Un nuevo método para la localización de cuentas fluorescentes Reporter cerca de la superficie de la célula de la cultura para Microscopía de Fuerza de Tracción

Resumen

Las técnicas tradicionales para la fabricación de poliacrilamida (PA) geles que contienen sondas fluorescentes implican intercalando un gel entre una superficie adherente y un portaobjetos de vidrio. Aquí, mostramos que el revestimiento de esta diapositiva con poli-D-lisina (PDL) y sondas fluorescentes localiza las sondas dentro de 1,6 m de la superficie del gel.

Resumen

Geles de PA han sido utilizados como plataforma para estudiar las fuerzas de tracción de células debido a la facilidad de fabricación y la capacidad de sintonizar sus propiedades elásticas. Cuando el sustrato se recubre con una proteína de la matriz extracelular, las células se adhieren al gel y se aplican fuerzas, haciendo que el gel se deforme. La deformación depende de la tracción celular y las propiedades elásticas del gel. Si se conoce el campo de deformación de la superficie, la superficie de tracción puede calcularse utilizando la teoría de la elasticidad. La deformación del gel se mide comúnmente mediante la incorporación de perlas de marcador fluorescente de manera uniforme en el gel. Las sondas desplazan como el gel se deforma. Las sondas cerca de la superficie del gel se realiza un seguimiento. Los desplazamientos reportados por estas sondas se consideran como desplazamientos de superficie. Se ignoran sus profundidades desde la superficie. Esta suposición introduce un error en la evaluación de la fuerza de tracción. Para la medición precisa de las fuerzas de células, es crítico para la ubicación de las perlas para ser conocida. Hemos desarrolladouna técnica que utiliza la química sencilla para confinar perlas de marcadores fluorescentes, 0,1 y 1 m de diámetro, en geles de PA, dentro de 1,6 m de la superficie. Nos capa de un cubreobjetos con poli-D-lisina (PDL) y perlas fluorescentes. PA solución de gel se intercala después entre el cubreobjetos y una superficie adherente. Las perlas fluorescentes se transfieren a la solución de gel durante el curado. Después de la polimerización, el gel PA contiene perlas fluorescentes en un plano cerca de la superficie del gel.

Introducción

La interacción mecánica de una célula viva con su medio ambiente local comúnmente se ha estudiado el uso de geles PA. Estos sustratos se basan en un protocolo simple, bien caracterizado establecido por Dembo y Wang en 1997 ^1. Una de las principales ventajas de estos sustratos es que su rigidez puede ser sintonizada mediante la modificación de las concentraciones de los componentes específicos de la solución de gel. Esto proporciona una plataforma conveniente para estudiar la interacción células con ambientes de diferentes rigideces. Cuando geles PA se recubren con la matriz extracelular (ECM), las proteínas, las células se adhieren a ellos, la generación de la fuerza. Como resultado de la fuerza de células, el gel se deforma como un cuerpo elástico. Esta deformación depende de la magnitud de la fuerza aplicada por las células y las propiedades elásticas del gel. Varios estudios han empleado geles PA para investigar las fuerzas de tracción celulares.

En una variación de la fabricación de gel de PA, microesferas fluorescentes (bolas) están incrustados turante el gel para cuantificar las fuerzas de tracción de células en geles de diferentes rigideces ^2. Tras la aplicación de la fuerza de células, las bolas se desplazan desde su ubicación inicial después de la deformación gel. El campo de la deformación se mide a partir de los desplazamientos de cuentas individuales. Este campo se utiliza la deformación con la teoría de la elasticidad y las propiedades elásticas del gel para calcular las fuerzas de tracción. Estas mediciones proporcionan una idea de cómo las células detectan mecánicamente e interactuar con su microambiente local de ^3.

En muchos protocolos de fabricación gel ampliamente utilizados PA, las perlas se entremezclan en todo el gel de PA en su estado no polimerizado líquido. Un gel de PA totalmente polimerizado contiene perlas fluorescentes en todo su volumen. Al calcular las fuerzas de tracción de células, la mayoría de los granos cerca de la superficie del gel (interfaz célula-sustrato) son monitoreados. Los desplazamientos de estas perlas se supone que se produzca en la superficie de cultivo celular para la simplicidad en la fuerza CÁLCULOn. Se tiene en cuenta la ubicación real de las perlas dentro de la profundidad del gel. Sin embargo, en un medio elástico (como PA gel), un cordón más cerca de un punto de aplicación de la fuerza se moverá más de un cordón que está más lejos del punto. Por lo tanto, el tratamiento de la desplazamiento de un punto (en la ubicación del talón) distal de la superficie como que los resultados de superficie en una subestimación de tracciones celulares. El grado de error depende de la distancia del talón de la superficie. El error no puede ser estimada sin el conocimiento de la ubicación de la perla.

La necesidad de un método simple para confinar perlas muy cerca de la superficie de cultivo celular ha sido abordada por algunas técnicas. Una forma es aumentar la densidad de los granos a través de todo el gel de tal manera que hay un número suficiente de perlas en el plano focal superior para medir el movimiento muy cerca de la superficie. Otra técnica consiste en la construcción de una cámara de imagen confocal de imágenes de células vivas de tal manera que la luz desólo las perlas en el plano superior más focal se recoge ^4. Un método diferente implica la superposición de una capa extremadamente delgada de gel de PA que contiene perlas en la parte superior de un gel ya polimerizado sin talones ^5. Un inconveniente de cada una de estas técnicas es que no se conoce la ubicación exacta de las perlas dentro del gel. Esto introduce un error en el cálculo del campo de desplazamiento de las perlas, y por lo tanto el cálculo de las fuerzas de células. Otra técnica implica la conjugación de perlas a la superficie superior de un gel de PA ya polimerizado usando sulfo-SANPAH ^6. Esta técnica asegura las perlas son de hecho sólo en la parte superior del gel de PA, pero el grado en que están incrustados en la profundidad del gel es desconocido. Esto podría crear una topografía local para las células, lo que podría alterar el comportamiento de células, como el trabajo previo ha sugerido que las células pueden sentir la fuerza de varias micras de distancia ^7. Recientemente, una técnica para modelando geles PA con 1 m de diámetro fluorescent marcadores de puntos de fibronectina en una matriz regularizado se estableció ^8. En este caso, la profundidad de los marcadores fluorescentes se conoce, y es esencialmente cero, como el patrón de fibronectina se imprime indirectamente sobre la superficie del gel. Sin embargo, este método no proporciona un medio continuo en el que las células pueden adherirse, como la proteína ECM se limita a 1 m de diámetro puntos. Un método para la plena integración de los granos de seguimiento dentro de los geles de PA y confinarlos en una ubicación conocida muy cerca de la superficie aún no se ha establecido.

Aquí, desarrollamos una técnica para limitar sub-micras de perlas fluorescentes de diámetro micras a un plano focal muy cerca de la superficie de cultivo de células dentro PA gel. Un gel se curan típicamente intercalando solución de gel líquido no polimerizado entre dos placas de vidrio. Una de las placas se funcionaliza para que el gel se adhiere fuertemente a él. La otra es sin funcionalizar y se retira después de las curas de gel. Modificamos este vidrio extraíble dorface por recubrimiento con una capa de perlas. Al intercalar el gel líquido entre el funcionalizado y la superficie de cristal bola recubierta, la transferencia de los granos al gel mientras se está curando. Esto limita la distancia de la integración de las perlas 'en el gel dentro de 1,6 m de la superficie. Platos de Petri con fondo de vidrio se utilizan como la superficie adherente en la que se cura el gel. Para formar una superficie superior plana de gel durante la polimerización, un cubreobjetos de vidrio circular se utiliza para intercalar el gel con la placa de Petri con fondo de vidrio. Antes de la fabricación del gel, el cubreobjetos de vidrio superior está recubierta con poli-D-lisina (PDL), produciendo una carga superficial positiva. La PDL se sopla con aire comprimido, y una solución de perlas en agua se deposita sobre los cubreobjetos. Utilizamos microperlas fluorescentes carboxilados, que llevan una carga negativa, e interactuar con la superficie de carga positiva creada por el tratamiento con PDL. Después de soplar la solución del grano de la cubreobjetos con aire comprimido, una sola capa decuentas sigue siendo electrostáticamente acoplan a la hoja de la cubierta seca. El recubrimiento PDL no afecta a la adhesividad de la copa a la superficie del gel, ya que los portaobjetos de vidrio no están dañados y se retira del gel de PA completamente intacto.

Los platos de Petri con fondo de cristal se hacen adherentes mediante tratamiento con 97% 3-aminopropil-trimethoxysliane y 0,5% de glutaraldehído. PA geles de rigideces deseadas se crean mediante la mezcla de concentraciones apropiadas de bisacrilamida y acrilamida a través de un procedimiento estándar ^9. Una gota de la solución de gel se pipeta en la placa de Petri con fondo de cristal. La hoja de la cubierta de vidrio que contiene las perlas se utiliza para intercalar el gel con la placa de Petri. Cuando se cura el gel, la hoja de la cubierta superior se retira dejando las microesferas incrustadas en el gel de PA dentro de 1,6 m desde la superficie.

Protocolo

La fabricación de geles y funcionalización PA de diferente rigidez con microesferas fluorescentes incrustados cerca de la superficie de cultivo de células.

1. funcionalizar los Cubreobjetos Top Glass

1. Limpie cubreobjetos de vidrio (# 1.0, 12 mm diam.) Con agua y jabón, seguido de etanol para eliminar el polvo extraño.
2. Coloque la cubierta de vidrio se desliza en un (es decir, soporte de punta de pipeta) superficie de rallado de tal manera que no se toquen para facilitar la facilidad de interacción con los cubreobjetos.
3. Escudo toda la superficie de la cubierta se desliza con poli-D-lisina (0,1 mg / ml) durante 1 h (Figura 1A).
4. Durante este tiempo, realizar una dilución de 1: 10.000 de la solución coloidal de 0,1 m de diámetro, las microesferas fluorescentes rojas con agua desionizada (DI) agua para obtener una densidad de partícula de aproximadamente 1 microesfera por 20 m ² en la superficie del gel. Ver Figura 2 para los resultados de varias diluciones. Esta dilution puede ser modificado para satisfacer la necesidad de experimentos específicos.
5. Coloque la solución diluida en un baño de agua ultrasónico durante 30 min.
6. Después de 1 hora, utilizar pinzas para levantar cuidadosamente cada hoja de la cubierta y secar con aire. Devolver los cubreobjetos secos a la superficie rallada.
7. Retire la solución coloidal diluida del baño ultrasónico y pipeta de 150 l en cada hoja de la cubierta. Dejar durante 10 min (Figura 1B).
8. Utilice las pinzas para levantar cuidadosamente cada hoja de la cubierta y secar con aire. Volver la cubierta seca se desliza sobre la superficie rallada y almacenar en la oscuridad hasta que la necesite.

2. Preparación de Gel PA Directamente en placas de Petri de vidrio de fondo

1. Placa Precalentar a 100 ° C.
2. Coloque el número deseado de fondo de cristal cajas de Petri (35 mm plato con 14 mm micro-bueno, # 1.0) sobre una superficie plana en una campana para vapores químicos.
3. Cubra la parte de vidrio de cada plato micro-así Petri con 97% de 3-aminopropil-trimethoxysLiane (3-APTES) durante 7 minutos para la activación química. Tome precauciones para evitar el goteo involuntario de los 3-APTES a la superficie del plástico en la placa de Petri para evitar la degradación del poliestireno.
4. Después de 7 min, llenar la cápsula de Petri con agua DI y disponer en el recipiente de residuos.
5. Repita el paso 2.4 3x para cada plato, y luego agitar la placa de Petri para eliminar el exceso de agua. Colocar las cápsulas de Petri en la placa caliente hasta que la parte de vidrio es seco.
6. Retire las placas de Petri de la placa caliente y volver a una superficie plana en una campana para vapores químicos.
7. En una campana de humos químicos, hacer una solución de 0,5% de glutaraldehído y para abarcar la parte de vidrio de cada placa de Petri bien con la solución durante 30 min. Tome precauciones para evitar el goteo involuntario del glutaraldehído a la superficie del plástico en la placa de Petri para evitar la degradación del plástico.
8. Después de 30 min, llenar la cápsula de Petri con agua DI y disponer en un contenedor de residuos para enjuagar y eliminar el glutaraldehyde.
9. Repita el paso 2.4 3x para cada plato, y luego agitar la placa de Petri para eliminar el exceso de agua. Colocar las cápsulas de Petri en la placa caliente hasta que la parte de vidrio es seco.
10. Antes de mezclar los componentes de la solución de gel de PA, mover los portaobjetos de vidrio funcionalizadas en la campana de humos química tal que sean fácilmente accesibles, lo que permite la intercalación rápida del gel con el fondo de cristal placas de Petri después de mezclar la solución de gel.
11. En un tubo de centrífuga de 15 ml, mezclar 40% de bisacrilamida, 2% de acrilamida y ácido acrílico en sucesión inmediata en las concentraciones que se indican en la Tabla 1 (adaptada de protocolo publicado ¹⁰⁾ para lograr la elasticidad de la matriz deseada.
12. Añadir HEPES 100 mM, persulfato de amonio al 10%, y TEMED en cantidades enumeradas en la Tabla 1 correspondientes a la elasticidad matriz deseada para completar la solución de gel.
13. Inmediatamente pipetear 15 l de solución de gel en el centro de la parte de vidriode los platos de Petri.
14. Recoger inmediatamente una hoja de cubierta de vidrio funcionalizado con pinzas.
    1. Voltear la hoja de la cubierta de vidrio sobre tal manera que las perlas fluorescentes son en la toma de contacto lateral con solución de gel.
    2. Coloque la hoja de la cubierta suavemente en la parte superior del gel líquido ahora-PA tal que el lado funcionalizado está en contacto con el gel (Figura 1C). Nota: Para obtener los mejores resultados, una segunda persona se recomienda para el papel de la adición de la hoja de la cubierta con el fin de evitar la posibilidad de polimerización parcial mientras pipeteo solución de gel PA líquido sobre varias placas de Petri.
15. Voltear todos los platos de Petri a ayudar con evitar los efectos de la gravedad sobre nanopartículas fluorescentes de polimerización en niveles inferiores del gel de PA.
16. Espere por lo menos 35 minutos, o hasta que la solución madre de PA gel ha polimerizado visiblemente en su tubo de centrífuga.
17. Voltear las cajas de Petri volver una y llenarlos con PBS para ayudar con la eliminación de la hoja de la cubierta.
18. Cuidadosamente hacer contacto con la parte de vidrio de la placa de Petri y el contorno de la hoja de la cubierta, con unas pinzas para raspar la circunferencia de la hoja de la cubierta. Realice varios ciclos hasta que se desprendió la hoja de la cubierta. Retire la hoja de la cubierta y deseche en un contenedor para desechos cortopunzantes adecuada.
19. Después de eliminar todos los cubres, perlas fluorescentes se han transferido al gel (Figura 1D). Cubra los geles PA completo con PBS, coloque el plato de Petri tapa en cada plato, y se almacenan a 4 ° C.

3. de funcionalización PA gel con fibronectina

1. Preparar las siguientes soluciones premezcladas como se describe en un protocolo establecido ^11: Empapar solución (NaCl 137 mM, 5% (v / v) de glicerol) y tampón 2x conjugación (0,2 M 2 (N morfolino) etanosulfónico (MES), 10 % (v / v) de glicerol, pH 4,5).
2. Utilice una bomba de vacío en una campana biológica para eliminar todo el PBS de los platos con fondo de vidrio que contienen los geles PA.
3. PipetTE remojo solución sobre cada gel tal que el gel esté completamente sumergido. Incubar a temperatura ambiente durante al menos 1 h.
4. 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida caliente (EDC) y N -hydroxysulfosuccinimide (NHS) a temperatura ambiente.
5. Mezclar 10x soluciones de EDC (150 mM, 19 mg / ml en agua DI) y NHS (250 mM, 29 mg / ml en agua DI).
6. Mezclar 1 parte 10x EDC, 1 parte de 10x NHS, 3 partes de agua DI, y 5 partes 2x tampón de conjugación.
7. Utilice una bomba de vacío en una campana biológica para eliminar la solución de remojo. Asegúrese de que todo el fluido se retira de la superficie del gel.
8. Agregue suficiente solución NHS / EDC para cubrir la superficie del gel y llenar el pozo con fondo de cristal de la placa de Petri (150-250 l). Incubar a temperatura ambiente durante 30 min en la oscuridad.
9. Fibronectina Descongelar a temperatura ambiente. Una vez descongelada, la mezcla de agua DI estéril para crear una solución de fibronectina 50 g / ml.
10. Utilice una bomba de vacío en una campana biológica para eliminar las solu NHS / EDCción. Asegúrese de que todo el fluido se retira de la superficie del gel.
11. Añadir 150 l de solución de fibronectina a cada gel. Incubar a temperatura ambiente durante 35 min para permitir la unión de la fibronectina.
12. Después de 35 min, añadir PBS a cada placa de Petri y se almacenan a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas.

4. Experimentos de tracción Fuerza

1. Medios de calentamiento de células, PBS, y tripsina a 37 ° C en un baño de agua.
2. Enjuague geles 5x con PBS estéril, aspirar el PBS entre enjuagues, y dejar tapado en la campana.
3. Añadir 1 ml de tripsina por 25 cm ² a las células del frasco que contiene. Después las células se levantan de matraz, diluir la tripsina con medio celular y contar las células. Basado en el área de superficie del gel, determinar el número de células requeridas por gel para una densidad de siembra de células final de 3000 células / cm ^2. Diluido o concentrado de suspensión de tal manera que 150 l de la mezcla de células-media contiene este número de células. Alícuotas de 150 l de suspens celularesde iones a cada gel.
4. Colocar las cápsulas de Petri que contenían las células en una incubadora durante 30 min. A continuación, retirar con cuidado las placas de Petri y llenar el resto de la placa de Petri con los medios de comunicación (aproximadamente 2 ml) tal que la superficie de la placa está completamente sumergido.
5. Colocar las placas de Petri de nuevo en la incubadora hasta que la adquisición de imágenes.
6. Prepare el sistema de adquisición de microscopio y datos para la imagen: inserte el objetivo de inmersión en agua 40x, inserte el contraste de interferencia diferencial (DIC) de prisma, seleccione el mCherry o filtro fluorescente equivalente, y encienda la cámara ambiental.
7. Cuando se prepara para la imagen, retire una placa de Petri de la incubadora y colóquelo sobre la platina del microscopio. Retire la tapa de la placa de Petri para imágenes DIC.
8. Localice una sola célula y capturar una imagen fija de la celda en la DIC.
9. Sin mover la platina del microscopio, cambiar el modo de imagen a la fluorescencia. Centrarse en las microesferas fluorescentes y recOrd una imagen de las microesferas.
10. Retire cuidadosamente los medios de comunicación célula a partir de la placa de Petri con una pipeta y añadir 0,05% de tripsina-EDTA.
11. Imagen de las microesferas bajo la celda después de que las células han desprendido.
12. El uso de imágenes de partículas velocimetría (PIV) Análisis en ImageJ ¹² para calcular el campo de desplazamientos debido a las fuerzas celulares.

Resultados

Confocal de imágenes se utilizó para determinar que las perlas eran de hecho por debajo de la superficie del gel y para cuantificar su ubicación precisa dentro de la profundidad de gel. Perlas fluorescentes de una longitud de onda diferente que aquellos en el interior del gel se dejaron sedimentar en la superficie, y la distancia entre las nanopartículas fluorescentes embebidos y los de la superficie se calculó utilizando un algoritmo de identificación centroide. La ubicación del talón sobre la superficie del ge...

Discusión

Cuando se utiliza esta técnica, es esencial que la solución de bolas se diluye apropiadamente y las perlas se eligen basándose en diámetro deseado, PA rigidez sustrato gel, y la escala de tamaño de los fenómenos que se explora en el experimento deseado.

Se debe tener cuidado al diluir la solución del grano antes de la funcionalización de los mejores cubreobjetos de vidrio. La separación entre los granos en la superficie del gel puede ser alterado cambiando el factor de dilución de ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES)	Sigma-Aldrich	281778
70% Glutaraldehyde	Polysciences, Inc.	111-30-8
1 M HEPES buffer solution	Sigma-Aldrich	83264
40% Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
2% Bisacrylamide	Sigma-Aldrich	M1533
0.1 µm Fluorescent microspheres (mCherry)	Invitrogen	F8801
Fibronectin, Human, 1 mg	BD Biosciences	354008
Ammonium persulfate	Bio-RAD	161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Bio-RAD	161-0801
Poly-D-lysine	Millipore	A-003-E
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)	Thermo Scientific	22980
N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)	Thermo Scientific	24500
0.05% Trypsin-EDTA (1X)	Life Technologies	25300-054
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
Acrylic acid	Sigma-Aldrich	147230
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M3671
Materials
35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass	In Vitro Scientific	D35-14-1-N
Glass cover slips, 12 mm diam.	Ted Pella, Inc.	26023