Un nuovo metodo per la localizzazione Reporter perline fluorescenti vicino alla superficie coltura cellulare per la trazione microscopia a forza

Riepilogo

Le tecniche tradizionali per la realizzazione di poliacrilammide (PA) gel contenenti sonde fluorescenti comportano un gel a sandwich tra una superficie aderente e un vetrino. Qui, dimostriamo che il rivestimento questa diapositiva con poli-D-lisina (PDL) e sonde fluorescenti localizza le sonde entro 1,6 micron dalla superficie del gel.

Abstract

Gel PA sono stati a lungo utilizzati come piattaforma per studiare le forze di trazione delle cellule grazie alla facilità di fabbricazione e la possibilità di regolare le loro proprietà elastiche. Quando il substrato viene rivestito con una proteina della matrice extracellulare, le cellule aderiscono al gel e applicare forze, causando il gel di deformarsi. La deformazione dipende dalla trazione cellulare e le proprietà elastiche del gel. Se il campo di deformazione della superficie è noto, la trazione superficiale può essere calcolata utilizzando la teoria dell'elasticità. Gel deformazione viene comunemente misurata inserendo perline marcatori fluorescenti uniformemente nel gel. Le sonde spostano come il gel si deforma. Le sonde vicino alla superficie del gel sono tracciati. Gli spostamenti riportati da queste sonde sono considerati come spostamenti superficiali. Le loro profondità dalla superficie vengono ignorati. Questa ipotesi introduce errore in forza di trazione valutazioni. Per la misura precisa di forze di cellule, è fondamentale per la posizione delle perline per essere conosciuto. Abbiamo sviluppatouna tecnica che utilizza la chimica semplice confinare perline marcatori fluorescenti, 0,1 e 1 micron di diametro, in gel PA, a 1,6 micron della superficie. Abbiamo cappotto un coprioggetto con poli-D-lisina (PDL) e perline fluorescenti. Soluzione di gel PA viene quindi inserita tra il vetrino ed una superficie aderente. Le perline fluorescenti trasferimento alla soluzione di gel durante la polimerizzazione. Dopo la polimerizzazione, il gel PA contiene microsfere fluorescenti su un aereo vicino alla superficie del gel.

Introduzione

L'interazione meccanica di una cellula vivente con il suo ambiente locale è stato comunemente studiata utilizzando gel PA. Questi substrati basano su un semplice protocollo ben caratterizzato stabilito da Dembo e Wang nel 1997 ^1. Uno dei principali vantaggi di questi substrati è che la loro rigidezza può essere regolato modificando le concentrazioni dei componenti specifici della soluzione di gel. Ciò fornisce una piattaforma auspicabile studiare l'interazione cellule 'con ambienti di diverse rigidità. Quando gel PA vengono rivestiti con matrice extracellulare (ECM) proteine, cellule aderiscono ad esse, la forza che genera. Come risultato della forza cella, il gel si deforma come un corpo elastico. Questa deformazione dipende dalla grandezza della forza applicata dalle cellule e le proprietà elastiche del gel. Vari studi hanno impiegato gel PA per indagare le forze di trazione cellulari.

In una variante di PA gel fabbricazione, microsfere fluorescenti (sfere) sono incorporati tel corso il gel di quantificare le forze di trazione cellulare su gel di differenti rigidità ^2. Su di applicazione della forza di cellule, le perle spostano dalla loro posizione iniziale dopo gel deformazione. Il campo di deformazione è misurata dai singoli spostamenti tallone. Questo campo di deformazione viene utilizzata con la teoria dell'elasticità e le proprietà elastiche del gel per calcolare le forze di trazione. Queste misure forniscono informazioni su come le cellule percepiscono meccanicamente ed interagiscono con il loro microambiente locale ^3.

In molti protocolli gel di fabbricazione ampiamente utilizzati PA, le perle sono mescolati in tutto il gel PA nel suo, stato liquido non polimerizzato. Un gel completamente polimerizzato PA contiene perline fluorescenti in tutto il suo volume. Nel calcolo delle forze di trazione delle cellule, perline maggior parte vicino alla superficie del gel (interfaccia cellula-substrato) sono monitorati. Gli spostamenti di queste perle si presume che si verificano sulla superficie della coltura cellulare per semplicità nella CALCOLO vigoren. La posizione attuale delle perle all'interno della profondità del gel viene ignorato. Tuttavia, in un mezzo elastico (ad esempio gel PA), una perlina più vicino al punto di applicazione della forza si muoverà più di un cordone che è più lontano dal punto. Così, trattando lo spostamento di un punto (nella posizione tallone) distale dalla superficie come che i risultati di superficie in una sottostima del trazioni cellulari. Il grado di errore dipende dalla distanza del tallone dalla superficie. L'errore non può essere definita senza la conoscenza della posizione del tallone.

La necessità di un metodo semplice per limitare perline molto vicino alla superficie di coltura cellulare è stato affrontato da alcune tecniche. Un modo è quello di aumentare la densità di perline per tutto l'arco gel tale che ci sia un numero sufficiente di perline nel piano focale superiore per misurare il movimento molto vicino alla superficie. Un'altra tecnica prevede la costruzione di una camera di imaging confocale per l'imaging cellulare dal vivo in modo tale che la luce dasolo le perline nel piano superiore più focale è raccolto ^4. Un altro metodo consiste sovrapponendo uno strato estremamente sottile di PA gel contenente microsfere sulla cima di un gel già polimerizzato, senza perline ^5. Un inconveniente di ciascuna di queste tecniche è che la posizione precisa dei branelli all'interno del gel non è noto. Questo introduce errori nel calcolo del campo di spostamenti delle perline, e quindi il calcolo delle forze cellulari. Un'altra tecnica prevede coniugazione perline alla superficie superiore di un gel PA già polimerizzato usando solfo-SANPAH ^6. Questa tecnica garantisce le perline sono infatti solo sulla parte superiore del gel PA, ma la misura in cui sono incorporati nella profondità del gel è sconosciuta. Ciò potrebbe potenzialmente creare una topografia locale per le cellule, che potrebbero alterare il comportamento delle cellule, come il lavoro preliminare ha suggerito che le cellule possono percepire forza diversi micron di distanza ^7. Recentemente, una tecnica per patterning gel PA con 1 micron di diametro fluorescent marcatori fibronectina punti in una matrice regolarizzato è stato fondato ^8. In questo caso, la profondità dei marcatori fluorescenti è noto, ed è sostanzialmente pari a zero, come il modello fibronectina è indirettamente stampata sulla superficie del gel. Tuttavia, questo metodo non fornisce un ambiente continuo in cui le cellule possono attaccare, come la proteina ECM è limitata a 1 micron di diametro puntini. Deve essere ancora stabilito un metodo per integrare pienamente perline Tracker all'interno gel PA e loro confinamento in un percorso noto molto vicino alla superficie.

Qui, sviluppiamo una tecnica per limitare sub-micron di perline fluorescenti di diametro micron ad un piano focale molto vicino alla superficie di coltura cellulare all'interno del gel PA. Un gel è tipicamente curata da sandwich non polimerizzato soluzione di gel liquido tra due lastre di vetro. Una delle piastre viene funzionalizzati in modo che il gel aderisce fortemente ad esso. L'altro è unfunctionalized e viene rimosso dopo le cure del gel. Modifichiamo questo vetro rimovibile surfaccia rivestendo con uno strato di perline. Su sandwich il gel liquido tra il funzionalizzati e la superficie di vetro tallone rivestito, il trasferimento di perline per il gel mentre sta curando. Questo limita la distanza di integrazione dei branelli 'nel gel entro 1,6 micron della superficie. Piatti con fondo di vetro Petri sono utilizzati come la superficie di adesione sulla quale è guarito il gel. Per formare una superficie superiore piana del gel durante la polimerizzazione, una circolare copertura in vetro antiscivolo è usato per sandwich di gel con la piastra di Petri con fondo di vetro. Prima di gel di fabbricazione, il coperchio superiore in vetro antiscivolo è rivestito con poli-D-lisina (PDL), ottenendo una carica superficiale positiva. Il Pdl è saltato fuori con aria compressa, e una soluzione di perline in acqua si deposita sulle coprioggetto. Utilizziamo microsfere fluorescenti carbossilati, che portano una carica negativa, e interagire con la superficie carica positiva creata dal trattamento con PDL. Dopo aver soffiato la soluzione tallone fuori il vetrino con aria compressa, un singolo strato diperline rimane elettrostaticamente accoppiati alla copertura di slittamento asciutto. Il rivestimento PDL non influenza l'adesività del vetro alla superficie del gel, i vetrini sono integri e rimossa dal gel PA completamente intatto.

Le piastre di Petri con fondo di vetro sono fatti aderente dal trattamento con il 97% a 3 amminopropil-trimethoxysliane e 0,5% glutaraldeide. PA gel di rigidità desiderati vengono creati miscelando opportune concentrazioni di bisacrilammide e acrilamide mediante una procedura standard ^9. Una goccia della soluzione di gel è pipettati sul piatto di Petri con fondo di vetro. Il vetrino di vetro contenente le perline viene utilizzato per sandwich di gel con la piastra di Petri. Quando il gel è guarito, la fodera superiore viene rimosso lasciando le sferette incorporati nel gel PA a 1,6 micron dalla superficie.

Protocollo

Realizzazione e funzionalizzazione PA gel di diversa rigidità con microsfere fluorescenti incorporate in prossimità della superficie di coltura cellulare.

1 funzionalizzare i coprioggetto piano in vetro

1. Pulire i vetrini di vetro (# 1.0, diametro 12 mm.) Con acqua e sapone, seguito da etanolo per rimuovere la polvere estranei.
2. Posizionare il coperchio di vetro scivola su una superficie grattugiato (cioè titolare puntale) in modo che non si tocchino per facilitare la facilità di interazione con i coprioggetti.
3. Rivestire l'intera superficie del coperchio scivola con poli-D-lisina (0,1 mg / ml) per 1 ora (Figura 1A).
4. Durante questo tempo, eseguire una diluizione 1: 10.000 della soluzione di colloide di 0,1 micron di diametro, microsfere fluorescenti rossi con deionizzata (DI) per ottenere una densità di particelle di circa 1 a microsfere per 20 micron ² sulla superficie del gel. Vedere la Figura 2 per i risultati delle varie diluizioni. Questo dilution può essere modificato per soddisfare l'esigenza di esperimenti specifici.
5. Inserire la soluzione diluita in un bagno d'acqua ad ultrasuoni per 30 minuti.
6. Dopo 1 ora, utilizzare pinzette per sollevare attentamente ogni vetrino e asciugare con aria. Riportare i vetrini asciutti in superficie grattugiato.
7. Rimuovere la soluzione colloidale diluita dal bagno ad ultrasuoni e pipetta 150 microlitri su ogni vetrino. Lasciare agire per 10 minuti (Figura 1B).
8. Utilizzare le pinzette per sollevare attentamente ogni vetrino e asciugare con aria. Riportare il coperchio secco scivola sulla superficie grattugiato e conservare al buio fino al momento dell'uso.

2 Preparare PA Gel Direttamente Glass Bottom piastre di Petri

1. Piastra Preriscaldare a 100 ° C.
2. Disporre il numero desiderato di fondo in vetro Petri (35 mm piatto con 14 millimetri micro-bene, # 1.0) su una superficie piana in una cappa.
3. Coprire la parte in vetro di ogni Petri piatto micro-bene con il 97% a 3 amminopropil-trimethoxysliane (3-APTES) per 7 minuti per l'attivazione chimica. Fare attenzione per evitare gocciolamento accidentale dei 3-APTES alla superficie della plastica nella scatola di Petri per evitare il degrado del polistirolo.
4. Dopo 7 minuti, riempire la piastra di Petri con acqua deionizzata e smaltire in contenitore per i rifiuti.
5. Ripetere il punto 2.4 3x per ogni piatto, e poi agitare la piastra di Petri per rimuovere l'acqua in più. Porre le capsule di Petri sulla piastra calda fino a quando la parte in vetro è asciutto.
6. Rimuovere le piastre di Petri dalla piastra calda e tornare a una superficie piana in una cappa.
7. In una cappa, fare una soluzione di 0,5% di glutaraldeide e coprire la porzione di vetro di ciascuna piastra di Petri bene con la soluzione per 30 min. Fare attenzione per evitare gocciolamenti involontaria della glutaraldeide alla superficie della plastica nella scatola di Petri per evitare il degrado della plastica.
8. Dopo 30 minuti, riempire la piastra di Petri con acqua deionizzata e smaltire in contenitore per i rifiuti per risciacquare e rimuovere il glutaraldehyde.
9. Ripetere il punto 2.4 3x per ogni piatto, e poi agitare la piastra di Petri per rimuovere l'acqua in più. Porre le capsule di Petri sulla piastra calda fino a quando la parte in vetro è asciutto.
10. Prima di miscelare i componenti della soluzione di gel PA, spostare i vetrini funzionalizzati nella cappa tale che siano facilmente accessibili, consentendo il rapido sandwiching del gel con il fondo di vetro piastre Petri dopo la miscelazione la soluzione di gel.
11. In una provetta da centrifuga da 15 ml, mescolare il 40% bisacrilammide, 2% acrilamide, e di acido acrilico in successione immediata alle concentrazioni elencate nella tabella 1 (adattato dal protocollo pubblicato ¹⁰⁾ per ottenere l'elasticità matrice desiderata.
12. Aggiungi HEPES 100 mM, 10% persolfato di ammonio, e TEMED in quantità elencate nella tabella 1 corrispondono a matrice di elasticità desiderato per completare la soluzione di gel.
13. Pipettare Subito 15 ml di soluzione di gel sul centro della porzione di vetrodelle piastre di Petri.
14. Prendere immediatamente una copertura di slittamento vetro funzionalizzato con una pinzetta.
    1. Capovolgere il vetrino di vetro sopra in modo che le perline fluorescenti sono sul contatto making lato con la soluzione di gel.
    2. Disporre il vetrino delicatamente sulla sommità del gel PA ora-liquido tale che il lato funzionalizzato è in contatto con il gel (Figura 1C). Nota: Per ottenere i migliori risultati, una seconda persona è consigliato per il ruolo di aggiungere la polizza di copertura, al fine di evitare la possibilità di polimerizzazione parziale mentre pipettaggio soluzione di gel PA liquida su più piastre di Petri.
15. Capovolgere tutti i piatti di Petri su per assistere evitare effetti gravitazionali sulle nanoparticelle fluorescenti polimerizzazione in più bassi livelli del gel PA.
16. Attendere almeno 35 minuti, o fino a quando la soluzione madre di gel PA ha visibilmente polimerizzato nella sua provetta da centrifuga.
17. Capovolgere le piastre di Petri indietro sopra e riempirli con PBS per assistere con la rimozione del vetrino.
18. Fare attenzione contatto con la porzione di vetro della piastra Petri e il contorno del vetrino, con una pinzetta per raschiare la circonferenza del vetrino. Eseguire diversi cicli fino a quando la polizza di copertura viene sloggiato. Rimuovere il vetrino e smaltire in un vero e proprio contenitore per rifiuti taglienti.
19. Dopo aver rimosso tutti i vetrini, perline fluorescenti saranno trasferiti al gel (Figura 1D). Coprire i gel PA completamente con PBS, posizionare il coperchio piastra di Petri su ogni piatto, e conservare a 4 ° C.

3. funzionalizzazione gel PA con fibronectina

1. Preparare le seguenti soluzioni premiscelate, come descritto in un protocollo prestabilito ^11: Mettere a bagno la soluzione (137 mM NaCl, 5% (v / v) glicerolo) e tampone 2x coniugazione (0.2 M 2 (N -morpholino) Acido ethanesulfonic (MES), 10 % (v / v) glicerolo, pH 4,5).
2. Utilizzare una pompa a vuoto in una cappa biologica per rimuovere tutti PBS dai piatti con fondo di vetro che contengono i gel PA.
3. Pipettarete ammollo soluzione su ogni gel in modo che il gel sia completamente sommerso. Incubare a temperatura ambiente per almeno 1 ora.
4. Caldo 1-etil-3-[3-dimetilamminopropil] carbodiimide cloridrato (EDC) e N -hydroxysulfosuccinimide (NHS) a temperatura ambiente.
5. Mescolare 10x soluzioni di EDC (150 mm, 19 mg / ml in acqua deionizzata) e NHS (250 mm, 29 mg / ml in acqua deionizzata).
6. Mescolare 1 parte di 10x EDC, 1 parte di 10x NHS, 3 parti di acqua DI, e 5 parti di 2x tampone coniugazione.
7. Utilizzare una pompa a vuoto in una cappa biologica per rimuovere la soluzione in ammollo. Assicurarsi che tutto il fluido viene rimosso dalla superficie del gel.
8. Aggiungere abbastanza soluzione NHS / EDC per coprire la superficie del gel e riempire il pozzo fondo di vetro della scatola di Petri (150-250 ml). Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio.
9. Fibronectina Scongelare a temperatura ambiente. Una volta scongelati, miscelare acqua deionizzata sterile per creare una / soluzione di fibronectina ml 50 mg.
10. Utilizzare una pompa a vuoto in una cappa biologica per rimuovere le solu NHS / EDCzione. Assicurarsi che tutto il fluido viene rimosso dalla superficie del gel.
11. Aggiungere 150 ml di soluzione di fibronectina a ciascun gel. Incubare a temperatura ambiente per 35 minuti per consentire fissaggio della fibronectina.
12. Dopo 35 minuti, aggiungere PBS ad ogni piastra di Petri e conservare a 4 ° C per un massimo di 2 settimane.

4. Esperimenti Forza di trazione

1. Mezzi pesanti cella, PBS, e tripsina a 37 ° C in un bagno d'acqua.
2. Sciacquare gel 5x con PBS sterile, aspirare il PBS tra risciacqui, e lasciare coperto nel cappuccio.
3. Aggiungere 1 ml di tripsina ogni 25 cm ² per le cellule boccetta contenente. Dopo che le cellule vengono sollevati dal pallone, diluire il tripsina con supporto di cellule e contare le cellule. Sulla base della superficie del gel, determinare il numero di cellule necessarie per gel per un finale densità di semina cellulare di 3.000 cellule / cm ^2. Diluire o concentrato sospensione tale che 150 ml di miscela di cellule-media contiene il numero di cellule. Aliquote di 150 ml di suspens cellulariion a ogni gel.
4. Porre le capsule Petri contenenti le cellule in un incubatore per 30 min. Quindi, rimuovere accuratamente le piastre di Petri e riempire il resto della piastra di Petri con i media (circa 2 ml) tale che la superficie del piatto è completamente sommerso.
5. Porre le capsule di Petri torna in incubatrice fino acquisizione delle immagini.
6. Preparare il sistema di acquisizione dati microscopio e per l'imaging: inserire l'obiettivo ad immersione 40x acqua, inserire il contrasto di interferenza differenziale (DIC) prisma, selezionare il mCherry o il filtro fluorescente equivalente, e accendere la camera ambientale.
7. Quando preparate per l'imaging, rimuovere una piastra di Petri dal termostato e posizionarlo delicatamente sul palco microscopio. Togliere il coperchio piatto di Petri per l'imaging DIC.
8. Individuare una singola cella e catturare una singola immagine fissa della cella in DIC.
9. Senza spostare il palco microscopio, cambiare la modalità di imaging di fluorescenza. Focus sulle microsfere fluorescenti e recORD un'immagine delle microsfere.
10. Rimuovere con attenzione supporti cella dalla piastra di Petri con una pipetta e aggiungere 0,05% tripsina-EDTA.
11. Immagine le microsfere sotto la cella dopo che le cellule hanno staccato.
12. Usa particella immagine velocimetry (PIV) analisi in ImageJ ¹² per calcolare il campo di spostamento a causa di forze cellulari.

Risultati

L'imaging confocale è stato utilizzato per determinare che le perle erano effettivamente sotto la superficie del gel e di quantificare la loro collocazione precisa all'interno della profondità di gel. Perline fluorescenti di una lunghezza d'onda diversa da quelle all'interno del gel sono stati lasciati depositare sulla superficie, e la distanza tra le nanoparticelle fluorescenti incorporate e quelle sulla superficie è stata calcolata utilizzando un algoritmo di identificazione centroide. La posizione ...

Discussione

Quando si utilizza questa tecnica, è essenziale che la soluzione tallone è correttamente diluito e le perline sono scelti in base a diametro desiderato, PA substrato gel rigidità, e la scala di grandezza dei fenomeni che è esplorato nell'esperimento desiderato.

Si deve usare cautela quando si diluisce la soluzione tallone prima di funzionalizzazione migliori scivola copertura in vetro. La spaziatura tra le perle sulla superficie del gel può essere modificata variando il fattore di d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES)	Sigma-Aldrich	281778
70% Glutaraldehyde	Polysciences, Inc.	111-30-8
1 M HEPES buffer solution	Sigma-Aldrich	83264
40% Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
2% Bisacrylamide	Sigma-Aldrich	M1533
0.1 µm Fluorescent microspheres (mCherry)	Invitrogen	F8801
Fibronectin, Human, 1 mg	BD Biosciences	354008
Ammonium persulfate	Bio-RAD	161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Bio-RAD	161-0801
Poly-D-lysine	Millipore	A-003-E
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)	Thermo Scientific	22980
N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)	Thermo Scientific	24500
0.05% Trypsin-EDTA (1X)	Life Technologies	25300-054
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
Acrylic acid	Sigma-Aldrich	147230
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M3671
Materials
35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass	In Vitro Scientific	D35-14-1-N
Glass cover slips, 12 mm diam.	Ted Pella, Inc.	26023