا يتجزأ المجهرية الفلورسنت (الخرز) رالاحجار الكريمه هلام لقياس قوات الجر خلية في المواد الهلامية من الجمود مختلفة 2. بناء على طلب قوة الخلية، وحبات تهجير من موقع الأولي في أعقاب هلام تشوه. يتم قياس مجال تشوه من التشريد حبة الفردية. ويستخدم هذا المجال تشوه مع نظرية المرونة وخصائص المرونة من هلام لحساب القوات الجر. توفر هذه القياسات فكرة عن كيفية الخلايا ميكانيكيا الشعور والتفاعل مع المكروية المحلية 3.

في العديد من بروتوكولات السلطة الفلسطينية هلام تلفيق المستخدمة على نطاق واسع، واختلطت حبات في جميع أنحاء هلام السلطة الفلسطينية في السائل، وحالته unpolymerized. جل بلمرة تماما PA يحتوي على حبات الفلورسنت طوال حجمه. عند حساب قوى الجر الخلية، ويتم مراقبة الخرز الأكثر بالقرب من سطح هلام (واجهة الخلية الركيزة). ويفترض أن النزوح من هذه الخرز تحدث على سطح خلية للثقافة البساطة في calculatio القوةن. وتجاهل الموقع الفعلي من الخرز داخل عمق هلام. ومع ذلك، في وسيلة مرنة (مثل هلام PA)، حبة أقرب إلى نقطة تطبيق القوة ستتحرك أكثر من حبة وهذا هو أبعد من هذه النقطة. وبالتالي، علاج تشريد نقطة (في الموقع حبة) البعيدة من السطح كما انه في نتائج السطحية في التقليل من tractions الخلوية. درجة الخطأ تعتمد على المسافة من حبة من السطح. لا يمكن تقدير الخطأ من دون معرفة مكان وجود حبة.

لقد تم تناول الحاجة إلى طريقة بسيطة لحصر الخرز جدا بالقرب من سطح خلية ثقافة ببضعة التقنيات. طريقة واحدة هي زيادة كثافة الخرز طوال هلام كله مثل أن هناك عددا كافيا من الخرز في الطائرة التنسيق العليا لقياس الحركة قريبة جدا من السطح. أسلوب آخر ينطوي على بناء غرفة التصوير مبائر للتصوير الخلايا الحية بحيث الضوء منفقط حبات في الطائرة العلوي الأكثر الوصل يتم جمع 4. يتضمن طريقة مختلفة تتراكب طبقة رقيقة جدا من هلام السلطة الفلسطينية تحتوي على الخرز على رأس هلام بلمرة بالفعل دون الخرز 5. والعيب كل من هذه التقنيات هو أن الموقع الدقيق من الخرز داخل هلام غير معروف. هذا الخطأ يدخل في حساب مجال النزوح من الخرز، وبالتالي حساب القوات الخلية. أسلوب آخر ينطوي على الاقتران من الخرز إلى السطح العلوي من هلام السلطة الفلسطينية بلمرة بالفعل باستخدام سلفو-SANPAH 6. هذا الأسلوب يضمن الخرز هي في الواقع إلا على الجزء العلوي من هلام السلطة الفلسطينية، ولكن إلى أي مدى هي جزء لا يتجزأ في عمق هلام غير معروف. هذا يحتمل أن إنشاء الطبوغرافيا المحلية للخلايا، والتي يمكن أن تغير سلوك الخلية، كما اقترح العمل قبل أن الخلايا يمكن الشعور بالقوة عدة ميكرون بعيدا 7. مؤخرا، وهي تقنية لالزخرفة المواد الهلامية السلطة الفلسطينية مع 1 ميكرون القطر وتأسست luorescent فبرونيكتين نقطة علامات في مجموعة وقننت 8. في هذه الحالة، وعمق من علامات الفلورسنت هو معروف، وأساسا الصفر، كما تتم طباعة نمط فبرونيكتين غير مباشرة على سطح هلام. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة لا توفر بيئة مستمرة على الخلايا التي يمكن أن نعلق، والبروتين ECM يقتصر على 1 ميكرومتر النقاط القطر. لم يتم بعد تأسيس طريقة لدمج الخرز بالكامل تعقب المواد الهلامية داخل السلطة الفلسطينية وقصر بعضها إلى موقع معروف جدا بالقرب من السطح.

هنا، ونحن نطور تقنية لتقييد ميكرون الفرعي إلى قطرها ميكرون الخرز الفلورسنت إلى المستوى البؤري جدا بالقرب من سطح الثقافة خلية داخل هلام السلطة الفلسطينية. عادة يتم الشفاء جل بواسطة يقحم unpolymerized حل هلام السائل بين لوحين من الزجاج. واحدة من لوحات وبين functionalized بحيث هلام تتمسك بشدة لذلك. والآخر هو unfunctionalized وتتم إزالة بعد علاج هلام. نقوم بتعديل هذا الزجاج قابل للإزالة سوrface بواسطة طلاء بطبقة من الخرز. على يقحم الجل السائل بين بين functionalized وحبة المغلفة سطح الزجاج، ونقل الخرز إلى هلام في حين أنه هو علاج. وهذا يحد من مسافة التكامل الخرز "في هلام في 1.6 ميكرون من السطح. تستخدم الأطباق الزجاجية القاع بيتري على سطح ملتصقة الذي يتم علاجه هلام. لتشكيل السطح العلوي هلام شقة خلال البلمرة، يتم استخدام غطاء زجاجي دائري زلة لشطيرة هلام مع طبق بتري الزجاج السفلي. قبل تلفيق هلام، وهي مغلفة زجاج الغطاء العلوي زلة مع بولي-D-يسين (PDL)، مما أسفر عن تهمة سطح إيجابي. نفخ في PDL قبالة مع الهواء المضغوط، ويترسب حل من الخرز في الماء على زلات الغطاء. نحن نستخدم بلي الفلورسنت carboxylated، التي تحمل شحنة سالبة، والتفاعل مع سطح موجبة الشحنة التي أنشأتها العلاج مع PDL. بعد تهب الحل حبة قبالة ساترة مع الهواء المضغوط، وطبقة واحدة منحبات تبقى مقرونة كهربية لتغطية زلة الجاف. طلاء PDL لا يؤثر على الإلتصاق من الزجاج على سطح هلام، والشرائح الزجاجية غير تالفة وإزالتها من هلام PA سليمة تماما.

مصنوعة من الزجاج أطباق بتري السفلي ملتصقة عن طريق العلاج مع 97٪ 3 أمينو بروبيل-trimethoxysliane و 0.5٪ غلوتارالدهيد. يتم إنشاء المواد الهلامية السلطة الفلسطينية من الجمود المطلوب عن طريق خلط تركيزات مناسبة من bisacrylamide والأكريلاميد عن طريق الإجراء القياسي 9. وpipetted قطرات من الحل الهلام على طبق بتري الزجاج السفلي. يتم استخدام زلة غطاء زجاجي يحتوي على حبات لشطيرة الجل مع طبق بيتري. عندما يتم الشفاء هلام، يتم إزالة الغطاء العلوي زلة تاركا جزءا لا يتجزأ من الخرز في هلام داخل السلطة الفلسطينية 1.6 ميكرون من السطح.

Protocol

افتعال وfunctionalizing المواد الهلامية السلطة الفلسطينية من التصلب مع المجهرية الفلورسنت المدمجة بالقرب من سطح خلية ثقافة مختلفة.

1. Functionalizing غطاء زجاج الأعلى الزلات

  1. نظيفة زلات غطاء زجاجي (# 1.0، بقطر 12 ملم.) بالصابون والماء، تليها الإيثانول لإزالة الغبار دخيلة.
  2. مكان غطاء زجاجي ينزلق على سطح المبشور (أي حامل ماصة تلميح) بحيث أنها لا لمس لتسهيل سهولة التفاعل مع لل coverslips.
  3. معطف كامل سطح غطاء ينزلق مع بولي-D-يسين (0.1 ملغ / مل) لمدة 1 ساعة (الشكل 1A).
  4. خلال هذا الوقت، إجراء 1: 10،000 التخفيف من الحل الغروانية من 0.1 ميكرون القطر، والمجهرية الفلورسنت الحمراء مع منزوع الأيونات (DI) المياه للحصول على كثافة الجسيمات من حوالي 1 المكروية في 20 ميكرون 2 على سطح هلام. انظر الشكل رقم (2) لنتائج مختلف التخفيفات. هذا dilutioيمكن تعديل ن لتلبية الحاجة من تجارب محددة.
  5. وضع محلول مخفف في حمام الماء بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة.
  6. بعد 1 ساعة، استخدام ملاقط لرفع بعناية كل زلة غطاء وضربة الجافة مع الهواء. العودة زلات غطاء الجافة على سطح المبشور.
  7. إزالة حل الغروي المخفف من حمام بالموجات فوق الصوتية وماصة 150 ميكرولتر على كل زلة غطاء. يترك لمدة 10 دقيقة (الشكل 1B).
  8. استخدام ملاقط لرفع بعناية كل زلة غطاء وضربة الجافة مع الهواء. العودة غطاء الجاف ينزلق إلى السطح المبشور وتخزينها في الظلام حتى جاهزة للاستخدام.

2. إعداد السلطة الفلسطينية جل مباشرة على الزجاج أطباق بتري القاع

  1. موقد سخن الى 100 درجة مئوية.
  2. وضع من العدد المرغوب فيه من أسفل الزجاج أطباق بتري (35 ملم 14 ملم مع طبق الصغيرة جيدا، # 1.0) على سطح مستو في غطاء الدخان الكيميائي.
  3. تغطية جزء من الزجاج كل طبق بتري الصغيرة بشكل جيد مع 97٪ 3 أمينو بروبيل-trimethoxysليان (3 APTES) لمدة 7 دقائق لتنشيط الكيميائي. أخذ الحيطة والحذر لتجنب نازف غير مقصود من APTES-3 إلى السطح من البلاستيك في طبق بيتري لتجنب تدهور البوليسترين.
  4. بعد 7 دقائق، وملء طبق بيتري مع الماء DI والتخلص منها في حاوية النفايات.
  5. كرر الخطوة 2.4 3X لكل طبق، ثم يهز طبق بيتري لإزالة الماء الزائد. وضع أطباق بتري على صفيحة ساخنة حتى جزء الزجاج الجاف.
  6. إزالة أطباق بتري من طبق ساخن والعودة إلى سطح مستو في غطاء الدخان الكيميائي.
  7. في غطاء الدخان الكيميائية، وجعل حل من 0.5٪ غلوتارالدهيد وتغطية جزء من الزجاج كل طبق بتري جيدا مع الحل لمدة 30 دقيقة. أخذ الحيطة والحذر لتجنب نازف غير مقصود من غلوتارالدهيد إلى السطح من البلاستيك في طبق بيتري لتجنب تدهور البلاستيك.
  8. بعد 30 دقيقة، وملء طبق بيتري مع الماء DI والتخلص منها في حاوية النفايات لشطف وإزالة glutaraldehyde.
  9. كرر الخطوة 2.4 3X لكل طبق، ثم يهز طبق بيتري لإزالة الماء الزائد. وضع أطباق بتري على صفيحة ساخنة حتى جزء الزجاج الجاف.
  10. قبل خلط مكونات الحل هلام السلطة الفلسطينية، نقل الشرائح الزجاجية بين functionalized في غطاء الدخان الكيميائية بحيث يمكن الوصول إليها بسهولة، مما يسمح للالحصر سريعة من هلام مع أسفل الزجاج أطباق بتري بعد خلط الحل هلام.
  11. في 15 مل أنبوب الطرد المركزي، خلط 40٪ bisacrylamide، 2٪ الأكريلاميد، وحمض الاكريليك على التوالي فورية في تركيزات المدرجة في الجدول 1 (مقتبس من البروتوكول نشرت 10) لتحقيق مرونة مصفوفة المطلوب.
  12. إضافة 100 ملي HEPES، بيرسلفات الأمونيوم 10٪، وTEMED بكميات المدرجة في الجدول 1 الموافق المطلوب مرونة مصفوفة لاستكمال حل هلام.
  13. ماصة على الفور 15 ميكرولتر من الحل الهلام على مركز للجزء الزجاجمن أطباق بتري.
  14. اختيار فورا حتى بين functionalized الزجاج غطاء زلة مع ملاقط.
    1. الوجه زلة غطاء زجاجي على مثل حبات الفلورسنت التي هي على اتصال صنع جنب مع حل هلام.
    2. وضع انزلاق الغطاء بلطف على أعلى من هلام السلطة الفلسطينية الآن السائلة مثل أن الجانب بين functionalized في اتصال مع هلام (الشكل 1C). ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، ينصح الشخص الثاني لدور مضيفا انزلاق الغطاء من أجل تجنب إمكانية البلمرة الجزئية pipetting لحين حل السائل هلام السلطة الفلسطينية على أطباق بتري متعددة.
  15. الوجه كل أطباق بتري على للمساعدة في تجنب آثار الجاذبية على جزيئات الفلورسنت البلمرة إلى مستويات أدنى من هلام السلطة الفلسطينية.
  16. الانتظار لمدة 35 دقيقة على الأقل، أو حتى بلمرة المحلول من هلام السلطة الفلسطينية بشكل واضح في أنبوب الطرد المركزي لها.
  17. الوجه أطباق بتري إلى أكثر من وملئها PBS للمساعدة في إزالة انزلاق الغطاء.
  18. جعل بعناية اتصال مع جزء من الزجاج طبق بيتري والخطوط العريضة للانزلاق الغطاء، وذلك باستخدام ملاقط لتتخلص من محيط من انزلاق الغطاء. أداء عدة دورات حتى يتم فكها انزلاق الغطاء. إزالة الغطاء زلة والتصرف في حاوية النفايات الحادة المناسبة.
  19. بعد إزالة الغطاء عن زلات، سيكون قد نقل حبات الفلورسنت إلى هلام (الشكل 1D). تغطية المواد الهلامية السلطة الفلسطينية تماما مع برنامج تلفزيوني، ضع غطاء طبق بتري على كل طبق، وتخزينها في 4 درجة مئوية.

3. Functionalizing هلام السلطة الفلسطينية مع فيبرونكتين]

  1. إعداد الحلول خلط التالية كما هو موضح في بروتوكول إنشاء 11: نقع حل (137 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5٪ (V / V) الجلسرين) و2X عازلة الاقتران (0.2 M 2- (N -morpholino) حمض ethanesulfonic (MES)، 10 ٪ (ت / ت) الجلسرين، ودرجة الحموضة 4.5).
  2. استخدام مضخة فراغ في غطاء البيولوجي لإزالة كافة PBS من الأطباق الزجاجية القاع التي تحتوي على المواد الهلامية السلطة الفلسطينية.
  3. الماصةنقع الشركة المصرية للاتصالات على حل كل هلام مثل أن الجل هي غارقة تماما. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل.
  4. دافئ 1 إيثيل-3- [3 dimethylaminopropyl] carbodiimide هيدروكلوريد (EDC) وN -hydroxysulfosuccinimide (NHS) إلى درجة حرارة الغرفة.
  5. مزيج 10X حلول EDC (150 ملم، 19 ملغ / مل في الماء DI) وNHS (250 مم، 29 ملغ / مل في الماء DI).
  6. مزيج 1 جزء 10X EDC، 1 جزء 10X NHS، 3 أجزاء من الماء DI، و 5 أجزاء 2X عازلة الاقتران.
  7. استخدام مضخة فراغ في غطاء البيولوجي لإزالة الحل نقع. تأكد من إزالة جميع السوائل من سطح هلام.
  8. إضافة ما يكفي من الحل NHS / EDC لتغطية سطح هلام وملء البئر من الزجاج السفلي من طبق بتري (150-250 ميكرولتر). يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام.
  9. فبرونيكتين ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. إذابة مرة واحدة، ومزيج الماء المعقم DI إلى إنشاء 50 ميكروغرام / مل حل فبرونيكتين.
  10. استخدام مضخة فراغ في غطاء البيولوجي لإزالة SOLU NHS / EDCنشوئها. تأكد من إزالة جميع السوائل من سطح هلام.
  11. إضافة 150 ميكرولتر من الحل فبرونيكتين على كل هلام. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 35 دقيقة للسماح لمرفق من فبرونيكتين.
  12. بعد 35 دقيقة، إضافة PBS إلى كل طبق بتري وتخزينها في 4 درجة مئوية لتصل إلى 2 أسابيع.

4. تجارب قوة الجر

  1. خلية الإعلام الدافئة، PBS، والتربسين إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
  2. شطف المواد الهلامية 5X مع برنامج تلفزيوني العقيمة، الشفط في برنامج تلفزيوني بين يشطف، وتترك مغطاة في غطاء محرك السيارة.
  3. إضافة 1 مل التربسين لكل 25 سم 2 إلى الخلايا التي تحتوي على قارورة. بعد أن يتم رفع الخلايا من القارورة، يخفف من التربسين مع وسائل الإعلام خلية وعدد الخلايا. بناء على مساحة هلام، وتحديد عدد الخلايا المطلوبة لكل هلام النهائية لكثافة البذر خلية من 3،000 خلية / سم 2. تمييع أو التركيز تعليق مثل أن 150 ميكرولتر من الخليط خلية الإعلام ويتضمن هذا العدد من الخلايا. قسامة 150 ميكرولتر من الخلايا suspensأيون إلى كل هلام.
  4. وضع أطباق بتري تحتوي على خلايا في حاضنة لمدة 30 دقيقة. ثم، وإزالة بعناية أطباق بتري وملء ما تبقى من طبق بيتري مع وسائل الإعلام (حوالي 2 مل) بحيث سطح الطبق هي غارقة تماما.
  5. وضع أطباق بتري مرة أخرى في الحاضنة حتى الحصول على الصور.
  6. إعداد المجهر ونظام الحصول على البيانات للتصوير: إدراج الهدف الغمر 40X المياه، إدراج التباين التدخل التفاضلية (DIC) المنشور، اختر mCherry أو مرشح الفلورسنت يعادل، وتشغيل غرفة البيئية.
  7. عندما أعدت للتصوير، وإزالة واحدة طبق بيتري من الحاضنة ووضعه برفق على المسرح المجهر. إزالة غطاء طبق بتري لمدينة دبي للإنترنت التصوير.
  8. حدد خلية واحدة والتقاط صورة ثابتة واحدة من الخلية في مدينة دبي للإنترنت.
  9. دون تحريك المسرح المجهر، تشغيل وضع التصوير لمضان. التركيز على المجهرية الفلورسنت وتفصيلأورد صورة من المجهرية.
  10. إزالة بعناية وسائل الإعلام خلية من طبق بيتري مع ماصة وإضافة 0.05٪ التربسين-EDTA.
  11. صورة وفصل المجهرية تحت الخلية بعد الخلايا.
  12. استخدام الجسيمات الصور velocimetry (التعريف الشخصية) تحليل في ImageJ 12 لحساب مجال النزوح بسبب القوات الخلوية.

النتائج

وقد استخدم التصوير متحد البؤر لتحديد أن كانت حبات الواقع تحت سطح هلام وتحديد موقعها بالضبط داخل عمق هلام. وسمح الخرز الفلورسنت من طول موجة مختلفة عن تلك داخل هلام ليستقر على السطح، وحساب المسافة بين جزيئات الفلورسنت المدمجة وتلك التي على السطح باستخدام خوارزمية تحد?...

Discussion

عند استخدام هذه التقنية، فمن الضروري أن الحل حبة وتضعف بشكل صحيح ويتم اختيار حبات بناء على القطر المطلوب، PA هلام الركيزة وصلابة، وحجم حجم الظواهر التي تم استكشافها في التجربة المطلوبة.

وينبغي اتخاذ الحذر عند تمييع الحل حبة قبل fun...

Disclosures

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgements

فإن الكتاب أود أن نعترف برنامج مبادرة التخصصات الابتكار، جامعة إلينوي، منح 12035. وقد تم تمويل SK في UIUC من مؤسسة العلوم الوطنية (NSF) منحة 0965918 IGERT: تدريب الجيل القادم من الباحثين في الخلوية والجزيئية وميكانيكا BioNanotechnology.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES)Sigma-Aldrich281778
70% GlutaraldehydePolysciences, Inc.111-30-8
1 M HEPES buffer solutionSigma-Aldrich83264
40% AcrylamideSigma-AldrichA4058
2% BisacrylamideSigma-AldrichM1533
0.1 µm Fluorescent microspheres (mCherry)InvitrogenF8801
Fibronectin, Human, 1 mgBD Biosciences354008
Ammonium persulfateBio-RAD161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED)Bio-RAD161-0801
Poly-D-lysineMilliporeA-003-E
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) Thermo Scientific22980
N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)Thermo Scientific24500
0.05% Trypsin-EDTA (1X)Life Technologies25300-054
NaClSigma-AldrichS9888
Acrylic acid Sigma-Aldrich147230
GlycerolSigma-AldrichG7757
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)Sigma-AldrichM3671
Materials
35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glassIn Vitro ScientificD35-14-1-N
Glass cover slips, 12 mm diam.Ted Pella, Inc.26023

References

  1. Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. PNAS. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  2. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophys. J. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  3. Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophys. J. 79 (1), 144-152 (2000).
  4. Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Stricker, J., Winter, S. P., Gardel, M. L. Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction. JoVE. , (2010).
  5. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide Hydrogels for Cell Mechanics: Steps Toward Optimization and Alternative Uses. Methods in Cell Biol. 83, 29-46 (2007).
  6. Marinkovic, A., Mih, J. D., Park, J. -. A., Liu, F., Tschumperlin, D. J. Improved throughput traction microscopy reveals pivotal role for matrix stiffness in fibroblast contractility and TGF-β responsiveness. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 303 (3), 169-180 (2012).
  7. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E. X., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J. Phys.: Condens. Matter. 22 (2010), 194116-194126 (2010).
  8. Polio, S. R., Rothenberg, K. E., Stamenovic, M. L., Smith, A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8, 82-88 (2012).
  9. Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymol. 298, 489-496 (1998).
  10. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. Current Protocols in Cell Biol. , 16 (2010).
  11. Poellmann, M. J., Wagoner Johnson, A. J. Characterizing and Patterning Polyacrylamide Substrates Functionalized with N-Hydroxysuccinimide. Cell and Mol. Bioengineering. 6 (3), 299-309 (2013).
  12. Tseng, Q., Duchemin-Pelletier, E., Deshiere, A., Balland, M., Guillou, H., Filhol, O., Théry, M. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. PNAS. 109 (5), 1506-1511 (2012).
  13. Trappmann, B., Gautrot, J. E., Connelly, J. T., Strange, D. G. T., Li, Y., Oyen, M. L., Cohen Stuart, M. A., Boehm, H., Li, B., Vogel, V., Spatz, J. P., Watt, F. M., Huck, W. T. S. Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate. Nature Materials. 11, 642-649 (2012).
  14. Wong, J. Y., Leach, J. B., Brown, X. Q. Balance of chemistry, topography, and mechanics at the cell-biomaterial interface: Issues and challenges for assessing the role of substrate mechanics on cell response. Surface Science. 570 (1-2), 119-133 (2004).
  15. Mih, J. D., Sharif, A. S., Marinković, A., Symer, M. M., Tschumperlin, D. J. A Multiwell Platform for Studying Stiffness-Dependent Cell Biology. PLoS ONE. 6 (5), e19929 (2011).
  16. Butler, J. P., Tolić-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. Am J Physiol Cell Physiol. 282, 595-605 (2001).
  17. Tolić-Nørrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. Am J Physiol Cell Physiol. 283, 1254-1266 (2002).
  18. Atanackovic, T., Guran, A. . Theory of Elasticity for Scientists and Engineers. , (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

91 PA D PDL

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved