Um novo método para localizar Repórter fluorescentes Beads perto da superfície de cultivo celular para Tração Microscopia de Força

Resumo

As técnicas tradicionais para a fabricação de poliacrilamida (PA) géis contendo sondas fluorescentes envolvem imprensando um gel entre uma superfície aderente e uma lâmina de vidro. Aqui, mostramos que este revestimento de lâmina com poli-D-lisina (PDL) e sondas fluorescentes localiza as sondas para dentro de 1,6 pM a partir da superfície do gel.

Resumo

PA géis têm sido muito utilizadas como uma plataforma para estudar as forças de tracção da célula devido à facilidade de fabrico e a capacidade para sintonizar as suas propriedades elásticas. Quando o substrato é revestido com uma proteína da matriz extracelular, as células aderem ao gel e aplicar forças, fazendo com que o gel para se deformar. A deformação de tracção depende da célula e as propriedades elásticas do gel. Se o campo de deformação da superfície é conhecido, a superfície de tracção pode ser calculada usando a teoria de elasticidade. Gel de deformação é normalmente medida por incorporação de grânulos de marcadores fluorescentes para o gel de modo uniforme. As sondas deslocam como o gel se deforma. As sondas perto da superfície do gel são rastreados. Os deslocamentos relatados por estas sondas são considerados como deslocamentos de superfície. As profundidades da superfície são ignorados. Esta hipótese apresenta erro na avaliação da força de tração. Para a medição precisa das forças de células, é essencial para a localização dos grânulos a ser conhecido. Nós desenvolvemosuma técnica que utiliza a química simples para limitar grânulos marcadores fluorescentes, 0,1 e 1 m de diâmetro, em géis de PA, dentro de 1,6 uM da superfície. Nós revestir uma lamela com poli-D-lisina (PDL) e esferas fluorescentes. Solução gel PA é então espremido entre a lamela e uma superfície aderente. As contas fluorescentes transferir para a solução de gel durante a cura. Após a polimerização, o gel PA contém pérolas fluorescentes num plano perto da superfície do gel.

Introdução

A interação mecânica de uma célula viva com o seu ambiente local tem sido comumente estudada utilizando géis PA. Estes substratos de contar com um protocolo simples, bem caracterizado estabelecida por Dembo e Wang, em 1997, ^1. Uma das principais vantagens destes substratos é que a sua rigidez pode ser ajustado por modificação das concentrações de componentes específicos da solução de gel. Isso fornece uma plataforma desejável estudar a interação das células com ambientes de diferentes rigidez. Quando géis PA são revestidos com proteínas (ECM) de matriz extracelular, as células aderir a elas, a geração de força. Como resultado da força da célula, o gel se deforma como um corpo elástico. Esta deformação depende da intensidade da força aplicada pelas células e as propriedades elásticas do gel. Vários estudos têm empregado géis PA para investigar forças de tração celulares.

Numa variação de fabricação de gel PA, microesferas fluorescentes (esferas) são incorporados turante o gel para quantificar as forças de tração na célula em géis de diferentes rigidezes ^2. Após a aplicação da força de células, as contas de deslocar da sua posição inicial após a deformação de gel. O campo de deformação é medida a partir dos deslocamentos individuais grânulo. Este campo é utilizado com deformação teoria da elasticidade e as propriedades elásticas do gel para calcular as forças de tracção. Essas medidas fornecem uma visão de como as células perceber e interagir com seu microambiente local ³ mecanicamente.

Em muitos PA protocolos de fabricação de gel utilizado, as contas são misturados em todo o gel PA na sua, não polimerizada estado líquido. Um gel de PA totalmente polimerizado contém pérolas fluorescentes todo o seu volume. Ao calcular as forças de tração na célula, contas a maioria perto da superfície do gel (interface de célula-substrato) são monitorados. Os deslocamentos destes grânulos são assumidos como ocorrem na superfície da cultura de células para manter a simplicidade da força CÁLCULOn. A localização exacta dos grânulos dentro da profundidade do gel é ignorado. No entanto, em um meio elástico (tal como gel de PA), um grânulo mais perto de um ponto de aplicação de força irá mover-se mais do que uma camada que está mais longe do ponto. Assim, tratando o deslocamento de um ponto (no local do grânulo) distal a partir da superfície como os resultados que a superfície em uma subestimação de trações celulares. O grau de erro depende da distância do rebordo a partir da superfície. O erro não pode ser estimado sem o conhecimento da localização do rolete.

A necessidade de um método simples para limitar grânulos muito perto da superfície da cultura de células foi tratada por algumas técnicas. Uma maneira é a de aumentar a densidade dos grânulos durante todo o gel de modo a que haja um número suficiente de esferas no plano focal de cima para medir o movimento muito perto da superfície. Outra técnica envolve a construção de uma câmara de imagem confocal de imagem de células vivas, tais que a luz a partir deapenas as contas no plano superior mais focal é coletado ^4. Um método diferente envolve a sobreposição de uma camada extremamente fina de gel PA contendo contas em cima de um gel já polimerizado sem contas ^5. Uma desvantagem de cada uma destas técnicas é que o local exacto dos grânulos dentro do gel não seja conhecida. Isto introduz erro no cálculo do campo de deslocamento dos grânulos e, assim, o cálculo das forças de células. Outra técnica envolve a conjugação de grânulos para a superfície de topo de um gel de AP já polimerizado usando Sulfo-SANPAH ^6. Esta técnica assegura que os grânulos são, de facto apenas no topo do gel de AP, mas o grau em que eles são incorporados na profundidade do gel é desconhecido. Isto pode, potencialmente, criar uma topografia local para as células, o que poderia alterar o comportamento celular, como o trabalho anterior sugeriu que as células podem sentir forças vários microns de distância ^7. Recentemente, uma técnica de padronização géis PA com 1 mícron de diâmetro fluorescent marcadores fibronectina pontos em uma matriz regularizada foi estabelecido ^8. Neste caso, a profundidade dos marcadores fluorescentes é conhecido, e é essencialmente zero, enquanto o padrão impresso é indirectamente fibronectina na superfície do gel. No entanto, este método não proporcionar um ambiente no qual as células contínua pode anexar, como a proteína de ECM está limitada a um um de diâmetro pontos. Um método para integrar plenamente contas rastreador dentro géis PA e confiná-los em um local conhecido muito perto da superfície ainda não foi estabelecida.

Aqui, nós desenvolvemos uma técnica para limitar sub mícrons de diâmetro de partículas fluorescentes uM para um plano focal muito perto da superfície de cultura de células dentro de gel de PA. Um gel é geralmente curado por ensanduichamento solução gel líquido não polimerizado entre duas chapas de vidro. Uma das placas é funcionalizado de modo a que o gel adira fortemente a ele. A outra é não funcionalizados e é removido após a cura do gel. Nós modificar este vidro removível surface revestindo-o com uma camada de grânulos. Após a ensanduichar o gel líquido entre a superfície de vidro funcionalizada e a pérola revestida, a transferência de contas para o gel, ao passo que se a cura. Isto limita a distância de integração dos grânulos no gel a cerca de 1,6 uM da superfície. Pratos de Petri de vidro de fundo são usados ​​como a superfície aderente em que o gel é curado. Para formar uma superfície superior plana de gel durante a polimerização, uma lamela circular de vidro é usado para o gel de sanduíche com a placa de Petri com fundo de vidro. Antes da fabricação de gel, a parte superior da tampa deslizante de vidro é revestido com poli-D-lisina (PDL), obtendo-se uma carga de superfície positiva. O PDL é soprado com ar comprimido, e com uma solução de pérolas em água é depositada sobre as lamelas. Nós utilizamos microesferas fluorescentes carboxilados, que carregam uma carga negativa, e interagir com a superfície carregada positivamente criado por tratamento com PDL. Após a solução de sopro grânulo fora da lamela com ar comprimido, de uma única camada decontas permanece eletrostático acoplado à tampa de deslizamento seco. O revestimento PDL não afecta a adesividade da superfície de vidro para o gel, como as lâminas de vidro são sem danos e removido do gel de AP totalmente intacta.

As placas de Petri de fundo de vidro são feitos aderente por tratamento com 97% de 3-aminopropil-trimethoxysliane e 0,5% de glutaraldeído. Géis PA de rigidez desejados são criados através da mistura de concentrações adequadas de bisacrilamida e acrilamida através de um procedimento padrão ^9. Uma gota da solução de gel é pipetada para o fundo uma placa de Petri de vidro. A lamela de vidro contendo as pérolas é usada para sanduíche do gel com a placa de Petri. Quando o gel é curado, o topo da tampa deslizante é removido, deixando as pérolas embutidas no gel PA dentro de 1,6 pM a partir da superfície.

Protocolo

Fabrico e funcionalização géis PA variando de rigidez com microesferas fluorescentes incorporadas perto da superfície da cultura de células.

1. Funcionalização o tampo de vidro lamínulas

1. Limpo lamelas de vidro (# 1,0, 12 mm de diam.) Com sabão e água, seguida por etanol, para remover o pó estranhos.
2. Tampa de vidro lugar desliza sobre uma superfície ralado (ou seja, o titular da ponteira) de tal forma que eles não estão tocando para facilitar a facilidade de interação com as lamelas.
3. Bata de toda a superfície da tampa desliza com poli-D-lisina (0,1 mg / ml) durante 1 hora (Figura 1A).
4. Durante este tempo, realizar uma diluição de 1: a solução de colóide de 0,1 um de diâmetro de 10.000, microesferas fluorescentes vermelhas com desionizada (DI) de água para se obter uma densidade de partícula de cerca de 1 por microesfera 20 mM ² sobre a superfície do gel. Ver Figura 2 para os resultados de várias diluições. Este dilution pode ser modificado para atender a necessidade de experimentos específicos.
5. Coloque a solução diluída em um banho de água de ultra-sons durante 30 min.
6. Depois de 1 hora, use uma pinça para levantar cuidadosamente cada lamínula e seque com o ar. Retorne os lamínulas secos à superfície ralado.
7. Remover a solução de colóide diluído a partir do banho de ultra-sons e uma pipeta de 150 uL em cada lamela. Deixe descansar por 10 min (Figura 1B).
8. Use uma pinça para levantar cuidadosamente cada lamínula e seque com o ar. Retorne a tampa seca desliza para a superfície e loja ralado no escuro até que esteja pronto para uso.

2 Preparando PA Gel Diretamente na Glass Bottom placas de Petri

1. Placa de aquecimento de pré-aquecimento a 100 ° C.
2. Coloque para fora o número desejado de fundo de vidro placas de Petri (35 milímetros prato com 14 milímetros micro-bem, # 1.0) em uma superfície plana em um exaustor química.
3. Cubra a parte de vidro de cada placa de Petri micro-bem com 97% 3-Aminopropil-trimethoxysliane (3-APTES) para 7 min para ativação química. Tomar cuidado para evitar o gotejamento inadvertida dos 3-APTES à superfície do plástico na placa de Petri a fim de evitar a degradação do poliestireno.
4. Após 7 min, preencher a placa de Petri com água DI e dispor em recipiente de resíduos.
5. Repita o passo 2.4 3x para cada prato, em seguida, apertar a placa de Petri para remover a água extra. Colocar as placas de Petri sobre a placa quente até que a porção de vidro é seco.
6. Retirar as placas de Petri a partir da placa de aquecimento e voltar para uma superfície plana numa hote química.
7. Em uma coifa química, fazer uma solução de glutaraldeído a 0,5% e a porção de cobertura de vidro de cada placa de Petri bem com a solução durante 30 min. Tomar cuidado para evitar o gotejamento inadvertida do glutaraldeído para a superfície do plástico na placa de Petri a fim de evitar a degradação do plástico.
8. Após 30 min, preencher a placa de Petri com água DI e dispor em recipiente de resíduos para lavar e remover o glutaraldehyde.
9. Repita o passo 2.4 3x para cada prato, em seguida, apertar a placa de Petri para remover a água extra. Colocar as placas de Petri sobre a placa quente até que a porção de vidro é seco.
10. Antes de misturar os componentes da solução de gel de PA, mover as lâminas de vidro funcionalizadas no exaustor de fumos química de tal modo que eles são facilmente acessíveis, o que permite a rápida ensanduichar do gel com o fundo de vidro pratos de Petri depois de misturar a solução de gel.
11. Num tubo de centrífuga de 15 mL, misturar 40% bisacrilamida, 2% de acrilamida, e de ácido acrílico em sucessão imediata, nas concentrações listadas na Tabela 1 (adaptado do protocolo publicado ¹⁰⁾ para atingir a desejada elasticidade da matriz.
12. Adicionar 100 mM de HEPES, 10% de persulfato de amónio e TEMED em quantidades indicadas na Tabela 1 correspondem a elasticidade da matriz desejada para completar a solução de gel.
13. Imediatamente pipeta 15 ul de solução de gel para o centro da porção de vidrodas placas de Petri.
14. Imediatamente pegar uma tampa de deslizamento de vidro funcionalizado com uma pinça.
    1. Vire a tampa de deslizamento de vidro sobre tal que as partículas fluorescentes estão na tomada de lado o contato com a solução de gel.
    2. Coloque a tampa deslizante suavemente no topo do gel-líquido PA agora de tal modo que o lado funcionalizado está em contacto com o gel (Figura 1C). Nota: Para obter melhores resultados, uma segunda pessoa é recomendado para a função de adicionar o deslizamento da tampa, a fim de evitar a possibilidade de a polimerização parcial, enquanto pipetando solução líquida gel PA em várias placas de Petri.
15. Virar todas as placas de Petri sobre para ajudar a evitar os efeitos da gravidade sobre nanopartículas fluorescentes polimerização em níveis mais baixos do gel PA.
16. Aguarde pelo menos 35 minutos, ou até que a solução estoque de gel PA visivelmente polimerizado em seu tubo de centrífuga.
17. Virar as placas de Petri de volta e enchê-los com PBS para ajudar com a remoção da tampa de deslizamento.
18. Com cuidado, faça contato com a parte de vidro da placa de Petri e os contornos da lamínula, usando uma pinça para raspar a circunferência da lamela. Execute vários ciclos até que a lamínula é desalojado. Retire a tampa de deslizamento e descarte em um recipiente de resíduos perfurocortantes adequada.
19. Após a remoção de todos os lamelas, contas fluorescentes terá transferido para o gel (Figura 1E). Cubra os géis PA completamente com PBS, coloque a tampa placa de Petri em cada prato, e armazenar a 4 ° C.

3. Funcionalização gel PA com fibronectina

1. Preparar as seguintes soluções de pré-misturados tal como descrito no protocolo estabelecido ^11: solução Soak (NaCl 137 mM, 5% (v / v) de glicerol) e 2x tampão de conjugação (0,2 H 2 (N-morfolino) etanossulfónico (MES), 10 % (v / v) de glicerol, pH 4,5).
2. Use uma bomba de vácuo em uma capa biológico para remover toda a PBS dos pratos com fundo de vidro contendo os géis PA.
3. Pipetate embebe a solução para cada gel de tal forma que o gel é completamente submerso. Incubar à temperatura ambiente durante pelo menos 1 hr.
4. Quente 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC) e N -hydroxysulfosuccinimide (NHS) a temperatura ambiente.
5. Misturar 10x soluções de EDC (150 mM, 19 mg / ml em água desionizada) e NHS (250 mM, 29 mg / ml em água desionizada).
6. Misture uma parte de 10x EDC, uma parte 10x NHS, 3 partes de água DI e 5 peças 2x tampão conjugação.
7. Usar uma bomba de vácuo com um capuz biológico para remover a solução de impregnação. Certifique-se de todo o fluido é removido da superfície do gel.
8. Adicionar suficiente solução de NHS / EDC, para se cobrir a superfície do gel e encher o poço com fundo de vidro da placa de Petri (150-250 uL). Incubar à temperatura ambiente durante 30 min no escuro.
9. Fibronectina Descongelar à temperatura ambiente. Uma vez descongelado, misturar água estéril DI para criar um / ml solução de fibronectina 50 ug.
10. Usar uma bomba de vácuo com um capuz biológico para remover as solu NHS / EDCção. Certifique-se de todo o fluido é removido da superfície do gel.
11. Adicionar 150 ul de solução de fibronectina para cada gel. Incubar à temperatura ambiente durante 35 min para permitir a ligação da fibronectina.
12. Após 35 minutos, adiciona-PBS a cada prato de Petri e armazenar a 4 ° C durante até 2 semanas.

4. Experimentos TRACCÇÃO

1. Meios de célula quente, PBS, e tripsina a 37 ° C em um banho de água.
2. Lavar géis 5x com PBS estéril, aspirar o PBS entre lavagens, e deixe coberto na capa.
3. Adicionar 1 ml de tripsina por cada 25 ^cm2 de frasco contendo células. Após as células são levantadas a partir de frasco, diluir a tripsina com meio celular e contar as células. Com base na área superficial do gel, determinar o número de células necessário por gel para uma densidade final de células de semeadura de 3000 células / cm ^2. Dilui-se ou concentrar-se a suspensão de modo a que 150 uL da mistura de células-media contém este número de células. Alíquota de 150 mL de suspens celularesião positivo para cada gel.
4. Colocar as placas de Petri contendo as células numa incubadora durante 30 min. Em seguida, remove cuidadosamente os pratos de Petri e encher o restante da placa de Petri com meios de comunicação (aproximadamente 2 ml) de tal modo que a superfície do prato é completamente submerso.
5. Colocar as placas de Petri de volta na incubadora até que a aquisição de imagem.
6. Prepare o sistema de aquisição de microscópio e dados para geração de imagens: inserir a objetiva de imersão 40x de água, insira o contraste de interferência diferencial (DIC) Prisma, selecione o mCherry ou filtro fluorescente equivalente, e ligue a câmara ambiental.
7. Quando preparado para imagens, remover uma placa de Petri da incubadora e coloque-o suavemente sobre o estágio do microscópio. Remover a tampa do prato de Petri para DIC imagiologia.
8. Localize uma única célula e capturar uma única imagem da célula na DIC.
9. Sem mover o estágio do microscópio, mude o modo de imagem para fluorescência. Concentre-se nas microesferas fluorescentes e record uma imagem das microesferas.
10. Remover cuidadosamente a partir de meio celular a placa de Petri com uma pipeta e adicionar 0,05% de tripsina-EDTA.
11. Imagem das microesferas sob a célula após as células têm destacado.
12. Velocimetria de imagem (PIV) Use análise de partículas no ImageJ ¹² para calcular o campo de deslocamento devido a forças de celulares.

Resultados

Imagiologia confocal foi utilizada para determinar que os grânulos eram de facto sob a superfície do gel e para quantificar a sua localização precisa dentro da profundidade de gel. As contas fluorescentes de um comprimento de onda diferente do que os que estão dentro do gel foram deixadas a assentar sobre a superfície, e a distância entre as nanopartículas fluorescentes incorporadas e aqueles em que o revestimento foi calculada utilizando um algoritmo de identificação centróide. A localização do cordão na ...

Discussão

Ao utilizar esta técnica, é essencial que a solução do grânulo é adequadamente diluída e os grânulos são escolhidos com base no diâmetro desejado, PA rigidez substrato de gel, e a escala de tamanho dos fenómenos que é explorado na experiência desejada.

O cuidado deve ser tomado ao diluir a solução talão antes de funcionalização top lamínulas de vidro. O espaçamento entre as esferas na superfície do gel pode ser alterada alterando o factor de diluição da solução coloi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES)	Sigma-Aldrich	281778
70% Glutaraldehyde	Polysciences, Inc.	111-30-8
1 M HEPES buffer solution	Sigma-Aldrich	83264
40% Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
2% Bisacrylamide	Sigma-Aldrich	M1533
0.1 µm Fluorescent microspheres (mCherry)	Invitrogen	F8801
Fibronectin, Human, 1 mg	BD Biosciences	354008
Ammonium persulfate	Bio-RAD	161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Bio-RAD	161-0801
Poly-D-lysine	Millipore	A-003-E
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)	Thermo Scientific	22980
N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)	Thermo Scientific	24500
0.05% Trypsin-EDTA (1X)	Life Technologies	25300-054
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
Acrylic acid	Sigma-Aldrich	147230
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M3671
Materials
35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass	In Vitro Scientific	D35-14-1-N
Glass cover slips, 12 mm diam.	Ted Pella, Inc.	26023