Новый метод для локализации Reporter флуоресцентные шарики Ближних культуре клеток для увеличения силы сцепления силовой микроскопии

Резюме

Традиционные методы изготовления полиакриламид (PA) гели, содержащие флуоресцентных зондов включают прослаивая гель между примыкающей поверхности и стекло. Здесь мы показываем, что покрытия этот слайд с поли-D-лизина (PDL) и флуоресцентных зондов локализуется зондов с точностью 1,6 мкм от поверхности геля.

Аннотация

PA гели уже давно используются в качестве платформы для изучения клеток силы тяги, благодаря простоте изготовления и возможность настроить свои эластичные свойства. Когда подложка покрыта белком внеклеточного матрикса, клетки придерживаться геля и применять силы, в результате чего гель деформироваться. Деформация зависит от клеточного тяги и упругих свойств геля. Если поле деформация поверхности, как известно, поверхность тяги может быть рассчитана с использованием теории упругости. Гель деформации обычно измеряется путем встраивания флуоресцентным маркером шарики равномерно в гель. Зонды вытеснить как гель деформируется. Зонды вблизи поверхности геля отслеживаются. Смещения, о которых сообщают эти зонды считаются смещений поверхности. Их глубины от поверхности игнорируются. Это предположение вводит ошибку в оценках силы тяги. Для точного измерения клеточных сил, она имеет решающее значение для расположения бусинок, чтобы быть известным. Мы разработалитехника, которая использует простой химию ограничиться флуоресцентные бусы маркеров, 0,1 и 1 мкм в диаметре, в ПА гелей, в 1,6 мкм от поверхности. Мы пальто покровное с поли-D-лизина (PDL) и люминесцентных бисером. Раствор геля ПА затем зажата между покровным и примыкающей поверхности. Флуоресцентные шарики передать в растворе во время затвердевания геля. После полимеризации гель PA содержит флуоресцентные бусы на плоской близко к поверхности геля.

Введение

Механическое взаимодействие живой клетке с местной окружающей среды имеет обычно были изучены с помощью PA гели. Эти субстраты полагаться на простой, хорошо характеризуется протоколом, принятым Дембо и Ван в 1997 году ^1. Одним из основных преимуществ этих субстратов является то, что их жесткость может быть настроена путем изменения концентрации специфических компонентов раствора геля. Это обеспечивает желаемый платформу для изучения взаимодействия клеток с средах различной жесткостью. Когда PA гели покрыты внеклеточного матрикса (ECM) белков, клетки их придерживаться, создавая силу. В результате клетки силы, гель деформируется как упругое тело. Эта деформация зависит от величины силы, приложенной клетками и упругих свойств геля. В разных работах использовались PA гели для расследования клеточные силы тяги.

В одном из вариантов изготовления геля Звуковая, флуоресцентные микросферы (бисер) встроены тhroughout гель для количественного клеток тяговые силы на гелях различной жесткостью ^2. По заявлению клеток силы, шарики вытеснить из исходного местоположения следующей деформации геля. Поле деформация измеряется от отдельных смещений бортов. Это поле деформации используется с теории упругости и упругих свойств геля для вычисления силы тяги. Эти измерения дают представление о том, как клетки механически чувствовать и взаимодействовать с их микроокружения ^3.

Во многих широко используемых ПА изготовления геля протоколов, шарики перемешаны по всему геля ООПТ в жидком, неполимеризованного государства. Полностью полимеризованный ПА гель содержит флуоресцентные шарики по всему объему. При вычислении клеток тяговые силы, бусы большинство вблизи поверхности геля (интерфейс клеток-подложка) контролируются. Смещения этих шариков, как предполагается, возникает на поверхности клеточной культуры для простоты в силовом calculatioн. Фактическое расположение шариков в пределах глубины геля не учитывается. Тем не менее, в упругой среде (например, PA гель), шарик ближе к точке приложения силы перемещается больше, чем шарик, который дальше от точки. Таким образом, лечение смещение точки (по месту нахождения борта) дальше от поверхности, что и на поверхности приводит к недооценке сотовых тяг. Степень погрешности зависит от расстояния борта из поверхности. Ошибка не может быть оценена без ведома расположения шарика.

Необходимость в простом способе ограничиться бусы очень близко к поверхности клеточной культуры была решена на несколько приемов. Один путь состоит в том, чтобы увеличить плотность шариков по всей гель таким образом, что имеется достаточное количество шариков в верхней фокальной плоскости для измерения движения в непосредственной близости от поверхности. Другой метод предусматривает строительство конфокальной изображения камеры для получения изображений живых клеток таким образом, что свет оттолько бусы в верхнем наиболее фокальной плоскости собираются ^4. Другой метод предполагает наложение чрезвычайно тонкий слой Звуковая геля, содержащего бусы поверх уже полимеризованном геля без шариков ^5. Недостатком каждого из этих методов в том, что точное местоположение шариков в геле не известно. Это вносит ошибку в расчете поля смещения гранул, и, таким образом, при расчете клеток сил. Другой способ включает сопряжение из бисера на верхней поверхности уже полимеризуется Звуковая геля с использованием сульфо-SANPAH ^6. Эта методика обеспечивает шарики действительно только на верхней части геля PA, но степень, в которой они включены в глубине геля неизвестно. Потенциально это может создать локальную топографию для клеток, которые могут изменить поведение клеток, как до работы предположил, что клетки могут ощутить силы несколько микрон Гости ^7. Недавно, техника для рисунка PA гели с диаметром 1 мкм фluorescent фибронектин точечные маркеры в регуляризированной массива была создана ^8. В этом случае глубина флуоресцентных маркеров, как известно, и, по существу, равен нулю, так как картина фибронектин косвенно напечатан на поверхности геля. Однако этот способ не обеспечивает непрерывную среду, на которой клетки могут приложить, как белок ЕСМ ограничен точками диаметром 1 мкм. Способ полной интеграции трекер бусы в ПА гелей и ограничивая их в известном месте в непосредственной близости от поверхности до сих пор не установлено.

Здесь мы разработать методику, чтобы ограничить суб-мкм до диаметра мкм флуоресцентные шарики в фокальной плоскости очень близко к поверхности клеточной культуры в ПА геля. Гель обычно отверждают с помощью сэндвич Неполимеризованные раствор жидкий гель между двумя стеклянными пластинами. Одна из пластин функционализированные таким образом, что гель сильно прилипает к ней. Другой нефункционализованного и удаляется после гель лечения. Мы изменить этот съемный стакан всrface покрытием его слоем шариков. После сэндвич жидкий гель между функционализированного и бортового покрытием поверхности стекла, передача шарики с гелем, пока он отверждения. Это ограничивает расстояние интеграции шарики "в гель в течение 1,6 мкм от поверхности. Блюда с прозрачным дном Петри используются в качестве адгезивного поверхности, на которой гель отвержденной. Чтобы сформировать плоскую верхнюю поверхность геля при полимеризации, круговая скольжения стеклянная крышка используется для сэндвич гель с стеклянным дном чашки Петри. Перед изготовлением гель, сверху покровным стеклом покрывают поли-D-лизина (PDL), что дает положительный поверхностный заряд. PDL сдувается сжатым воздухом, и раствор шариков в воде, осаждается на покровных стеклах. Мы используем карбоксилированные флуоресцентные микрошарики, которые несут отрицательный заряд, и взаимодействовать с положительно заряженной поверхности, образованной путем обработки PDL. После продувки борта решение от покровного стекла сжатым воздухом, одного слоябусины остается электростатически соединен с сухим покровным стеклом. PDL покрытие не влияет на адгезию стекла к поверхности геля, как стеклышки не повреждены и удалены от ПА геля полностью нетронутыми.

Стеклянные дном чашки Петри изготовлены прилипший путем обработки 97% 3-аминопропил-trimethoxysliane и 0,5% глутарового альдегида. PA гели желаемых жесткости создаются путем смешивания соответствующих концентраций бис-акриламида и акриламида с помощью стандартной процедуры ^9. Каплю раствора гель наноситс пипеткой на стеклянным дном чашки Петри. Скольжения стеклянная крышка, содержащий бусинки используется для сэндвич гель с чашки Петри. Когда гель отверждается, в верхней покровное стекло удаляется оставив шариков, погруженных в геле PA пределах 1,6 мкм от поверхности.

протокол

Изготовление и функционализации PA гели различной жесткости с люминесцентными микросфер встроенных вблизи поверхности клеточной культуры.

1 функционализирующими верхнее стекло покровные стекла

1. Чистые скользит стекла крышка (# 1,0, 12 мм диам.) С мылом и водой, затем этанолом, чтобы удалить посторонние пыли.
2. Место стеклянная крышка скользит на тертый поверхности (т.е. пипетки держателя наконечника), что они не соприкасаются, чтобы облегчить легкость взаимодействия с покровные.
3. Шерсть вся поверхность крышки скользит с поли-D-лизина (0,1 мг / мл) в течение 1 часа (фиг.1А).
4. В течение этого времени, выполнить 1: 10000 разбавление коллоидного раствора диаметром 0,1 мкм, красный флуоресцентные микросферы с деионизированной (ДИ) воды, чтобы получить плотность частиц примерно 1 микросфер в 20 мкм ² на поверхности геля. На рисунке 2 представлены результаты различных разведениях. Это dilutioн может быть изменен, чтобы удовлетворить потребности конкретных экспериментов.
5. Поместите разбавленный раствор в ультразвуковой ванне воды в течение 30 мин.
6. Через 1 час, использовать пинцет, чтобы аккуратно поднимите каждый покровное и высушите воздухом. Вернуться сухие промахи обложки к этому тертым поверхности.
7. Снимите разбавленный коллоидного раствора от ультразвуковой ванне и пипетки 150 мкл на каждую покровным. Оставьте на 10 мин (Рисунок 1В).
8. Используйте пинцет, чтобы аккуратно поднимите каждый покровное и высушите воздухом. Вернуться сухой крышка не скользит в тертым поверхности и хранить в темноте, пока готов к использованию.

2 Подготовка PA гель непосредственно на стеклянным дном чашки Петри

1. Разогреть конфорка до 100 ° C.
2. Выложите нужное количество стеклянным дном чашки Петри (35 мм блюдо с 14 мм микро-ну # 1.0) на плоской поверхности в химическом вытяжном шкафу.
3. Покройте стеклянную часть каждого Петри микро-скважины с 97% 3-аминопропилсульфокислоты-trimethoxysлиана (3-APTES) в течение 7 минут для химической активации. Принять меры предосторожности, чтобы избежать случайного капает из 3-APTES к поверхности пластика в чашку Петри, чтобы избежать деградации полистирола.
4. После 7 минут, заполнить чашку Петри с дистиллированной водой и выбросить в контейнер для отходов.
5. Повторите шаг 2,4 3x для каждого блюда, а затем встряхните чашку Петри, чтобы удалить излишки воды. Поместите чашки Петри на горячей плите, пока стекло часть не высохнет.
6. Снимите чашки Петри с горячей плите и вернуться к плоской поверхности в химическом вытяжном шкафу.
7. В химическом вытяжном шкафу, чтобы раствор 0,5% глутарового альдегида и самого стекла часть каждой чашке Петри и с раствором в течение 30 мин. Принять меры предосторожности, чтобы избежать случайного капание в глутарового альдегида к поверхности пластика в чашку Петри, чтобы избежать деградации пластика.
8. Через 30 мин, заполнить чашку Петри с дистиллированной водой и выбросить в контейнер для отходов, чтобы промыть и удалить glutaraldehyde.
9. Повторите шаг 2,4 3x для каждого блюда, а затем встряхните чашку Петри, чтобы удалить излишки воды. Поместите чашки Петри на горячей плите, пока стекло часть не высохнет.
10. Перед смешиванием компонентов раствора геля Звуковая, двигаться функционализованных стеклянные слайды в химическом вытяжном шкафу, так что они были легко доступны, что позволяет для быстрого многослойного композитного геля с стеклянным дном чашки Петри, после перемешивания раствора геля.
11. В 15 мл центрифужную пробирку, перемешивают 40% бис-акриламид, 2% акриламида и акриловой кислоты в непосредственной последовательности в концентрациях, указанных в таблице 1 (адаптировано из опубликованного протокола ¹⁰⁾ для достижения желаемого матрицу эластичность.
12. Добавить 100 мМ HEPES, 10% персульфат аммония, и TEMED в количествах, указанных в таблице 1, соответствующих требуемой матрицы упругости, чтобы завершить раствор геля.
13. Сразу же пипеткой 15 мкл раствора геля на центр стеклянной частииз чашки Петри.
14. Сразу подобрать модифицированного стекла покровным с помощью пинцета.
    1. Переверните покровным стеклом над такими, что флуоресцентные бусы на стороне контакта с гелем решения.
    2. Lay покровное стекло слегка в верхней части теперь жидкого геля PA таким образом, что функционализированный сторона находится в контакте с гелем (рисунок 1С). Примечание: Для получения наилучших результатов, второй человек рекомендуется для роли добавив покровное, чтобы избежать возможность частичного полимеризации в то время пипетки жидкий раствор геля PA на нескольких чашках Петри.
15. Флип все чашки Петри над оказать помощь в уклонении от тяжести последствий для люминесцентных наночастиц полимеризующих в более низких уровнях геля PA.
16. Подождите не менее 35 минут, или до тех пор, раствор ПА геля не заметно полимеризуется в центрифужную пробирку.
17. Переверните чашки Петри снова и заполнить их с ФБР, чтобы помочь с удалением покровное.
18. Осторожно установить контакт с стеклянной части чашки Петри и набросках покровным, с помощью пинцета, чтобы очистить окружность покровным. Выполните несколько циклов, пока покровное не выбили. Снимите покровное и распоряжаться надлежащим контейнера колющих отходов.
19. После удаления всех покровных стеклах, флуоресцентные шарики будут переданы геля (Рисунок 1D). Покройте гели PA полностью с PBS, поместите блюдо крышкой Петри на каждую чашку, и хранят при температуре 4 ° C.

3 функционализирующими PA гель с Фибронектин

1. Подготовьте следующие предварительно смешанные растворы, как описано в установленном протоколе ^11: смачивающий раствор (137 мМ NaCl, 5% (об / об) глицерина) и 2x сопряжения буфера (0,2 М 2-(N -morpholino) этансульфоновой кислоты (MES), 10 % (об / об) глицерина, рН 4,5).
2. Используйте вакуумный насос в биологической капотом, чтобы удалить все PBS от стеклянным дном блюд, содержащих гели PA.
3. ВнеситеТе впитать раствора на каждый гель, так что гель полностью погружен в воду. Инкубируют при комнатной температуре в течение по крайней мере 1 часа.
4. Теплый 1-этил-3-[3-диметиламинопропил] карбодиимида (EDC) и N -hydroxysulfosuccinimide (NHS) до комнатной температуры.
5. Смешайте 10x решения EDC (150 мм, 19 мг / мл в дистиллированной водой) и NHS (250 мм, 29 мг / мл в дистиллированной водой).
6. Смешайте 1 часть 10x EDC, 1 часть 10x NHS, 3 частей деионизированной воды и 5 частей 2x буфера конъюгации.
7. Используйте вакуумный насос в биологической капотом удалить впитать решение. Убедитесь, что все жидкости удаляют с поверхности геля.
8. Добавьте достаточно решение NHS / EDC, чтобы покрыть поверхность геля и заполнить стеклянным дном колодец чашке Петри (150-250 мкл). Выдержите при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте.
9. Оттепель фибронектин при комнатной температуре. После оттаивания, смешать стерильной DI воды, чтобы создать 50 мкг / мл фибронектина решение.
10. Используйте вакуумный насос в биологической капотом удалить Солу NHS / EDCции. Убедитесь, что все жидкости удаляют с поверхности геля.
11. Добавить 150 мкл раствора фибронектина, чтобы каждый гель. Инкубируют при комнатной температуре в течение 35 мин, чтобы позволить для прикрепления фибронектина.
12. После 35 мин, добавить PBS в каждую чашку Петри и хранить при температуре 4 ° С в течение 2 недель.

4. Тяговое усилие Эксперименты

1. Теплый клеток массовой информации, PBS, и трипсина до 37 ° С на водяной бане.
2. Промыть гели 5x стерильной PBS, аспирационных PBS между полосканий, и оставьте покрыты в капюшоне.
3. Добавить 1 мл трипсина на 25 см ² в колбу, содержащую клетки. После клетки поднял из колбы, разбавить трипсин с сотовых СМИ и считать клетки. На основе площади поверхности геля, определить количество клеток, необходимых на гель для конечной плотности посева клеток 3000 клеток / см ^2. Развести или концентрат суспензии, такие, что 150 мкл клеток-медиа смеси содержит это число клеток. Аликвотные 150 мкл клеток suspensион на каждый гель.
4. Поместите чашки Петри, содержащие клетки в инкубаторе в течение 30 мин. Затем аккуратно удалить чашки Петри и заполнить оставшуюся часть чашки Петри с медиа (приблизительно 2 мл), что поверхность блюдо полностью погружен.
5. Поместите чашки Петри обратно в инкубатор до получения изображения.
6. Подготовьте микроскоп и данных системы сбора для визуализации: вставьте иммерсионный объектив 40x воды, вставить Дифференциальный интерференционного контраста (DIC) призмы, выберите mCherry или эквивалентную флуоресцентный фильтр, и включите камеру искусственного климата.
7. Когда готовы к визуализации, удалить одно блюдо Петри из инкубатора и осторожно положите на предметный столик микроскопа. Снимите блюдо крышкой Петри для визуализации DIC.
8. Найдите одну ячейку и захватить одной фотографии ячейки в ДВС.
9. Не перемещая столик микроскопа, переключить режим отображения, чтобы флуоресценции. Сосредоточьтесь на флуоресцентных микросфер и РЭЦOrd образ микросфер.
10. Осторожно снимите клеток носитель из чашки Петри с помощью пипетки и добавить 0,05% трипсин-EDTA.
11. Изображение микросферы под клетки после того, как клетки отдельно.
12. Изображение велосиметрия (PIV) анализ использования частиц в ImageJ ¹² вычислить смещения поля в связи с сотовой сил.

Результаты

Конфокальной изображения была использована для определения, что шарики были действительно под поверхностью геля и количественной оценки их точное местоположение в пределах глубины гель. Флуоресцентные шарики с другой длиной волны, чем те, внутри геля давали осесть на поверхности, и р...

Обсуждение

При использовании этого метода, важно, чтобы раствор шарик образом разводили и гранулы выбраны на основании желаемого диаметра, Пенсильвания гелевой основе жесткость, а размер шкалы явлений, которые исследовали в нужном эксперимента.

Внимание должно быть принято при р?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES)	Sigma-Aldrich	281778
70% Glutaraldehyde	Polysciences, Inc.	111-30-8
1 M HEPES buffer solution	Sigma-Aldrich	83264
40% Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
2% Bisacrylamide	Sigma-Aldrich	M1533
0.1 µm Fluorescent microspheres (mCherry)	Invitrogen	F8801
Fibronectin, Human, 1 mg	BD Biosciences	354008
Ammonium persulfate	Bio-RAD	161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Bio-RAD	161-0801
Poly-D-lysine	Millipore	A-003-E
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)	Thermo Scientific	22980
N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)	Thermo Scientific	24500
0.05% Trypsin-EDTA (1X)	Life Technologies	25300-054
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
Acrylic acid	Sigma-Aldrich	147230
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M3671
Materials
35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass	In Vitro Scientific	D35-14-1-N
Glass cover slips, 12 mm diam.	Ted Pella, Inc.	26023