トラクション力顕微鏡用の細胞培養表面近くのローカライズレポーター蛍光ビーズのための新しい方法

要約

蛍光プローブを含有するポリアクリルアミド（PA）ゲルを製造するための伝統的な技術は、接着面とスライドガラスの間にゲルを挟むことを含む。ここでは、ポリ-D-リジン（PDL）および蛍光プローブを用いたこのスライドを被覆するゲル表面から1.6ミクロン以内のプローブを局在化することを示している。

要約

PAゲルは長い製作、チューニング、その弾性特性をする能力の容易さに起因する細胞牽引力を研究するためのプラットフォームとして使用されてきた。基質は細胞外マトリックスタンパク質でコーティングされたとき、細胞がゲルに付着し、ゲルを変形させる、力を加える。変形は、細胞牽引力とゲルの弾性特性に依存します。表面の変形場が既知の場合、表面牽引弾性理論を用いて計算することができる。ゲルの変形は、一般的にゲル中に均一に蛍光マーカービーズを埋め込むことによって測定される。プローブは、ゲルが変形として変位する。ゲルの表面近くでプローブが追跡されます。これらのプローブによって報告変位が表面変位と見なされる。表面からの彼らの深さは無視されます。この仮定は、牽引力評価に誤差が導入されています。ビーズの位置が知られるために、細胞の力の正確な測定のためには重要である。私たちは、開発した表面の1.6μmの範囲内、PAゲル中で、直径が0.1〜1μmのを蛍光マーカービーズを閉じ込めるために、単純な化学的性質を利用した技術。私たちはコートポリ-D-リジン（PDL）とカバーガラスと蛍光ビーズ。 PAゲル溶液を次にカバースリップと付着面の間に挟まれている。蛍光ビーズは、硬化中にゲル溶液を移す。重合後、PAゲルは、ゲル表面に近い面上に蛍光ビーズが含まれています。

概要

その局所環境との生体細胞の機械的相互作用は、一般的にPAゲルを用いて研究されている。これらの基板は、これらの基質の主な利点の¹つは1997年にDemboおよびWangによって確立単純な、十分に特徴付けられたプロトコルに依存して、その剛性がゲル溶液の特定の成分の濃度を変更することによって調整することができるということである。これは、異なる剛性の環境と細胞の相互作用を研究するのが望ましいのプラットフォームを提供します。 PAゲルを、細胞外マトリックス（ECM）タンパク質で被覆されている場合には、細胞が力を発生させる、それらに付着する。細胞力の結果として、ゲルは、弾性体として変形する。この変形は、細胞およびゲルの弾性特性によって印加される力の大きさに依存する。さまざまな研究は、細胞の牽引力を調査するためにPAゲルを採用している。

PAゲル製造の一変形例では、蛍光ミクロスフェア（ビーズ）tで埋め込まれている異なる剛性²のゲル上の細胞牽引力を定量化するためにゲルをhroughout。細胞力を印加すると、ビーズは、ゲル変形に追従し、その初期の場所から移動さ。変形場は、個別のビーズの変位から測定される。この変形場は、弾性理論と牽引力を計算するために、ゲルの弾性特性を用いて利用される。これらの測定は、細胞が機械的に感知し、それらの局所微小環境³と対話する方法についての洞察を提供しています。

多くの広く使用されているPAゲルの製造のプロトコルでは、ビーズはその液体、未重合状態のPAゲル全体に混在している。完全に重合のPAゲルは、その体積全体蛍光ビーズが含まれています。細胞の牽引力を計算するときに、ゲル表面（細胞 - 基板界面）付近の最もビーズが監視される。これらのビーズの変位は、力で簡単にするために、細胞培養表面上で起こると仮定されるcalculationは。ゲルの深さの中のビーズの実際の位置は無視されます。しかし、弾性媒質中（例えば、PAゲルなど）、力の作用点に近いビードが遠くにポイントからであるビード以上に移動します。このように、携帯トラクションの過小評価における表面の結果で、そのような面から遠位（ビーズの位置で）点の変位を処理する。誤差の程度は、表面からのビーズの距離に依存する。エラーは、ビーズの位置についての知識なしに推定することができない。

非常に細胞培養表面の近くでビーズを閉じ込めるための単純な方法の必要性は、いくつかの技術により対処されてきた。一つの方法は、非常に表面近傍の動きを測定するための上部焦点面内のビーズの十分な数があるようにゲル全体を通してビーズの密度を増加させることである。別の技術は、光のことを生細胞イメージングのための共焦点撮像チャンバーを構築することを含む最上部の焦点面での唯一のビーズは^4収集されます。別の方法は、ビーズ⁵せずに、既に重合したゲルの上にビーズを含有するPAゲルの非常に薄い層を重ねることを含む。これらの技術のそれぞれの欠点は、ゲル内のビーズの正確な位置が分からないことである。これは、ビーズの変位場、したがって、細胞力の計​​算の計算に誤差が導入されています。別の技術は、スルホ-SANPAH ^6を用いて既に重合PAゲルの上面にビーズの結合を伴う。この手法は、ビーズのみPAゲルの上に実際にいることを保証するが、それらはゲルの深さに埋め込まれている程度は不明である。従来の研究では、細胞が数ミクロン離れて⁷の力を感じることができることを示唆しているので、これは潜在的に、細胞の挙動を変化させることができ、細胞のためのローカルな地形を作成することができます。最近では、直径1μmfにPAゲルをパターニングするための技術正則配列内luorescentフィブロネクチンドットマーカーは^、8を設立しました。この場合、蛍光マーカーの深さが知られており、フィブロネクチンパターンが間接的にゲル表面に印刷されるように、本質的にゼロである。 ECMタンパク質は、直径1μmドットに制限されているようしかし、この方法では、細胞が付着できる上に連続的な環境を提供していません。完全に極めて表面近くに既知の場所にPAゲル内トラッカービーズを統合し、それらを閉じ込めるための方法は未だ確立されなければならない。

ここでは、非常にPAゲル内の細胞培養表面の近くに焦点面にミクロン径蛍光ビーズ、サブミクロンを制限する技術を開発する。ゲルは、典型的には、2枚のガラス板の間に未重合液体ゲル溶液を挟んで硬化される。ゲルは強く、それに付着するようにプレートの一つは、官能化されている。他の非官能化し、ゲルが硬化した後に除去される。私たちは、この取り外し可能なガラスのsuを変更ビーズの層で被覆することによりデータポート。官能化及びビーズコーティングされたガラス表面との間に液体ゲルを挟む際に、ゲルビーズへの転送は、それが硬化される。これは、表面の1.6μmの範囲内にゲルにビーズ「統合の距離を制限。ガラス底ペトリ皿は、ゲルが硬化された接着性の表面として使用される。重合の間に平坦な頂ゲル表面を形成するために、円形のガラスカバースリップは、ガラス底ペトリ皿で​​のゲルサンドイッチに使用される。ゲルの製造に先立って、上部ガラスカバースリップは、正の表面電荷を生じる、ポリ-D-リジン（PDL）でコーティングされている。 PDLは、圧縮空気で吹き飛ばしており、水中のビーズの溶液をカバースリップ上に堆積される。私たちは、負の電荷を運ぶカルボキシル化蛍光マイクロビーズを利用して、PDLで処理することによって作成された、正に帯電した表面と相互作用する。圧縮空気でカバースリップオフビーズ溶液を吹き付けた後、単層のビーズは、静電的に乾燥したカバースリップに結合されたままになります。ガラススライドに損傷がなく、完全に無傷のPAゲルから除去されるように、PDLコーティングは、ゲル表面にガラスの接着性には影響しません。

ガラス底ペトリ皿は、97％3 - アミノプロピル - trimethoxyslianeおよび0.5％グルタルアルデヒドで処理することにより付着行われる。希望剛性のPAゲルは、標準的な手順⁹を介してビスアクリルアミドとアクリルアミドの適切な濃度を混合することにより作成される。ゲル溶液の液滴は、ガラス底ペトリ皿上にピペットされる。ビーズを含むガラスカバースリップをペトリ皿にゲルを挟むために使用される。ゲルが硬化した場合、トップカバースリップは、表面から1.6μmの範囲内のPAゲル中に埋め込まれたビーズを残して削除されます。

プロトコル

製造および細胞培養表面の近くに埋め込まれた蛍光ミクロスフェアとの剛性を変化させるPAゲルを官能化する。

1トップガラスカバースリップを官能

1. クリーンガラスカバースリップ（＃1.0、12mmのDIAM。）石鹸と水で、余分なゴミを除去するためにエタノールが続く。
2. それらはカバースリップとの相互作用を容易にするために触れないようおろし面に置き、ガラスカバースリップ（ すなわちピペットチップホルダー）。
3. コートカバーの表面全体が1時間（ 図1A）のためのポリ-D-リジン（0.1 mg / ml）を用いてスリップ。
4. この時間の間、1行う：直径0.1μmのコロイド溶液の10,000希釈し、脱イオン（DI）水を用いて赤色蛍光ミクロスフェアは、ゲル表面上に20μmの²当たり約1マイクロスフェアの粒子密度を得る。さまざまな希釈の結果については、図2を参照してください。このdilutionは、特定の実験の必要性を満たすように修正することができる。
5. 30分間の超音波水浴中で希釈した溶液を配置します。
6. 1時間後、慎重に各カバースリップを持ち上げ、空気で乾燥爆破するピンセットを使用しています。すりおろした表面にドライカバースリップを返します。
7. 各カバースリップの上に超音波浴とピペットを150μlから希釈したコロイド溶液を削除します。 10分（ 図1B）に向けて出発。
8. 慎重に各カバースリップを持ち上げ、空気で乾燥送風するピンセットを使用してください。使用するまで暗所におろし面とストアに乾燥カバースリップを返します。

直接グラスボトムペトリ皿上のPAゲルの準備2。

1. 100℃に予熱ホットプレート。
2. 化学ヒュームフード内の平らな面に（14ミリメートルマイクロウェル、＃1.0と35mmディッシュ）ガラス底ペトリ皿の所望の数をレイアウト。
3. 97％3 - アミノプロピル - trimethoxys各ペトリ皿のマイクロウェルのガラス部分をカバーつる植物化学的活性化のために7分間（3-APTES）。ポリスチレンの劣化を避けるために、ペトリ皿プラスチックの表面に3-APTESの不注意液だれしないように注意してください。
4. 7分後、DI水を用いてペトリ皿に充填し、廃棄物容器に廃棄する。
5. その後繰り返し各皿のためのステップ2.4​​の3倍、そして余分な水を除去するためにペトリ皿を振る。ガラス部分が乾燥するまでホットプレート上でペトリ皿を置きます。
6. ホットプレートからシャーレを取り出し、化学ドラフト内で平らな面に戻ります。
7. 化学ドラフト内で、0.5％グルタルアルデヒドの溶液を作製し、30分間溶液を各ウェルシャーレのガラス部分を覆う。プラスチックの劣化を避けるために、ペトリ皿プラスチックの表面にグルタルアルデヒドの不注意滴下をしないように注意してください。
8. 30分後、DI水を用いてペトリ皿に充填し、すすぐために廃棄物容器に廃棄しglutaraldを除去ルデヒド。
9. その後繰り返し各皿のためのステップ2.4​​の3倍、そして余分な水を除去するためにペトリ皿を振る。ガラス部分が乾燥するまでホットプレート上でペトリ皿を置きます。
10. PAゲル溶液の成分を混合する前に、ガラス底のゲルの迅速な挟み込みを考慮して、それらが容易にアクセス可能であるように化学ヒュームフードに官能化ガラススライドを移動させるゲル溶液を混合した後、ペトリ皿。
11. 15mlの遠心管中で、所望のマトリックス弾性を達成するために、（公開されたプロトコル¹⁰から適応） 表1に列挙された濃度で、即時に連続して40％ビスアクリルアミド、2％のアクリルアミド、およびアクリル酸を混合する。
12. ゲル溶液を完了するために、所望のマトリックス弾性に対応する表1に列挙される量で、100mMのHEPES、10％の過硫酸アンモニウムおよびTEMEDを加える。
13. すぐにガラス部分の中央にゲル溶液の15μlのピペットペトリ皿の。
14. すぐにピンセットで官能化されたガラスカバースリップを拾う。
    1. 蛍光ビーズは、ゲル溶液との副意思コンタクト上になるように上のガラスカバースリップを反転します。
    2. 官能化された側は、ゲル（ 図1C）に接触するようになりました-液体PAゲルの上に静かにカバースリップを置きます。注：最良の結果を得るには、二人目は、複数のペトリ皿上に液体のPAゲル溶液をピペットしながら、部分重合の可能性を避けるために、カバースリップを追加する役割をすることをお勧めします。
15. PAゲルの下位レベルに重合した蛍光ナノ粒子上の重力の影響を回避することを支援するために、すべてのペトリ皿を裏返し。
16. 少なくとも35分間待って、またはPAゲルの原液は目に見えて、その遠心管中で重合されるまで。
17. 振り返ってペトリ皿を裏返して、カバースリップを除去しながら支援するために、PBSでそれらを埋める。
18. 慎重にカバースリップの周囲を掻き取るピンセットを使用して、ペトリ皿のガラス部分およびカバースリップの輪郭に接触する。カバーガラスが脱落するまで、数サイクルを実行します。カバースリップを外し、適切な鋭利物廃棄容器に廃棄してください。
19. すべてのカバースリップを除去した後、蛍光ビーズは、ゲル（ 図1D）に移しています。 PBSで完全にPAゲルをカバーし、各皿にペトリ皿のふたを置き、4℃で保管してください。

3フィブロネクチンとPAゲルを官能

1. 溶液（137mMの塩化ナトリウム、5％（v / v）グリセロール）に浸し、2×結合緩衝液（0.2 M 2（Nのモルホリノ）エタンスルホン酸（MES）、10：確立されたプロトコル¹¹で説明したように、以下の予混合溶液を調製する％（v / v）グリセロール、pH4.5中）。
2. PAゲルを含むガラスボトムディッシュからすべてのPBSを除去するために、生物学的フード内の真空ポンプを使用してください。
3. ピペットでteのゲルが完全に水没するように、各ゲル上に溶液を浸します。少なくとも1時間室温でインキュベートする。
4. 室温に1 -エチル-3 - [3 -ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩（EDC）及びN -hydroxysulfosuccinimide（NHS）暖かい。
5. EDC（150​​mMの、19 mg / mlのDI水中）およびNHS（250ミリモル、29 mg / mlのDI水中）の10倍の溶液を混合する。
6. 1部の10倍のEDC、1部の10倍のNHS、3部DI水、および結合バッファー2×5部を混ぜる。
7. 浸す溶液を除去するために、生物学的フード内の真空ポンプを使用してください。すべての液体をゲル表面から除去されていることを確認します。
8. ゲル表面を覆い、ペトリ皿（150〜250μl）を、ガラス底のウェルを満たすのに十分なNHS / EDC溶液を添加する。暗所で30分間室温でインキュベートする。
9. 室温で解凍フィブロネクチン。解凍したら、50μg/ mlのフィブロネクチンソリューションを作成するの滅菌DI水を混ぜる。
10. NHS / EDCソリューを除去するために、生物学的フード内の真空ポンプを使用しる。すべての液体をゲル表面から除去されていることを確認します。
11. 各ゲルにフィブロネクチン溶液150μlを追加します。フィブロネクチンの結合を可能にするために35分間室温でインキュベートする。
12. 35分後、2週間まで4℃で各ペトリ皿や店舗に、PBSを追加します。

4。トラクションフォース実験

1. 温かい細胞培地、PBS、そして水浴中37℃でトリプシン。
2. ゲルはリンスの間に、PBSを吸引、滅菌PBSで5倍、そしてフード内でカバーされたまま洗浄します。
3. 細胞を含むフラスコに25cm ^2の当たり1mlのトリプシンを追加します。細胞がフラスコから持ち上げられた後、細胞培地でトリプシンを希釈し、細胞をカウントします。ゲルの表面積に基づいて、/ cm ²で3,000細胞の最終細胞播種密度をゲルごとに必要な細胞の数を決定する。希釈してまたは細胞培地混合物を150μlの細胞のこの数を含むようにサスペンションを集中。一定分量の細胞suspens150μlの各ゲルに上のイオン。
4. 30分間インキュベーター内で細胞を含有するペトリ皿を置きます。その後、慎重にペトリ皿を除去し、皿の表面が完全に水没するようなメディア（約2ml）を用いてペトリ皿の残りを埋める。
5. 画像取得まで、インキュベーター内でシャーレをバックに配置します。
6. 、微分干渉コントラスト（DIC）プリズムを挿入し、40倍の水浸対物レンズを挿入mCherryをまたは同等の蛍光フィルターを選択し、環境室をオンにします。イメージングのための顕微鏡とデータ収集システムを準備します。
7. イメージングのために準備すると、インキュベーターから1ペトリ皿を取り外し、顕微鏡ステージ上で静かに置きます。 DICイメージングのためのペトリ皿のふたを取り外します。
8. 単一のセルの位置を確認し、DIC内のセルの1枚の静止画をキャプチャします。
9. 顕微鏡ステージを移動させることなく、蛍光を撮像モードに切り替える。蛍光マイクロスフェアとRECに注力微小球のイメージをORD。
10. 慎重にピペットでペトリ皿から細胞培地を除去し、0.05％トリプシン-EDTAを追加します。
11. イメージセル後のセルの下の微小球が切り離されている。
12. 使用して粒子画像流速測定法（PIV）携帯力による変位場を計算するためにはImageJ ¹²での分析。

結果

共焦点イメージングは​​、ビーズがゲル表面の下に実際にあったことを決定するために、ゲル深度内にそれらの正確な位置を定量した。ゲル内のものとは異なる波長の蛍光ビーズは、表面上に沈降させ、埋め込み蛍光ナノ粒子表面上のそれらの間の距離は、重心の同定アルゴリズムを用いて計算した。ゲル表面上のビーズの位置はゲルの細胞表面への付着の際に力を加えるの上面の基準と?...

ディスカッション

この技術を使用する場合は、ビーズ溶液が適切に希釈し、ビーズを所望の直径、PAゲル基材の剛性、および所望の実験で調査された現象の大きさの尺度に基づいて選択されることが不可欠である。

トップガラスカバースリップを官能する前にビーズ溶液を希釈する際に注意すべきである。ゲル表面上のビーズ間の間隔は、コロイド溶液の希釈係数を変更することによって...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES)	Sigma-Aldrich	281778
70% Glutaraldehyde	Polysciences, Inc.	111-30-8
1 M HEPES buffer solution	Sigma-Aldrich	83264
40% Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
2% Bisacrylamide	Sigma-Aldrich	M1533
0.1 µm Fluorescent microspheres (mCherry)	Invitrogen	F8801
Fibronectin, Human, 1 mg	BD Biosciences	354008
Ammonium persulfate	Bio-RAD	161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Bio-RAD	161-0801
Poly-D-lysine	Millipore	A-003-E
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)	Thermo Scientific	22980
N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)	Thermo Scientific	24500
0.05% Trypsin-EDTA (1X)	Life Technologies	25300-054
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
Acrylic acid	Sigma-Aldrich	147230
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M3671
Materials
35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass	In Vitro Scientific	D35-14-1-N
Glass cover slips, 12 mm diam.	Ted Pella, Inc.	26023