Çekme Kuvveti Mikroskopi Hücre Kültürü Yüzey civarında yerelleştirme raportör flöresan Beads için Yeni Bir Yöntem

Özet

Floresan probları içeren poliakrilamid (PA) jelleri imal edilmesi için geleneksel teknikler yapışkan bir yüzeyi ve bir cam kayar arasında sandviç tarzı bir jel barındırır. Burada, poli-D-lisin (PDL) ve fluoresan problar, bu slayt kaplama jel yüzeyinden 1.6 um olan probları lokalize olduğunu göstermektedir.

Özet

Pensilvanya jeller uzun imalat ve nağme elastik özelliklerini yeteneği kolaylığı nedeniyle hücre çekiş kuvvetleri incelemek için bir platform olarak kullanılmıştır. Alt-tabaka, bir hücre dışı matris proteini ile kaplanmıştır zaman hücreler, jele yapışmayan ve jel deforme neden kuvvetler uygulanır. Bu deformasyon, hücre çekiş ve jelin elastik özelliklerine bağlıdır. Yüzeyinin deformasyonu alanı biliniyorsa, yüzey çekme esnekliği teorisi kullanılarak hesaplanabilir. Jel deformasyon genellikle homojen jel içine fluoresan işaretleyici boncuklar içine gömülmesiyle ölçülür. Jel deforme olarak probları değiştirmesine neden olmaktadır. Jel yüzeyine yakın sondalar izlenir. Bu problar tarafından bildirilen değiştirmeler yüzey değiştirmeler olarak kabul edilir. Yüzeyden Bunların derinlikleri göz ardı edilir. Bu varsayım çekiş kuvveti değerlendirmelerde hata tanıtır. Boncukların yer bilinmesi için hücre güçlerinin hassas ölçümü için, bu önemlidir. Biz geliştirdikyüzeyinin 1.6 um olan PA jellerinde, floresan markörü boncuklar, çapı 0.1 ile 1 um sınırlandırmak için basit kimyası kullanan bir teknik sunmaktır. Bu kat, poli-D-lisin (PDL) flüoresan boncuklar ile bir lamel. PA jel çözeltisi, sonra da lamel ve yapışkan bir yüzeyi arasında yer alır. Floresan boncuk kür sırasında jel çözeltisine transfer. Polimerizasyondan sonra, PA jel jel yüzeyine yakın bir düzlem üzerinde floresan boncuklar içerir.

Giriş

Yerel çevre ile yaşayan hücrenin mekanik etkileşim yaygın Pensilvanya jeller kullanılarak incelenmiştir. Bu alt-tabakalar, bu alt-tabakaların en önemli avantajlarından ^1. Biri 1997 yılında Dembo ve Wang tarafından kurulan basit, iyi karakterize edilmiş protokolüne dayanan kendi sertliği jel solüsyonunun özel bileşenlerin konsantrasyonlarını değiştirerek ayarlanabilir olmasıdır. Bu, farklı katılıklarla ortamlarda hücrelerin etkileşimi incelemek için bir arzu platform sağlar. PA jeller, hücre dışı matris (ECM), proteinleri ile kaplanmış olduğunu zaman, hücreler kuvveti oluşturarak, bunlara yapışır. Hücre kuvvetin sonucu olarak, jel elastik bir gövde olarak deforme eder. Bu deformasyon, hücrelerin ve jelin elastik özellikleri tarafından uygulanan kuvvetin büyüklüğüne bağlıdır. Çeşitli çalışmalarda hücresel çekiş kuvvetleri araştırmak PA jelleri istihdam var.

PA jel imalat Bir varyasyonda, floresan mikrosferler (boncuk) t gömülürfarklı bükülmezliklerde ² jelleri üzerinde çekme kuvvetlerinin hücre miktarını belirlemek için jel hroughout. Hücre kuvvet başvuru üzerine, boncuk jel izleyen deformasyon onların ilk konumdan yerinden. Deformasyon alan tek tek kordonların ölçülür. Bu deformasyon alan esneklik teorisi ile çekme kuvvetlerinin hesaplanması için jelin elastik özellikleri kullanılmaktadır. Bu ölçümler hücreler mekanik duygusu ve kendi yerel mikroçevresinin ³ ile etkileşim olarak nasıl fikir verir.

Yaygın olarak kullanılan bir çok Pensilvanya jel üretim protokolleri, haplar, sıvı, polimerize edilmemiş halde PA, jel boyunca birbirine karıştırılır. Tam polimerleştirilmiş jel, Pensilvanya hacmi boyunca flüoresan boncuklar içerir. Hücre çekme kuvvetlerinin işlem olduğunda, jel yüzeyi (hücre alt-tabaka arayüzü) yakınındaki en boncuklar izlenir. Bu tür boncukların değiştirmeler kuvvet calculatio basitlik için hücre kültürü yüzeyinde meydana varsayılmaktadırn. Jelin derinliğinde boncukların gerçek konumu göz ardı edilir. Bununla birlikte, elastik bir ortamda (örneğin, Pensilvanya jel gibi), bir kuvvet tatbiki bir noktaya yakın bir kordon daha uzak bir noktadan bir boncuk daha hareket eder. Böylece, hücresel traksiyonların düşük hesaplanmasına yüzey sonuçlara edilene yüzeyden uzak (boncuk yerde) bir noktanın yer değiştirmesi muamele edilmesini içerir. Hatanın derecesi yüzeyinden kordonun uzaklığa bağlıdır. Hata kordonun konumu bilgisi olmadan tahmin edilemez.

Çok hücre kültürü yüzeye yakın boncuk sınırlandırmak için basit bir yönteme ihtiyaç birkaç teknikleri ile ele alınmıştır. Araçlardan biri, çok yüzeye yakın hareketini ölçmek için üst odak düzlemi boncuk yeterli sayıda olacak şekilde bütün jel boyunca boncuk yoğunluğunu artırmaktır. Bir başka teknik, ışık o canlı hücre görüntüleme için bir konfokal görüntüleme odası inşa içerirüst en odak düzlemi sadece boncuk ⁴ toplanır. Farklı bir yöntem taneleri ⁵ olmayan bir önceden polimerize edilmiş jelinin üzerine boncuklar içeren PA jel son derece ince bir katmanı üzerinde içerir. Bu tekniklerin bir dezavantajı, her birinin, jel içindeki boncukların hassas konum bilinmemektedir olmasıdır. Bu boncuklar yer değiştirme alanı ve bu yüzden, hücre kuvvetlerin hesaplanması hesaplamaya dahil hata olarak yansır. Bir başka teknik, Sülfo-SANPAH ⁶ kullanılarak hali hazırda polimerize PA jel üst yüzeyine boncuk konjugasyon içerir. Bu teknik, tek taneler PA jel üzerinde gerçekten de sağlar, fakat jelin derinlikte gömülü ne ölçüde bilinmemektedir. Önce iş hücreleri gücü birkaç mikron uzaklıkta ⁷ hissedebiliyorum önerdi gibi bu potansiyel, hücre davranışını değiştirebilir hücreler, bir yerel topografya oluşturabilirsiniz. Son zamanlarda, 1 mikron çaplı f PA jeller desenlendirme için bir tekniktirdüzenlilestirilmis dizi luorescent fibronektin nokta belirteçler ⁸ kurulmuştur. Bu durumda, flüoresan işaretler derinliği bilinir ve fibronektin model dolaylı jel yüzey üzerine baskı gibi, esas olarak sıfırdır. Bununla birlikte, bu yöntem, ECM protein 1 mikron çaplı noktalar, olduğu gibi hücreler, ekleyebilir üzerinde sürekli bir ortam sağlamaz. Tamamen yüzeye çok yakın bilinen bir konuma Pensilvanya jeller içinde izci boncuk entegre ve hapsedilmesini için bir yöntem henüz kurulamamıştır.

Burada, biz çok Pensilvanya jel içindeki hücre kültürü yüzeye yakın bir odak düzlemine mikron çaplı floresan boncuk alt-mikron sınırlamak için bir yöntem geliştirmek. Bir jel, genellikle, iki cam levha arasında polimerize edilmemiş sıvı jel çözeltisi sandöviç muamele edilmektedir. Jel şiddetle bağlıdır, böylece plakaların bir işlevlendirilmektedir. Diğer fonksiyonelleştirilmemiş ve jel sertleşmeden sonra çıkartılır. Biz bu çıkarılabilir cam su değiştirmekboncuklar bir tabaka ile kaplamak suretiyle rface. Fonksiyonalize ve boncuk kaplı cam yüzeyi arasındaki sıvı jel sandviçleyerek sonra, jel boncukları transfer işleminin sertleştirme sırasında. Bu yüzey 1.6 um olan jel içine Tanelerin entegrasyon mesafeyi sınırlar. Cam alt Petri kapları jel tedavi edildiği yapışık yüzeyi olarak kullanılır. Polimerizasyon sırasında düz bir üst yüzey jel oluşturmak için, bir dairesel cam lamel sandviç etmek için, cam alt-Petri kabı ile jel kullanılır. Jel üretiminden önce, üst cam kapak kayma bir yüzey yükü, sonuçta poli-D-lisin (PDL) ile kaplanır. PDL basınçlı hava ile üflenerek uzaklaştırıldı edilir ve su içinde boncuk çözeltisi kapak slipleri üzerinde bırakılır. Bu, negatif bir yük taşıyan karboksile floresan, mikro-boncuklar, uygulanması ve PDL ile işlenerek oluşturulan pozitif yüklü yüzey ile etkileşime girer. Basınçlı hava, tek bir tabaka ile lamel kapalı boncuk çözeltisi üfleme sonraboncuklar elektrostatik kuru kapak kayma birleştiğinde kalır. Cam slaytlar, hasarsız ve tamamen sağlam PA jelden çıkarıldı olarak PDL kaplama, jel yüzeyine camın yapışkanlığını etkilemez.

Cam alt Petri kutuları 97% 3-aminopropil-trimethoxysliane ve% 0.5 glutaraldehid ile işlenerek yapışkan yapılır. İstenen katılıklarının Pensilvanya jeller standart bir prosedür ile ⁹ bisakrilamid akrilamid uygun konsantrasyonlarda karıştırılmasıyla oluşturulur. Jel çözeltisinin bir damlacık cam alt Petri kabı üzerine pipetlenir. Boncuklar ihtiva eden bir cam kapak kılıfı sandviç etmek için Petri kabı ile jel kullanılır. Jel tedavi edildiğinde, üst kapak kayma yüzeyinden 1.6 um olan PA jel gömülü boncuk bırakarak kaldırılır.

Protokol

Imalatı ve hücre kültürü yüzeye yakın fluoresan gömülü mikrosferler ile katılıkları değişen PA jeller fonksiyonalize.

1. Üst cam kapak slipleri işlevselleştirici

1. Temiz cam kapak slipleri (# 1.0, 12 mm çap.) Sabun ve su ile, ardından da etanol ile yabancı tozunu alın.
2. Yer cam kapak onlar lamelleri ile etkileşim kolaylığı kolaylaştırmak için değmiyor böyle bir rendelenmiş yüzey (yani pipet tutucu) üzerinde kayıyor.
3. Kat, kapağın tüm yüzey poli-D-Lizin 1 saat (Şekil 1A) (0.1 mg / ml) ile kayar.
4. Bu süre sırasında, 1 gerçekleştirmek: 0.1 um çaplı kolloid solüsyonu 10,000 seyreltme, deiyonize (Dİ) su ile mikro-kırmızı flöresanlı jel yüzeyi üzerinde 20 mikron ² başına yaklaşık 1 mikro-partikül yoğunluğu elde edildi. Çeşitli dilüsyonları sonuçları için Şekil 2'ye bakınız. Bu dilution Özel deneylerin ihtiyacını karşılamak üzere değiştirilebilir.
5. 30 dakika boyunca ultrasonik su banyosu içinde seyreltilmiş çözelti yerleştirin.
6. 1 saat sonra, dikkatle her kapak kayma kaldırın ve hava ile kuru darbe için cımbız kullanın. Rendelenmiş yüzeye kuru bir örtü fişleri dönün.
7. Her kapak kayma üzerine ultrasonik banyo ve pipetle 150 ul gelen seyreltilmiş kolloid çözüm çıkarın. 10 dakika (Şekil 1B) için bırakın.
8. Dikkatle her kapak kayma kaldırın ve hava ile kuru darbe için cımbız kullanın. Kullanıma hazır olana kadar kuru bir örtü karanlıkta rendelenmiş yüzey ve mağaza fişleri dönün.

Doğrudan Glass Bottom Petri Yemekleri PA Jel hazırlanması 2.

1. 100 ° C'ye kadar ön ısıtma ocak gözü.
2. Cam alt Petri yemekleri istenilen sayıda yatırın (14 mm ile 35 mm çanak mikro-iyi, # 1.0), bir kimyasal davlumbaz düz bir yüzeye yerleştirin.
3. % 97 3-aminopropil-trimethoxys her Petri kabı, mikro oyuk cam bölümünü kapsarliane kimyasal aktivasyon için 7 dakika boyunca (3-APTES'le). Polistiren zarar görmesini önlemek için bir Petri kabındaki plastik yüzeyine 3-APTES yersiz damlamasını önlemek için dikkat ediniz.
4. 7 dakika sonra, DI su ile Petri doldurmak ve atık kabı içine atın.
5. Daha sonra tekrarlayın için her yemeğin adım 2.4 3x ve ekstra su çıkarmak için Petri kabı sallayın. Cam kısım kuruyana kadar sıcak bir plaka üzerinde Petri kapları yerleştirin.
6. Sıcak plakadan Petri kapları çıkarın ve kimyasal bir davlumbaz olarak düz bir yüzeye döner.
7. Kimyasal bir davlumbaz olarak,% 0.5 glutaraldehid ile bir çözelti yapmak ve de 30 dakika için çözelti ile her bir Petri kabı cam bölümünü kapsar. Plastik zarar görmesini önlemek için bir Petri kabındaki plastik yüzeyine glutaraldehit yersiz damlamasını önlemek için dikkat ediniz.
8. 30 dakika sonra, DI su ile Petri doldurmak ve durulayın atık kabına atın ve glutarald çıkarınehyde.
9. Daha sonra tekrarlayın için her yemeğin adım 2.4 3x ve ekstra su çıkarmak için Petri kabı sallayın. Cam kısım kuruyana kadar sıcak bir plaka üzerinde Petri kapları yerleştirin.
10. PA jel solüsyonunun bileşenlerin karıştırılması önce, cam alt ile jel hızlı sandviçlenmesine yönelik sağlayan, kolaylıkla ulaşılabilir olacak şekilde kimyasal bir davlumbaz içine fonksiyonalize cam slaytlar hareket jel çözelti karıştırıldıktan sonra Petri kapları.
11. 15 ml'lik bir santrifüj tüpü, Tablo 1 de listelenen konsantrasyonlarda hemen arka arkaya% 40 bisakrilamid, 2% akrilamid ve akrilik asit karışımı, istenen matris esnekliğini elde etmek için ⁽¹⁰ yayınlanan bir protokolün uyarlanmıştır).
12. Jel tamamlamak üzere solüsyon arzu edilen matris elastiklik tekabül eden Tablo 1'de belirtilen miktarlarda, 100 mM HEPES,% 10 amonyum persülfat ve TEMED ilave edin.
13. Hemen cam kısmın merkezi üzerine jel solüsyonu 15 ul pipetpetri kutularının.
14. Hemen cımbız ile bir fonksiyonlaşmış cam kapak kayma pick up.
    1. Floresan boncuk jel çözeltisi ile yan yapma temas olduğu gibi üzerinde cam kapak kayma çevirin.
    2. Yavaşça fonksiyonalize yan jel (Şekil 1C) ile temas içinde olduğu şekilde, artık sıvı PA jelinin üzerine kapak kayma yerleştirin. Not: En iyi sonuçlar için, ikinci bir kişi birden fazla Petri kapları üzerine sıvı Pensilvanya jel çözüm pipetleme ise kısmi polimerizasyon olasılığını önlemek için kapak kayma ekleme rolü için tavsiye edilir.
15. PA jel düşük seviyelerine polimerleştirerek floresan nano partiküller yerçekimi etkileri kaçınarak yardımcı olmak için tüm Petri kapları ters çevirin.
16. PA jel stok çözelti görsel olarak santrifüj tüpü içinde polimerize en az 35 dakika boyunca, ya da kadar bekleyin.
17. Üzerinde geri Petri yemekleri Flip ve kapak kayma kaldırılması ile yardımcı olmak için PBS ile onları doldurmak.
18. Dikkatle kapak kayma çevresini kazımak için cımbız kullanarak, Petri kabı cam kısmı ve kapak kayma hatları ile temas. Kapak kayma yerinden kadar birkaç çevrimi gerçekleştirin. Kapak kayma çıkarın ve uygun bir kavuz çöp bidonuna atın.
19. Tüm kapak slipi üzerinde ayrılmasından sonra, floresan boncuk jel (Şekil 1D) transfer olacaktır. Tamamen PBS ile PA jeller Kapak her yemeğin Petri kabı kapağı yerleştirin ve 4 ° C'de saklayın.

3. Fibronektin PA jel işlevselleştirilmesi

1. Kurulu bir protokol ^11'de tarif edildiği gibi, aşağıdaki önceden hazırlanmış solüsyon hazırlayın: solüsyonu ıslatın (137 mM NaCI,% 5 (h / h) gliserol) ile karıştırılır ve 2 x konjugasyon tamponu (0.2 M 2-(N-morfolino) etansülfonik asit (MES), 10 % (h / h) gliserol, pH 4.5).
2. PA jelleri içeren cam-alt yemekler tüm PBS kaldırmak için biyolojik bir ocak içinde bir vakum pompası kullanılır.
3. Pipetleyinte jel tamamen daldırılır şekilde, her jeli üzerine çözelti ıslatın. En az 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
4. Sıcak 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] karbodiimid hidroklorür (EDC) ve oda sıcaklığında N -hydroxysulfosuccinimide (NHS) içerir.
5. EDC 10x çözeltileri (150 mM deiyonize suda 19 mg / ml) ve NHS (250 mM deiyonize suda 29 mg / ml) ile karıştırın.
6. 1 bölümü 10x EDC, 1 kısım 10x NHS, 3 parça DI su ve 5 parça 2x konjugasyon tampon karıştırın.
7. Emmek çözeltinin çıkarılması için biyolojik bir ocak içinde bir vakum pompası kullanılır. Tüm akışkan jel yüzeyden emin olun.
8. Jel yüzeyini kaplayan ve Petri kabına (150-250 ul) cam alt kuyu doldurmak için yeterli NHS / EDC çözeltisi ekleyin. Karanlıkta 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
9. Oda sıcaklığında erimeye fibronektin. Çözüldükten sonra, 50 ug / ml fibronektin çözüm oluşturmak için steril distile su karıştırın.
10. NHS / EDC Solu kaldırmak için biyolojik bir ocak içinde bir vakum pompası kullanınyon. Tüm akışkan jel yüzeyden emin olun.
11. Her jel için fibronektin çözeltisi 150 ul ilave edin. Fibronektin bağlanmasına olanak sağlamak için 35 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
12. 35 dakika sonra, 2 haftaya kadar 4 ° C 'de her bir Petri kabı ve saklamak için PBS ekleyin.

4. Çekiş Kuvveti Deneyleri

1. Bir su banyosunda ılık bir ortam hücre PBS ve 37 ° C tripsin.
2. Jeller durular arasında PBS aspire, steril PBS ile 5 kata, ve kaputun kaplı bırakın durulayın.
3. Şişe içeren hücrelere 1 ml tripsin ² cm başına 25 ekleyin. Hücreler şişe kaldırdı sonra, hücre medya ile tripsin sulandırmak ve hücreleri saymak. Jel yüzey alanına bağlı olarak, / ^cm2 3000 hücrelerinin bir nihai hücre yoğunluğu için tohumlama jel başına gerekli olan hücre sayısının belirlenmesi. Seyreltik veya hücreye ortam karışımından 150 ul hücre, bu sayı içerir şekilde süspansiyon konsantre edilir. Hücre Suspens alikosu 150 ulHer jel üzerine iyon.
4. 30 dakika için bir kuluçka makinesi içinde hücreleri içeren Petri kapları yerleştirin. Daha sonra dikkatli bir şekilde Petri kapları kaldırmak ve çanak şeklinde ve yüzeyleri tamamen batırılır ortam (yaklaşık 2 mi) ile Petri kabı kalan doldurun.
5. Görüntü alımı kadar inkübatör Petri kapları geri yerleştirin.
6. , Diferansiyel Girişim Kontrast (DIC) prizma takın, 40x suya daldırma hedefi eklemek mCherry veya eşdeğer floresan filtreyi seçin ve çevre odasında açın: görüntüleme için mikroskop ve veri toplama sistemi hazırlayın.
7. Görüntüleme için hazırlandığı zaman, inkübatör bir Petri kabı çıkarın ve mikroskop sahnede yavaşça yerleştirin. DIC görüntüleme için Petri kabı kapağını çıkarın.
8. Tek bir hücre bulmak ve DIC hücrenin tek bir hareketsiz görüntü yakalamak.
9. Mikroskop sahne hareket ettirmeden, floresan görüntüleme moduna geçiş. Floresan-küreler ve rec odaklanmaMikro-kürelerin, bir görüntü Kat.
10. Dikkatlice bir pipet ile Petri kabı, hücre ortamını çıkarın ve% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin.
11. Görüntü sonra hücreler hücre altında mikro-müstakil.
12. ImageJ ¹² Kullanım parçacık görüntü velosimetri (PIV) analizi nedeniyle hücresel kuvvetleri deplasman alanını hesaplamak için.

Sonuçlar

Konfokal görüntüleme boncuklar, jel yüzeyinin altına gerçekten olduğunu tespit etmek ve jel derinliği içindeki tam yerini belirlemek için kullanıldı. Jelin içindeki edilenlerden daha farklı bir dalga boyunda floresan taneler yüzeyinde yerleşmeye bırakıldı ve gömülü floresan, nanopartiküller ve yüzeyi üzerinde bu arasındaki mesafenin bir ağırlık merkezi tanıma algoritması kullanılarak hesaplanmıştır. Jel yüzeyi üzerindeki kordonun konumu jel-hücrelerinin yüzeyine yapışması üzeri...

Tartışmalar

Bu teknik kullanıldığında, bu çözelti, uygun şekilde seyreltilmiş boncuk ve tanecikler arzu edilen çapına göre seçilir esastır, Pensilvanya jel tabaka sertliği ve arzu edilen deneyde incelenmektedir fenomenlerin boyut ölçeği.

Üst cam kapak slipi üzerinde karıştırılmıştır fonksiyonalize önce boncuk seyreltilmesi zaman dikkatli alınmalıdır. Jel yüzeyinde halkalar arasında aralık koloit çözelti seyreltme faktörü değiştirerek değiştirilebilir. Çok fazla ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES)	Sigma-Aldrich	281778
70% Glutaraldehyde	Polysciences, Inc.	111-30-8
1 M HEPES buffer solution	Sigma-Aldrich	83264
40% Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
2% Bisacrylamide	Sigma-Aldrich	M1533
0.1 µm Fluorescent microspheres (mCherry)	Invitrogen	F8801
Fibronectin, Human, 1 mg	BD Biosciences	354008
Ammonium persulfate	Bio-RAD	161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Bio-RAD	161-0801
Poly-D-lysine	Millipore	A-003-E
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)	Thermo Scientific	22980
N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)	Thermo Scientific	24500
0.05% Trypsin-EDTA (1X)	Life Technologies	25300-054
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
Acrylic acid	Sigma-Aldrich	147230
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M3671
Materials
35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass	In Vitro Scientific	D35-14-1-N
Glass cover slips, 12 mm diam.	Ted Pella, Inc.	26023