新方法本地化记者荧光珠近细胞培养表面的牵引力显微镜

摘要

制造含有荧光探针聚丙烯酰胺（PA）的凝胶传统技术涉及的夹附着表面和玻璃载片之间的硅胶。这里，我们表明，涂敷该滑动用聚-D-赖氨酸（PDL）和荧光探针的局部化的探针内1.6微米的凝胶表面。

摘要

PA的凝胶已经长期被用作研究，由于容易制造和能力调整自己的弹性性质的细胞牵引力的平台。当基片涂覆有细胞外基质蛋白，细胞粘附在凝胶并施加力，使所述凝胶变形。变形取决于细胞的牵引力和凝胶的弹性性能。如果该表面的变形场是已知的，表面的牵引力可使用弹性理论计算。凝胶变形被嵌入荧光标记物珠粒均匀地进入凝胶常用的测量。探针置换的凝胶变形。凝胶的表面附近的探针被跟踪。报告的这些探头的位移被认为是表面的位移。从表面的深度将被忽略。这种假设在介绍牵引力评估错误。用于细胞力精确的测量，重要的是对于被称为珠的位置。我们已经开发一种技术，其利用简单的化学反应来限制荧光标记珠，0.1和1微米的直径，在PA的凝胶，在1.6微米的表面。我们涂上聚-D-赖氨酸（PDL）和荧光珠盖玻片。 PA凝胶溶液，然后在盖玻片和粘附表面之间。荧光珠在固化过程中转移到凝胶溶液。聚合后，在PA凝胶包含在一个平面上接近凝胶表面荧光珠。

引言

活细胞与当地环境中的机械作用已普遍被使用的PA凝胶的研究。这些底物依赖于德姆博和王1997年^1，其中之一衬底的主要优点建立一个简单的，良好表征的协议是，它们的刚度可通过改变凝胶溶液的特定成分的浓度进行调整。这提供了一个理想的平台来研究细胞的不同刚度的环境互动。当PA凝胶涂覆有细胞外基质（ECM）蛋白，细胞粘附到它们，从而产生动力。作为细胞力的结果，所述凝胶变形作为弹性体。该变形取决于由细胞和凝胶的弹性性能所施加的力的大小。各种研究都采用PA凝胶研究细胞牵引力。

在PA的凝胶制造一种变体中，荧光微球（珠）被嵌入吨hroughout凝胶定量细胞牵引力上刚性不同²的凝胶。当细胞施力，珠取代从以下凝胶变形的初始位置。变形场是从个体压边位移的测量。这个变形场是利用具有弹性的理论和凝胶来计算牵引力的弹性性能。这些测量提供洞察力，如何细胞的机械感，并与他们的局部微环境³交互。

在许多广泛使用的PA硅胶制作协议，将珠混杂在整个液态，未聚合状态的PA凝胶。一个完全聚合的PA凝胶含有在其整个体积荧光珠。当计算单元的牵引力，珠粒最凝胶表面（细胞 - 基底界面）附近进行监视。这些珠的位移被假设为发生在细胞培养表面为简单起见，在该力计算中ñ。的凝胶的深度范围内的珠粒的实际位置被忽略。然而，在弹性介质（如PA凝胶），珠接近的点的力的应用将移动超过胎圈即进一步远离点。因此，治疗的一个点的位移（在胎圈的位置）从表面作为在蜂窝牵引力的低估的表面结果远侧。错误的程度取决于从表面的胎圈之间的距离。不能在没有加强筋的位置的知识，估计误差。

需要有一个简单的方法来限制​​珠非常接近的细胞培养表面已经解决了一些技巧。一种方法是增加的小珠的密度在整个凝胶，使得有足够数量的小珠在顶端焦平面测量表面非常接近运动。另一项技术涉及建筑共聚焦成像室活细胞成像，使得从光仅在最上面的焦平面珠被收集^4。不同的方法，包括覆盖一层极薄包含在已经聚合凝胶珠顶无珠^5个 PA凝胶。每一个这些技术中的一个缺点是，在小珠的凝胶内的精确位置是未知的。这引入了误差成珠的位移场，因此细胞力的计算的计算。另一种技术涉及的珠偶联到用磺基SANPAH ⁶的已聚合的PA凝胶的顶部表面。这种技术保证了珠确实只对PA的凝胶的顶部，但是它们所嵌入在凝胶中的深度的程度是未知的。这可能会创造一个局部地形的细胞，这可能会改变细胞的行为，因为以前的工作已经表明，细胞可以感知力几微米的距离^7。最近，图案PA凝胶，1微米直径为f的技巧在正规化阵列luorescent纤连蛋白点标记成立^8。在这种情况下，荧光标记物的深度是已知的，并且基本上是零，如纤连蛋白图案被间接地印刷在凝胶表面上。然而，这种方法不能提供连续的环境在其上的细胞可以附着，作为ECM的蛋白被限制为1微米直径的圆点。一种充分整合追踪珠PA凝胶内，并限制他们到一个已知位置的表面非常接近的方法还有待建立。

在这里，我们开发了一种技术，亚微米到微米直径的荧光珠限制为焦平面非常接近的PA凝胶内的细胞培养表面。凝胶通常是固化夹在2片玻璃板之间的未聚合的液体凝胶溶液。一板的被官能化，使得该凝胶牢固地粘附到它。另一种是未官能化的凝胶固化后除去。我们修改这个可移动的玻璃苏通过用一层珠涂布它rface。在夹着官能和胎圈包被的玻璃表面之间的液体凝胶，珠转移到凝胶，同时它被固化。这限制了小珠"一体化的距离进入内1.6微米的表面的凝胶。玻璃底培养皿被用作在其上的凝胶进行固化的粘合表面。以形成聚合期间平顶凝胶表面，圆形盖玻片用于夹心与玻璃底培养皿中的凝胶。之前的凝胶制造，顶部玻璃盖片上涂有聚-D-赖氨酸（PDL），产生一个正的表面电荷。 PDL中与压缩空气吹走，并且珠在水中的溶液被沉积在盖玻片上。我们利用羧化荧光微球，其带有负电荷，并与通过用PDL创建的带正电荷的表面相互作用。用压缩空气，单层吹珠溶液脱盖玻片后珠保持静电耦合到干盖玻片。 PDL中涂层不影响玻璃的凝胶表面的胶粘性，因为载玻片未损坏并从PA凝胶充分完整移除。

在玻璃底培养皿是由粘附通过治疗97％3-氨丙基trimethoxysliane和0.5％戊二醛。所需的刚性PA的凝胶是由通过标准程序⁹混合适当的双丙烯酰胺和丙烯酰胺的含量产生。凝胶溶液的液滴被吸至玻璃底培养皿中。含珠的玻璃盖片是用来夹持与培养皿的凝胶。当凝胶固化时，顶盖滑动除去留下嵌入在PA的凝胶内为1.6μm的表面上的小珠。

研究方案

制造和官能化变刚度与嵌入的细胞培养表面附近的荧光微球的PA凝胶。

1，功能化的顶级玻璃盖玻片

1. 清洁玻璃盖玻片（＃1.0，​​12毫米直径），用肥皂和水洗涤，然后用乙醇除去多余的灰尘。
2. 地方玻璃盖玻片Â磨碎的表面（ 即移液管尖端支架）上，使得它们不接触，以便易于与盖玻片相互作用。
3. 外套盖的整个表面上滑动和聚-D-赖氨酸（0.1毫克/毫升）1小时（ 图1A）。
4. 在此期间，执行1:10,000稀释0.1微米直径的胶体溶液中，红色荧光微球与去离子（DI）水，得到的每20 ^平方微米约1微凝胶上表面上的粒子密度。参见图2对不同稀释度的结果。这dilution可以进行修改，以满足特定的实验的需要。
5. 放置在超声波水浴中稀释的溶液30分钟。
6. 1小时后，用镊子小心地将每个盖玻片，并吹干空气。返回干盖玻片的碎面。
7. 拆下超声波浴和吸管150微升稀释的胶体溶液到每个盖玻片。离开10分钟（ 图1B）。
8. 用镊子小心地将每个盖玻片，并吹干空气。返回干盖玻片的碎面店在黑暗中待用。

2，准备PA的凝胶直接在玻璃底培养皿

1. 预热加热板至100℃。
2. 铺陈的玻璃底培养皿所需的数字（35毫米盘14 mm微型孔，＃1.0）在一个平面上的通风橱。
3. 覆盖每个培养皿中微孔的97％3 - 氨基丙基 - trimethoxys玻璃部藤本植物（3-APTES）进行7分钟进行化学活化。采取谨慎，以避免在3 APTES到塑料中的陪替氏培养皿的表面的无意滴落，以避免在聚苯乙烯的降解。
4. 7分钟后，补培养皿用DI水和处置入废物容器。
5. 对每道菜重复步骤2.4的3倍，然后摇晃培养皿中，除去多余的水分。将培养皿在热板上直到玻璃部分是干燥的。
6. 从热点板块中取出培养皿中，并返回到一个平坦的表面在通风橱。
7. 在化学通风橱中，使0.5％的戊二醛溶液，以及用30分钟将溶液覆盖每个培养皿的玻璃部分。采取谨慎，以避免戊二醛到塑料中的陪替氏培养皿的表面的无意滴落，以避免塑料的降解。
8. 30分钟后，补培养皿用DI水和处置入废物容器，以冲洗和去除glutaraldehyde。
9. 对每道菜重复步骤2.4的3倍，然后摇晃培养皿中，除去多余的水分。将培养皿在热板上直到玻璃部分是干燥的。
10. 前混合该PA凝胶溶液的组分中，将功能化的载玻片放入化学通风橱中，使得它们容易获得，允许凝胶与玻璃底部的快速夹持混合凝胶溶液后的培养皿中。
11. 在一个15毫升的离心管中，混合40％双丙烯酰胺，2％的丙烯酰胺和丙烯酸中以表1中列出的浓度直接连续地（改编自发布协议^10），以实现期望的基质的弹性。
12. 添加100mM的HEPES，10％过硫酸铵，和TEMED在表1中列出的量对应于所希望的基质的弹性来完成凝胶溶液。
13. 立即吸取15微升凝胶溶液涂布在玻璃部分的中心的培养皿。
14. 马上拿起官能盖玻片镊子。
    1. 翻转的盖玻片上，以便该荧光珠是在与凝胶溶液的一侧进行接触。
    2. 放置盖玻片上轻轻现已液体PA凝胶，使得官能侧与所述凝胶（ 图1C）接触的顶部。注意:为了获得最佳结果，第二个人建议用于将盖玻片，以避免部分聚合的可能性，同时吸取液体PA凝胶溶液到多个培养皿的作用。
15. 翻转所有的培养皿上，以协助避免对荧光纳米粒子聚合成凝胶的PA水平较低的重力影响。
16. 等待至少35分钟，或直至PA凝胶原液已经明显地聚合在其离心管中。
17. 翻转培养皿回来了，并填写他们用PBS以协助移除盖玻片。
18. 小心地使用培养皿的玻璃部与覆盖片的轮廓相接触，使用镊子刮盖玻片的外周。直到盖玻片被抛下进行几个循环。取下盖玻片和处置在适当的尖锐废弃物容器。
19. 除去所有盖玻片后，荧光珠将已转印到凝胶（ 图1D）。覆盖PA凝胶完全用PBS，放置在培养皿盖子上的每个皿中，在4℃下存储。

3，功能化的PA凝胶纤维连接蛋白

1. 如在已建立的协议¹¹中所述制备下列预混合溶液:浸泡溶液（137 mM氯化钠，5％（V / V）甘油）和2x偶联缓冲液（0.2M 2 - （N吗啉代）乙磺酸（MES），10 ％（V / V）甘油，pH4.5）中。
2. 使用真空泵在生物罩从含有PA的凝胶的玻璃底培养皿移除所有PBS中。
3. 吸管德浸泡溶液到每个凝胶，使得凝胶被完全淹没。在室温下孵育至少1小时。
4. 暖1 -乙基- 3 [3 -二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDC） 和 N -hydroxysulfosuccinimide（NHS）至室温。
5. 混合10倍的溶液的EDC（150​​毫米，19毫克/毫升的去离子水）和NHS（250毫米，29毫克/毫升的去离子水）。
6. 混合1份10倍的EDC，1份10倍的NHS，3份去离子水和5份2×偶联缓冲液中。
7. 使用真空泵在生物机罩以除去浸泡溶液。确保所有的液体从凝胶表面除去。
8. 添加足够的NHS / EDC溶液，以覆盖凝胶表面并填充培养皿（150-250微升）的玻璃底井。孵育在室温下在黑暗中30分钟。
9. 解冻纤连蛋白在室温下。一旦解冻，混合灭菌去离子水来创建一个50微克/毫升纤维连接蛋白的解决方案。
10. 使用真空泵在生物罩移除NHS / EDC SOLU化。确保所有的液体从凝胶表面除去。
11. 加入150μl的纤维连接蛋白的解决方案，以每个胶。在室温下孵育35分钟，以允许为附着纤连蛋白。
12. 35分钟后，PBS添加到各培养皿中，并储存在4℃下进行最多2周。

4，牵引力试验

1. 温暖的细胞培养基，PBS和胰蛋白酶37℃水浴中。
2. 冲洗凝胶5倍用无菌PBS，吸出PBS漂洗中之间，并留下包括在引擎盖。
3. 加入1 ml胰蛋白酶每^为 25cm ²至含有烧瓶中的细胞。之后将细胞从烧瓶中抬起，稀释与细胞介质的胰蛋白酶和计数细胞。基于凝胶的表面积，确定了最终的细胞接种3000细胞/ cm ²的密度为每凝胶所需的细胞数。稀释或浓缩悬浮液，使150微升的细胞介质混合物中含有细胞的这个数字。分装150微升细胞suspens的离子对每个凝胶。
4. 将装有细胞在培养箱中30分钟，在陪替氏培养皿。然后，小心地取出培养皿，并填补了培养皿与媒体（约2毫升）的其余部分，使菜的表面完全被淹没。
5. 放置在培养皿放回孵化器，直到图像采集。
6. 准备显微镜和数据采集系统成像:将40倍的水浸泡的目的，将微分干涉对比（DIC）棱镜，选择mCherry或同等荧光灯滤光片，并打开室内环境。
7. 当成像准备，从孵化器中删除一个培养皿中，并轻轻将它放在显微镜阶段。取出培养皿盖子DIC成像。
8. 找到一个单细胞，并捕获DIC小区的单幅静止图像。
9. 无需移动显微镜载物台，切换拍摄模式，以荧光。专注于荧光微球和REC奥德微球的图像。
10. 小心地从培养皿用移液管除去细胞培养基，并添加0.05％胰蛋白酶-EDTA。
11. 图像中的细胞后的细胞在微球具有离。
12. 利用粒子图像测速（PIV）分析ImageJ的¹²位移场计算，由于细胞的力量。

结果

共焦成像被用来确定该珠确实凝胶表面的下方，并在凝胶深度内量化它们的精确位置。一个不同的波长比所述凝胶内的荧光珠沉降的表面上，并嵌入荧光纳米粒子与那些在表面上的距离，使用质心确定算法来计算。在凝胶表面上的加强筋的位置用作用于凝胶，其中细胞在粘附施加力的表面的顶表面上的参考。在两种情况考虑（与红色小珠的表面上，反之亦然凝胶绿色珠）的示意图如图3

讨论

当使用这种技术时，至关重要的是，在胎圈溶液适当稀释，并且将珠粒根据所要求的直径选择，PA凝胶基体的刚度，和正在探讨在所需实验现象的大小规模。

应该注意，当稀释前官能顶部玻璃盖片的珠液服用。在凝胶表面珠粒之间的间隔可以通过改变胶体溶液的稀释因子来改变。稀释该溶液过多会降低珠耦合到所述盖片的数量，并最终降低了凝胶珠的数量。稀释该溶液太少可...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES)	Sigma-Aldrich	281778
70% Glutaraldehyde	Polysciences, Inc.	111-30-8
1 M HEPES buffer solution	Sigma-Aldrich	83264
40% Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
2% Bisacrylamide	Sigma-Aldrich	M1533
0.1 µm Fluorescent microspheres (mCherry)	Invitrogen	F8801
Fibronectin, Human, 1 mg	BD Biosciences	354008
Ammonium persulfate	Bio-RAD	161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Bio-RAD	161-0801
Poly-D-lysine	Millipore	A-003-E
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)	Thermo Scientific	22980
N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)	Thermo Scientific	24500
0.05% Trypsin-EDTA (1X)	Life Technologies	25300-054
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
Acrylic acid	Sigma-Aldrich	147230
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M3671
Materials
35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass	In Vitro Scientific	D35-14-1-N
Glass cover slips, 12 mm diam.	Ted Pella, Inc.	26023