Une nouvelle méthode pour localiser rapporteur fluorescent Perles près de la surface de culture cellulaire pour Traction Force Microscopy

Résumé

Les techniques traditionnelles de fabrication de polyacrylamide (PA) des gels contenant des sondes fluorescentes consistent en sandwich un gel entre une surface adhérente et une lame de verre. Ici, nous montrons que le revêtement de cette lame avec la poly-D-lysine (PDL) et des sondes fluorescentes localise les sondes à l'intérieur de 1,6 um à partir de la surface du gel.

Résumé

Gels PA ont longtemps été utilisés comme une plate-forme pour étudier les forces de traction cellulaire raison de la facilité de fabrication et la capacité d'ajuster leurs propriétés élastiques. Lorsque le substrat est revêtu d'une protéine de la matrice extracellulaire, les cellules adhèrent au gel et appliquent des forces, ce qui provoque le gel de se déformer. La déformation dépend de la traction de la cellule et les propriétés élastiques du gel. Si le champ de la surface de déformation est connu, la traction de la surface peut être calculée en utilisant la théorie de l'élasticité. Gel de déformation est généralement mesurée par incorporation de perles de marqueur fluorescent uniformément dans le gel. Les sondes déplacent que le gel se déforme. Les sondes proches de la surface du gel sont suivies. Les déplacements signalés par ces sondes sont considérés comme des déplacements de surface. Leurs profondeurs de la surface sont ignorés. Cette hypothèse introduit une erreur dans l'évaluation de la force de traction. Pour une mesure précise des forces de cellules, il est essentiel que l'emplacement des billes, qui sera appelée. Nous avons développéune technique qui utilise la chimie simple de limiter les perles de marqueurs fluorescents, 0,1 et 1 pm de diamètre, dans des gels d'AP, à l'intérieur de 1,6 pm de la surface. On couche une lamelle couvre-objet avec du poly-D-lysine (PDL) et des billes fluorescentes. Solution de gel PA est alors pris en sandwich entre la lamelle et une surface adhérente. Les billes fluorescentes pour transférer la solution de gel au cours du durcissement. Après polymérisation, le gel contient des billes fluorescentes PA sur un plan proche de la surface du gel.

Introduction

L'interaction mécanique d'une cellule vivante avec son environnement local a souvent été étudiée en utilisant des gels de l'AP. Ces substrats reposent sur ​​un protocole simple et bien établi caractérisé par Wang et Dembo en 1997 ^1. L'un des principaux avantages de ces substrats est que leur rigidité peut être ajustée en modifiant les concentrations des composants spécifiques de la solution de gel. Ceci fournit une plate-forme souhaitable d'étudier l'interaction des cellules avec des environnements de rigidités différentes. Lorsque gels PA sont recouvertes d'matrice extracellulaire de protéines (ECM), les cellules adhèrent à eux, de génération de force. En raison de la force de la cellule, le gel se déforme comme un corps élastique. Cette déformation dépend de la grandeur de la force appliquée par les cellules et les propriétés élastiques du gel. Diverses études ont utilisé des gels PA pour enquêter sur les forces de traction cellulaires.

Dans une variante de PA gel fabrication, microsphères fluorescentes (perles) sont intégrés tout au long de gel de quantifier les forces de traction cellulaire sur des gels de différentes rigidités ^2. Lors de l'application de la force de la cellule, les billes déplacent à partir de leur position initiale après une déformation de gel. Le champ de déformation est mesurée à partir des déplacements individuels de talons. Cette zone de déformation est utilisé par la théorie de l'élasticité et les propriétés élastiques du gel de calculer les forces de traction. Ces mesures permettent de mieux comprendre la façon dont les cellules détectent et interagissent avec leur micro-environnement local ³ mécaniquement.

Dans de nombreux protocoles gel de fabrication largement utilisées PA, les perles sont mélangées à travers le gel PA dans son état liquide, non polymérisé. Un gel PA entièrement polymérisé contient des billes fluorescentes dans tout son volume. Lorsque le calcul de forces de traction de la cellule, la plupart des perles près de la surface du gel (de l'interface cellule-substrat) sont surveillés. Les déplacements de ces billes sont supposées se produire sur la surface de culture cellulaire pour la simplicité de la force CALCULn. La position réelle des perles au sein de la profondeur du gel n'est pas respectée. Cependant, dans un milieu élastique (tel que le gel PA), un cordon plus proche d'un point d'application de la force se déplace plus d'un bourrelet qui est plus éloignée de la pointe. Ainsi, le traitement du déplacement d'un point (à l'emplacement du bourrelet) distale par rapport à la surface que celle de la surface conduit à une sous-estimation des tractions cellulaires. Le degré d'erreur dépend de la distance de la bille à partir de la surface. L'erreur ne peut être estimée à l'insu de l'emplacement du cordon.

Le besoin d'une méthode simple pour limiter les perles très près de la surface de culture cellulaire a été traitée par plusieurs techniques. Un moyen consiste à augmenter la densité des billes de gel tout au long de telle sorte qu'il y ait un nombre suffisant de billes dans le plan focal supérieur à mesurer le mouvement très près de la surface. Une autre technique consiste à construire une chambre d'imagerie confocal pour l'imagerie des cellules vivantes de telle sorte que la lumière provenant deseules les billes dans le plan focal le plus supérieur est recueilli ^4. Une autre méthode consiste à superposer une couche extrêmement mince de gel PA contenant des billes sur le dessus d'un gel déjà polymérisé sans billes ^5. Un inconvénient de chacune de ces techniques est que l'emplacement précis des billes dans le gel n'est pas connue. Cela introduit une erreur dans le calcul du champ de déplacement des billes, et donc le calcul des forces de cellules. Une autre technique consiste à conjugaison de billes à la surface supérieure d'un gel PA déjà polymérisé en utilisant sulfo-SANPAH ^6. Cette technique assure les billes sont en effet uniquement sur la partie supérieure du gel PA, mais la mesure dans laquelle elles sont noyées dans l'épaisseur du gel est inconnu. Cela pourrait créer une topographie locale pour les cellules, ce qui pourrait modifier le comportement de la cellule, comme un travail préalable a suggéré que les cellules peuvent sentir la force de quelques microns de distance ^7. Récemment, une technique de structuration gels PA avec 1 um de diamètre fluorescent marqueurs fibronectine de points dans un tableau régularisée a été créé ^8. Dans ce cas, la profondeur des marqueurs fluorescents est connu, et est pratiquement nul, car le motif de la fibronectine est indirectement imprimé sur la surface du gel. Cependant, cette méthode ne fournit pas un environnement continu sur lequel les cellules peuvent se fixer, comme la protéine d'ECM est limitée à 1 um de diamètre des points. Une méthode pour intégrer pleinement les perles tracker dans des gels d'AP et les confiner dans un endroit connu de très près de la surface n'a pas encore été établie.

Ici, on développe une technique pour contraindre sous-um de diamètre de billes fluorescentes um à un plan focal à proximité de la surface de culture cellulaire à l'intérieur de gel PA. Un gel est habituellement durci par solution en sandwich de gel liquide non polymérisé entre deux plaques de verre. Une des plaques est fonctionnalisé de sorte que le gel adhère fortement à elle. L'autre est non fonctionnalisé et est retiré après les cures de gel. Nous modifions ce verre amovible surface en le revêtant avec une couche de billes. Lors de la prise en sandwich entre le gel liquide fonctionnalisé et la surface de verre revêtue de talon, le transfert des billes de gel pendant qu'il durcit. Cela limite la distance de l'intégration des perles dans le gel à 1,6 um de la surface. Plats de Pétri à fond de verre sont utilisés en tant que la surface adhérente sur laquelle le gel est durci. Pour former une surface supérieure plate de gel au cours de la polymérisation, une lamelle circulaire de verre est utilisé pour prendre en sandwich le gel de la boîte de Pétri à fond de verre. Avant de gel fabrication, le couvercle en verre haut glissement est recouvert de poly-D-lysine (PDL), ce qui donne une charge de surface positive. Le PDL est soufflé avec de l'air comprimé, et une solution de billes dans l'eau est déposée sur les lamelles. Nous utilisons des microbilles fluorescentes carboxyles, qui portent une charge négative, et d'interagir avec la surface chargée positivement créé par traitement avec PDL. Après soufflage de la solution de talon de la lamelle couvre-objet avec de l'air comprimé, une seule couche deperles demeure électrostatique couplé à la lamelle sec. Le revêtement PDL n'affecte pas l'adhérence du verre à la surface du gel, comme les lames de verre sont en bon état et présente dans le gel PA intact.

Les boîtes de Pétri à fond de verre sont faites adhérente par un traitement avec 97% de 3-aminopropyl-trimethoxysliane et 0,5% de glutaraldéhyde. Gels PA de rigidités souhaités sont créés en mélangeant des concentrations appropriées de bisacrylamide et d'acrylamide par une procédure standard ^9. Une goutte de la solution de gel est introduit à la pipette sur la boîte de Pétri à fond de verre. La lamelle couvre-objet en verre contenant les billes est utilisé pour prendre en sandwich le gel de la boîte de Pétri. Lorsque le gel est durci, le couvercle supérieur est enlevé, laissant glisser les perles noyées dans le gel à l'intérieur de PA 1,6 um à partir de la surface.

Protocole

La fabrication et la fonctionnalisation des gels d'AP de raideurs des microsphères fluorescentes incorporées à proximité de la surface de culture cellulaire ou moins.

1. fonctionnalisation des Top couvercle en verre glissades

1. Nettoyer les lamelles de verre (# 1.0, 12 mm diam.) Avec de l'eau et du savon, puis par de l'éthanol pour enlever la poussière étrangère.
2. Lieu couvercle de verre glisse sur une surface râpée (c.-à-support d'embout de pipette) de telle sorte qu'ils ne se touchent pas pour faciliter l'interaction avec les lamelles.
3. Enduire la surface de la couverture glisse avec Poly-D-Lysine (0,1 mg / ml) pendant 1 h (figure 1A).
4. Pendant ce temps, effectuer une dilution de 1: 10 000 de la solution de colloïde de 0,1 um de diamètre, les microsphères fluorescentes rouges avec désionisée (DI) de l'eau pour obtenir une densité de particule d'environ 1 pm 20 microsphères par ^deux sur la surface du gel. Voir la Figure 2 pour les résultats de différentes dilutions. Cette dilution peut être modifié pour répondre aux besoins des expériences spécifiques.
5. Placer la solution diluée dans un bain d'eau à ultrasons pendant 30 min.
6. Après 1 heure, utiliser des pinces pour soulever soigneusement chaque lamelle et sécher à l'air. Remettre les lamelles sèches à la surface râpé.
7. Retirer la solution colloïdale diluée du bain ultrasonique et pipette 150 ul sur chaque lamelle. Laisser reposer 10 min (figure 1B).
8. Utilisez des pinces pour soulever soigneusement chaque lamelle et sécher à l'air. Retour la couverture sèche glisse à la surface râpé et magasin dans le noir jusqu'au moment de servir.

2 Préparation PA gel directement sur le verre des boîtes de Pétri de fond

1. Plaque de cuisson Préchauffer le four à 100 ° C.
2. Disposez le nombre désiré de fond de verre des boîtes de Pétri (35 mm plat 14 mm micro-bien, # 1.0) sur une surface plane dans une hotte chimique.
3. Couvrir la partie en verre de chaque boîte de Pétri micro-bien avec 97% 3-aminopropyl-trimethoxysliane (3 APTES) pendant 7 min pour l'activation chimique. Prenez garde à éviter les entrées par inadvertance des 3-APTES à la surface de la matière plastique dans la boîte de Pétri pour éviter la dégradation du polystyrène.
4. Après 7 minutes, remplir la boîte de Pétri avec de l'eau DI et disposer dans un contenant à déchets.
5. Répétez l'étape 2.4 3x pour chaque plat, puis secouez la boîte de Pétri pour éliminer l'eau supplémentaire. Placez les boîtes de Pétri sur la plaque chauffante jusqu'à ce que la partie en verre est sec.
6. Retirez les boîtes de Petri de la plaque chaude et revenir à une surface plane dans une hotte chimique.
7. Dans une hotte chimique, préparer une solution de glutaraldéhyde à 0,5% et couvrir la partie de verre de chaque boîte de Pétri avec la même solution pendant 30 min. Prendre des précautions pour éviter les entrées par inadvertance du glutaraldéhyde à la surface de la matière plastique dans la boîte de Petri pour éviter la dégradation de la matière plastique.
8. Après 30 minutes, remplir la boîte de Pétri avec de l'eau déminéralisée et disposer dans un récipient des déchets de rincer et enlever le glutaraldehyde.
9. Répétez l'étape 2.4 3x pour chaque plat, puis secouez la boîte de Pétri pour éliminer l'eau supplémentaire. Placez les boîtes de Pétri sur la plaque chauffante jusqu'à ce que la partie en verre est sec.
10. Avant de mélanger les composants de la solution de gel PA, déplacer les lames de verre fonctionnalisées dans la hotte chimique de telle sorte qu'ils sont facilement accessibles, ce qui permet la prise en sandwich rapide du gel avec le fond de verre des boîtes de Petri après mélange de la solution de gel.
11. Dans un tube à centrifuger de 15 ml, mélanger 40% de bisacrylamide, 2% d'acrylamide et d'acide acrylique, en succession immédiate dans les concentrations indiquées dans le tableau 1 (adaptation de protocole publié ¹⁰⁾ pour obtenir l'élasticité souhaitée de la matrice.
12. Ajouter 100 mM de HEPES, 10% de persulfate d'ammonium et le TEMED en quantités indiquées dans le tableau 1 correspondant à l'élasticité de la matrice souhaitée pour compléter la solution de gel.
13. Immédiatement pipette 15 ul de la solution de gélatine sur le centre de la partie en verredes boîtes de Pétri.
14. Ramasser immédiatement un verre lamelle fonctionnalisé avec des pincettes.
    1. Retourner la lamelle couvre-objet en verre au-dessus de telle sorte que les billes fluorescentes sont sur la prise de contact latéral avec la solution de gel.
    2. Disposer la lamelle doucement sur ​​le dessus du gel maintenant PA-liquide de telle sorte que le côté fonctionnalisé est en contact avec le gel (Figure 1C). Remarque: Pour de meilleurs résultats, une deuxième personne est recommandé pour le rôle de l'ajout de la lamelle afin d'éviter le risque de polymérisation partielle tandis que le pipetage liquide solution de gel PA sur plusieurs boîtes de Pétri.
15. Retournez toutes les boîtes de Pétri sur pour aider à éviter les effets de la gravité sur les nanoparticules fluorescentes de polymérisation dans les niveaux inférieurs du gel PA.
16. Attendez au moins 35 minutes, ou jusqu'à ce que la solution mère de gel PA a visiblement polymérisé dans son tube de centrifugeuse.
17. Retourner les boîtes de Pétri à l'endroit et de les remplir avec du PBS pour aider à enlever la lamelle.
18. Faire soigneusement tout contact avec la partie en verre de la boîte de Pétri et le contour de la lamelle, en utilisant des pinces à gratter de la circonférence de la lamelle. Effectuer plusieurs cycles jusqu'à ce que la lamelle est délogé. Retirer la lamelle et éliminer dans un récipient approprié des déchets piquants ou coupants.
19. Après avoir retiré toutes les lamelles, perles fluorescentes ont transféré au gel (figure 1D). Couvrir les gels PA complètement avec du PBS, placez le plat couvercle Petri sur chaque plat, et conserver à 4 ° C.

3. fonctionnalisation gel PA avec la fibronectine

1. Préparer les solutions ci-après prémélangés, comme décrit dans un protocole établi ^11: solution de trempage (137 mM NaCl, 5% (v / v) de glycerol) et le tampon 2x de conjugaison (0,2 M 2 (N-morpholino) de l'acide éthanesulfonique (MES), 10 % (v / v) de glycerol, pH 4,5).
2. Utilisez une pompe à vide dans une hotte biologique pour éliminer tous PBS des plats à fond de verre contenant les gels PA.
3. Pipette solution de trempage sur chaque gel tel que le gel est complètement submergé. Incuber à température ambiante pendant au moins 1 heure.
4. Chaud 1-éthyl-3-[3-diméthylaminopropyl] carbodiimide chlorhydrate (EDC) et du N -hydroxysulfosuccinimide (NHS) à température ambiante.
5. Mélanger 10x solutions d'EDC (150 mM, 19 mg / ml dans de l'eau DI) et NHS (250 mM, 29 mg / ml dans de l'eau DI).
6. Mélanger 1 partie 10x EDC, une partie 10x NHS, 3 pièces d'eau DI, et 5 parties 2x tampon de conjugaison.
7. Utilisez une pompe à vide dans une hotte biologique pour éliminer la solution de trempage. Assurez-vous que tout le liquide est enlevé de la surface du gel.
8. Ajouter suffisamment de solution NHS / EDC pour couvrir la surface du gel et de remplir le puits de la boîte de Petri (150-250 pi) à fond de verre. Incuber à température ambiante pendant 30 min dans l'obscurité.
9. Fibronectine décongeler à température ambiante. Une fois décongelé, mélanger l'eau déminéralisée stérile pour créer un / ml solution de fibronectine 50 pg.
10. Utilisez une pompe à vide dans une hotte biologique pour éliminer les solu NHS / EDCtion. Assurez-vous que tout le liquide est enlevé de la surface du gel.
11. Ajouter 150 ul de solution de fibronectine à chaque gel. Incuber à température ambiante pendant 35 min pour permettre la fixation de fibronectine.
12. Après 35 min, ajouter PBS dans chaque boîte de Pétri et conserver à 4 ° C pendant 2 semaines.

4 Expérimentations la force de traction

1. Médias chaud de la cellule, du PBS, et de la trypsine à 37 ° C dans un bain d'eau.
2. Rincer gels 5x avec du PBS stérile, aspirer le PBS entre les rinçages, et laissez le à couvert dans la hotte.
3. Ajouter 1 ml de trypsine par cm ² à 25 cellules du flacon contenant. Après que les cellules sont soulevés de ballon, diluer la trypsine avec les médias de cellules et de compter les cellules. Sur la base de la surface de gel, de déterminer le nombre de cellules nécessaires pour gel pour une densité finale de l'ensemencement des cellules de 3.000 cellules / cm ^2. Diluer ou concentrer la suspension de telle sorte que 150 ul du mélange cellules-support contient ce nombre de cellules. Aliquotes de 150 pi de suspens cellulairesd'ions sur chaque gel.
4. Placez les boîtes de Pétri contenant des cellules dans un incubateur pendant 30 min. Ensuite, retirer soigneusement les boîtes de Pétri et remplir le reste de la boîte de Pétri avec les médias (environ 2 ml) de telle sorte que la surface de la boîte est complètement submergé.
5. Placez les boîtes de Pétri dans l'incubateur jusqu'à ce que l'acquisition de l'image.
6. Préparez le système d'acquisition microscope et données pour l'imagerie: insérer l'objectif à immersion 40x de l'eau, insérer le contraste d'interférence différentiel (DIC) prisme, sélectionnez le mCherry ou filtre fluorescent équivalent, et tourner sur la chambre de l'environnement.
7. Lorsqu'il est préparé pour l'imagerie, enlevez une boîte de Pétri de l'incubateur et le placer délicatement sur la platine du microscope. Retirez le couvercle plat de Pétri pour l'imagerie DIC.
8. Recherchez une seule cellule et capturer une image fixe unique de la cellule en DIC.
9. Sans bouger la platine du microscope, changer le mode d'imagerie à fluorescence. Concentrez-vous sur les microsphères fluorescentes et record une image des microsphères.
10. Retirez délicatement les médias de la cellule à partir de la boîte de Pétri avec une pipette et ajouter 0,05% de trypsine-EDTA.
11. Image, les microsphères sous la cellule après avoir détaché les cellules.
12. Utilisation par images de particules (PIV) analyse ImageJ ¹² pour calculer le champ de déplacement en raison des forces cellulaires.

Résultats

L'imagerie confocale a été utilisé pour déterminer que les billes sont bien en dessous de la surface du gel et de quantifier leur localisation précise dans la profondeur de gel. Des billes fluorescentes de longueur d'onde différente de celle à l'intérieur du gel ont été autorisés à se déposer sur la surface, et la distance entre les nanoparticules fluorescentes incorporées et celles sur la surface a été calculée en utilisant un algorithme d'identification du centre de gravité. L'emp...

Discussion

En utilisant cette technique, il est essentiel que la solution de talon est correctement dilué et les perles sont choisies en fonction du diamètre désiré, la rigidité du substrat PA de gel, et l'échelle de la taille des phénomènes qui sont explorées dans l'expérience souhaitée.

Il faut être prudent lors de la dilution de la solution de billes avant fonctionnalisation top des lamelles de verre. L'espacement entre les billes sur la surface du gel peut être modifiée en...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES)	Sigma-Aldrich	281778
70% Glutaraldehyde	Polysciences, Inc.	111-30-8
1 M HEPES buffer solution	Sigma-Aldrich	83264
40% Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
2% Bisacrylamide	Sigma-Aldrich	M1533
0.1 µm Fluorescent microspheres (mCherry)	Invitrogen	F8801
Fibronectin, Human, 1 mg	BD Biosciences	354008
Ammonium persulfate	Bio-RAD	161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Bio-RAD	161-0801
Poly-D-lysine	Millipore	A-003-E
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)	Thermo Scientific	22980
N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)	Thermo Scientific	24500
0.05% Trypsin-EDTA (1X)	Life Technologies	25300-054
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
Acrylic acid	Sigma-Aldrich	147230
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M3671
Materials
35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass	In Vitro Scientific	D35-14-1-N
Glass cover slips, 12 mm diam.	Ted Pella, Inc.	26023