إصابة الأنسجة الدماغية في دائرة ثنية الجلد الظهري للماوس: A الجلد رفرف نموذج المعنية بالتحقيق في نقص التروية الحاد الثابتة

Summary

نافذة غرفة الفئران الظهرية ثنية الجلد قدمت يتصور منطقة نقص التروية الحاد المستمر لرفرف العضلي الجلدي. حيوي داخلي برنامج التحصين الموسع ومضان المجهري تصاريح للتقييم المباشر والمتكرر من الأوعية الدموية الدقيقة والقياس الكمي للديناميكا الدم. المورفولوجي ونتائج الدورة الدموية يمكن زيادة المترابطة مع التحليلات النسيجية والجزيئية.

Abstract

على الرغم من الخبرة العميقة والتقنيات الجراحية المتقدمة، والمضاعفات الناجمة عن نقص التروية بدءا من انهيار الجرح إلى نخر الأنسجة واسعة لا تزال تحدث، وخاصة في الجراحة الترميمية رفرف. وقد تم تطوير نماذج تجريبية متعددة رفرف لتحليل الأسباب والآليات الكامنة والتحقيق في استراتيجيات العلاج لمنع المضاعفات الدماغية. العامل المحدد لمعظم النماذج هو إمكانية تفتقر إلى تصور بشكل مباشر ومتكرر العمارة الاوعية الدموية الدقيقة وديناميكا الدم. كان الهدف من هذا البروتوكول إلى تقديم نموذج الفأر راسخة الانتماء هذه العناصر تفتقر المذكورة آنفا. أصعب آخرون طوروا نموذجا لرفرف العضلي الجلدي مع نمط نضح العشوائية التي يخضع نقص التروية الحاد والمستمر في النتائج ~ 50٪ نخر بعد 10 يوما إذا أبقى دون علاج. بمساعدة حيوي داخلي المجهري مضان برنامج التحصين الموسع، وهذا النموذج يسمح غرفة التصور المتكرر للمورفولوجيا وديناميكا الدم في مناطق مختلفة من الفائدة مع مرور الوقت. العمليات المرتبطة بها مثل موت الخلايا المبرمج، والتهاب، وتسرب الاوعية الدموية الدقيقة والأوعية الدموية يمكن التحقيق فيها وربطها المقايسات المناعية والجزيئية البروتين. حتى الآن، أثبتت جدوى واستنساخ النموذج في العديد من الدراسات التجريبية التي نشرت التحقيق أثر مسبقا، peri- وpostconditioning من الأنسجة تحدى ischemically.

Introduction

تغطية تتعرض المواد الوتر والعظام وزرع في جراحة تعتمد على استخدام اللوحات. ورفرف هو كتلة من الأنسجة التي يتم نقلها على عنيق الأوعية الدموية التي تضمن التدفق الشرياني والوريدي تدفق. على الرغم من خبرة واسعة وتوفر مجموعة متنوعة من اللوحات على أن يتم تحويلها، والمضاعفات الناجمة عن نقص التروية بدءا من انهيار الجرح إلى إجمالي خسارة الأنسجة لا تزال اجهتها. في حين أن العلاج المحافظ والتئام بالمقصد الثانوية يمكن أن يتوقع بعد نخر الأنسجة طفيفة، نخر رفرف كبير وعادة ما يتطلب مراجعة العمليات الجراحية، بما في ذلك التنضير، تكييف الجرح وإعادة الإعمار الثانوي. هذا يزيد الاعتلال، يطيل الإقامة في المستشفى، وبالتالي يؤدي إلى زيادة تكاليف الرعاية الصحية.

اللوحات مع نمط غير معروف من الأوعية الدموية أو المناطق perfused لعشوائيا في المنطقة البعيدة النائية من تدفق الشرايين معرضة بشكل خاص لأضرار الدماغية. عكا rdingly، وتقييم العديد من الدراسات التجريبية والسريرية تطوير نخر في كل من، اللوحات النمط المحوري (إمدادات الدم محددة) واللوحات نمط عشوائي (إمدادات الدم غير معروف) ^1-3. تستند النتائج الرئيسية عادة على تقييم العيانية للحجم المنطقة الميتة. من أجل تقييم أسباب وآليات نخر الأنسجة أكثر في التفاصيل، ركزت العديد من الدراسات على تحليل دوران الأوعية الدقيقة. وقد استخدمت أساليب مختلفة لقياس نضح الأنسجة، بما في ذلك تحليل للتوتر الأوكسجين الأنسجة باستخدام أقطاب البولاروجرافي ^4-5، فضلا عن قياس تدفق الدم باستخدام الليزر دوبلر flowmetry ^6-7، صبغة نشر ^8، والمجهرية ^9-10. هذه التقنيات، ومع ذلك، تسمح فقط لقياس المعلمات غير المباشرة للنضح الأنسجة ولا يمكن لأي التحليل الصرفي للعمليات microhemodynamic داخل منطقة الفردية للمصلحة رفرف.

ر "> Sandison هو معروف أن تكون أول شخص يستخدم غرفة شفافة لفترات طويلة في الدراسات المجراة، الذي كان يقوم به في الأرانب ¹¹ في عام 1943 - وبعد ما يقرب من 20 عاما - كان Algire أول من التكيف مع مثل غرفة شفافة قابلة للتطبيق في الفئران بهدف دراسة سلوك يزرع الصغيرة من الخلايا السرطانية ^(12). ونظرا لحقيقة أن الفئران هي ما يسمى الحيوانات الجلد فضفاضة وبعد بعض التحسينات الفنية على مدى السنوات التالية، كانت لير وزملاء العمل قادرا على التكيف مع مثل على ظهري ثنية الجلد غرفة تطوير غرفة أصغر وأخف وزنا التيتانيوم. مكنت هذه الغرفة تقييم باستخدام المجهر مضان حيوي داخلي، وهي تقنية تسمح التصور المباشر والمتكرر لعدد من السمات المورفولوجية والأوعية الدقيقة والتغيرات على مر الزمن تحت مختلف الظروف الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض، مثل كما ضخه إصابة نقص ^{التروية-13.}

في التحقيق في بيrfusion من الجلد والعضلات والعظام اللوحات تحت الظروف العادية والمرضية وقعت اتجاهين: أولا، "الحادة" نماذج رفرف التي لا تستخدم غرفة الظهرية ثنية الجلد مثل صيوان الأذن pedicled في الماوس ^14، ومقرها أفقيا رفرف الجلد جزيرة في الهامستر ¹⁵ ورفرف مركب pedicled في الفئران ^(16). ثانيا، "المزمن" نموذج رفرف فيها مزيج من رفرف مع تصاريح غرفة الظهرية ثنية الجلد الأوعية الدقيقة المتكررة يحلل مدى عدة أيام مع حيوي داخلي المجهري مضان. وهو يتألف من رفرف العضلي الجلدي perfused لعشوائيا التي تتكامل في غرفة ثنية الجلد من الفأرة ^17. اختير لها نسبة العرض إلى الطول الذي وضع من نقص التروية الحاد المستمر يؤدي باستمرار في ~ 50٪ نخر الأنسجة رفرف بعد 10 إلى 14 يوما رفرف الارتفاع. هذا الحد استنساخه من نخر الأنسجة يسمح مزيد من التقييم على حد سواء، واقية (أي تطوير ليهS نخر) والعوامل الضارة (أي تطوير المزيد من نخر) على الفيزيولوجيا المرضية رفرف. خلال السنوات الأخيرة، عدة منشورات التجريبية مما يدل على أثر مسبقا مختلفة، peri- والإجراءات اللاحقة للتكييف، بما في ذلك إدارة المواد الأنسجة الواقية ^18-24 وتطبيق محلي من الإجهاد الفسيولوجية مثل الحرارة ²⁵ و ²⁶ صدمة، ظهرت.

التحليلات الكمية للنخر، الاوعية الدموية الدقيقة التشكل والمعلمات الدقيق microcirculatory يمكن زيادة ربطها التحاليل المناعية وفحوصات البروتين. البروتينات والجزيئات المختلفة بما في ذلك عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF)، synthases أكسيد النيتريك (NOS)، العامل النووي كابا B (NF كيلوبايت) وبروتينات الصدمة الحرارية (HSP-32: الهيم أوكسيجيناز-1 (HO-1) وHSP- 70) وقد ثبت أن تلعب دورا في حماية الأنسجة. على أساس هذا النموذج الغرفة رفرف تم وضع تعديلين في أورديr لتحليل اتساع الأوعية الدموية ودوران الأوعية الدقيقة الجلد الكسب غير المشروع خلال ²⁷ الشفاء وعائية التطورات في رفرف pedicled مع نمط محوري الارواء ^28. نقدم نموذجا استنساخه وموثوق بها يتضمن رفرف العضلي الجلدي تحدى ischemically في غرفة الماوس ثنية الجلد. هذا النموذج يسمح التصور النوعي والكمي لدوران الأوعية الدقيقة وديناميكا الدم بواسطة برنامج التحصين الموسع حيوي داخلي المجهري مضان.

Protocol

ملاحظة: قبل تنفيذ النموذج المقدم، وقوانين حماية الحيوان المقابلة يجب أن يستشار، ويجب الحصول على إذن من السلطات المحلية. في هذا العمل، وأجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية للبحوث التي تنطوي على الحيوانات والتشريع الألماني على حماية الحيوانات. تمت الموافقة التجارب من قبل لجنة رعاية الحيوان المحلية.

1. إعداد الحيوانية والارتفاع الجراحي للرفرف

1. تبقى الحيوانات في أقفاص واحدة في درجة حرارة الغرفة من 22-24 درجة مئوية، وعلى الرطوبة النسبية من 60-65٪ مع حلقة اليوم والليل لمدة 12 ساعة. السماح الفئران حرية الوصول إلى مياه الشرب وطعام المختبر القياسية. دائما الحفاظ على ظروف معقمة أثناء الجراحة البقاء على قيد الحياة.
2. تخدير الماوس عن طريق داخل الصفاق (IP) حقن 0.1 مل من محلول ملحي في 10 غرام من وزن الجسم تحتوي على 90 ملغ / كغ من وزن الجسم الكيتامين هيدروكلوريد و 25 ملغ /كغم من وزن الجسم هيدروكلوريد dihydroxylidinothiazine. التخدير هو ضروري لإعداد الحيوان والجراحة والفحص المجهري لاحق. تأكيد التخدير السليم عن طريق فحص ردا على بالألم. خلال فترة التخدير، وتطبيق مرهم البيطرية على العينين لمنع جفاف.
3. بعد التخدير الكافي، يزيل الشعر من الخلف مع ماكينة حلاقة كهربائية. الآخرة، وتطبيق كريم إزالة الشعر من منطقة حلق لإزالة الشعر المتبقي.
4. خلال فترة إقامته من كريم إزالة الشعر من ~ 7-10 دقائق، وإعداد الأدوات، بما في ذلك الجلد وملقط ملقط الصغيرة، مقص والمقص الصغير، مواد خياطة الجروح والقلم علامة. تطهير وإعداد غرفة التيتانيوم من خلال تطبيق المسمارين مع الجوز في قاعدة الغرفة وتحديد ذاتية اللصق رغوة (الشكل 1 AC) حول نافذة من نظيره الغرفة لضمان ضيق من نظام الغرفة.
5. إزالة جميع كريم إزالة الشعر من الخلف من قبل الغسلتشغيله مع الماء الفاتر. ثم الجافة وتطهير الجلد مع محلول التي تحتوي على الكحول.
6. ضع الماوس في موقف المعرضة وتحديد خط الوسط من الخلف. فهم الجلد مركزيا ورفعه إلى إنشاء حظيرة (الشكل 2A). بواسطة العابرة للإضاءة باستخدام أي نوع من مصدر الضوء، وتقرر أين تضع provisorily إطار التيتانيوم (الشكل 2B). تأكد من أن الفروع البعيدة للشريان الصدري الجانبي (LTA) cranially والشريان المنعطف الحرقفي العميق (DCIA) نحو caudally بالطبع من خلال مركز نافذة الغرفة (الشكل 2B-D). وبمجرد الانتهاء من تحديد المواقع للغرفة، خرم كل من طبقات من الجلد في أسفل جدا من حظيرة للتثبيت في وقت لاحق من الإطار التيتانيوم. الآن إزالة التيتانيوم الإطار، ضع الماوس في موقف المعرضة وإعادة تعريف خط الوسط من الظهر إذا لزم الأمر.
7. الخطوط العريضة رفرف عمودي على العمود الفقري بدءا من خط الوسط مع نسبة عرض إلى طول 15 × 11 ملم الى يؤدي إلى رفرف أساس أفقيا وperfused لعشوائيا. ثم تحدد مساحة إضافية من 2 ملم تمتد إلى الجانب المقابل الجلد (الشكل 2C، D). يتم اختيار هذا المجال مع ملقط وخياطة في وقت لاحق إلى الإطار التيتانيوم دون التدخل في المنطقة رفرف مرئية.
8. بعد وضع العلامات النهائية، شق رفرف. في القيام بذلك، القطع كل من الجمعية اللبنانية لتعزيز وDCIA ورفع رفرف (الشكل 2E). ليست هناك حاجة للتخثر أو ربط الأوعية مقطوع.
9. وضع المسمار الغرفة من خلال ثقوب الجلد بها سابقا (الشكل 2F) ويحملق في ثنية الجلد على حد سواء الأمامية والخلف داخل إطار الغرفة من رفرف مرتفع إلى الجزء الخلفي من الإطار باستخدام الثقوب الإطار الغرفة و5-0 خيوط متقطعة (الشكل 2G).
10. خياطة أطرافه العمودي للرفرف الخلفي على الجلد المحيطة عن طريق الغرز 5-0 توقف ( الشكل. 2H، I).
11. استئصال منطقة HEMI-دائري من الجلد الوحشي لقطاع صغير من الجلد 2 ملم، أي على الجانب الآخر من رفرف لمراقبة الأوعية الدموية في صيوان. وهذا يسمح عرض مباشر من خلال نافذة مراقبة الغرفة التي تحتوي على سطح 90 مم ^2.
12. إزالة الأنسجة الهالي فضفاضة تشبه الجيلاتين من العضلات المخططة باستخدام أدوات المجهرية والعدسة المكبرة أو المجهر الضوئي من أجل تحسين جودة الصورة من خلال المجهر. حاول أن لا تتلف الأوعية داخل طبقات الأنسجة العضلية.
13. أخيرا، ختم الغرفة من خلال تركيب نظيره من الإطار الذي سبق موهوب مع الذات التمسك شرائط من الرغوة الأمامية، cranially والخلف، أندى رفرف مع bisbenzimide موضعي والمالحة (الشكل 2J). بعد ذلك، وتطبيق النافذة الملاحظة مع غطاء زجاجي باستخدام حلقة مبكرة. ليس محاولة للإيقاع أي بثور الهواء تحت الزجاج (الشكل 2K، L). سوف الجلد التمسك الزجاج غطاء من قبل قوات التصاق.

2. حيوي داخلي المجهري epifluorescence

1. انتظر 24 ساعة بعد الجراحة لإعداد أول تحليل مجهري للجودة بصرية مثالية. ويمثل هذا التحليل الأساس من المجهري ويتكرر في اليوم 3 و 5 و 7 و 10 بعد الجراحة. في كل مرة، تخدير الماوس كما هو موضح في الخطوة 1.2. وضع الحيوان في موقف استلقائي الجانبي على حسب الطلب زجاجي الناقل. بهذه الطريقة، وطبقات الأنسجة العضلية للرفرف التمسك الزجاج غطاء تواجه ما يصل عنابر.
2. حقن 0.05 مل من 5٪ ديكستران الأخضر مضان (150،000 الوزن الجزيئي) و 0.05 مل 1٪ الفلورسنت عالية رودامين الصبغة العائلية في الوريد الذيل أو الضفيرة الوريدية الرجعية الصلبية. وديكستران الفلورية الخضراء بقع المكونات غير الخلوية من الدم عن طريق الوريد إذا ما طبقت (رابعا). الفلورسنت رودامين البقع الكريات البيضاء والصفائح الدموية التي يمكن أن تكون حيinguished من المكونات الخلوية وغير الخلوية الأخرى. أخيرا، bisbenzimide البقع المكونات النووية التي تنبعث منها أكثر أو أقل مضان وفقا لحالة من التكثيف.
3. بعد ذلك، ضع الماوس تحت المجهر. ضمان المجهر يشمل نظام LED - مجموعات شعاع LED ل470 & 425 نانومتر و 365 نانومتر و490 و540 و580 نانومتر فضلا عن مجموعات مرشح المقابلة (62 BFP سعادة / GFP / HcRed، مجموعة 1: 350-390 نانومتر الإثارة الطول الموجي، تقسيم 395 نانومتر / 402-448 نانومتر، مجموعة 2: 460-488 نانومتر، 495 نانومتر تقسيم / 500-557 نانومتر، مجموعة 3: 567-602 نانومتر، 610 نانومتر تقسيم / 615 نانومتر لانهائية 20 رودامين، النطاق. : 540-552 نانومتر، 560 نانومتر تقسيم، والانبعاثات 575-640 نانومتر).
4. تسجيل اللقطات والصور المتحركة، باستخدام جهاز كاميرا الفيديو إلى جانب تهمة وحفظها على القرص الصلب لجهاز الكمبيوتر لمزيد من خارج خط التحليل.
5. استخدام أهداف مختلفة (2.5X، NA (الفتحة العددية) = 0.06 لمشاهدة بانوراما للغرفة، 5X،NA = 0.16. 10X، NA = 0.32. 20X، NA = 0.50. 50X، NA = 0.55) لتسجيلات من المناطق المثيرة للاهتمام.
6. عمليا، تقسم السطح رفرف أن يكون مرئيا من خلال نافذة الغرفة إلى ثلاث مناطق من ارتفاع متساو، أي الأقرب، مركزية، ومنطقة القاصي أبعد من تدفق الأوعية الدموية (الشكل 3F). لاقتناء الصورة، والمضي قدما على النحو التالي في كل نقطة زمنية الملاحظة:
   1. مسح الصورة الأنسجة حسب الصورة داخل نافذة الغرفة من الداني إلى القاصي باستخدام الهدف 5X.
   2. في كل مجال من مجالات رفرف، اختر الشرايين ثاني أو ثالث ترتيب والأوردة المصاحبة لها مع أنماط المتفرعة التي يسهل التعرف عليها. باستخدام الهدف 5X، 10X، أو 20X، وجعل النسخ المطبوعة من حزم شريني وريدي من أجل إعادة توطين بسهولة، وحزم طوال فترة الملاحظة كلها.
   3. مع الهدف 20X 50X والهدف، المزيد من 5-6 سجل المجالات الشعرية و"أفكارك"حقول في منطقة رفرف على التوالي. جميع الصور المسجلة مع 10X 20X وأهداف استخدام الضوء الأزرق (ديكستران الفلورسنت) والضوء الأخضر (رودامين) مرشح، في حين أن الصور المسجلة مع 5X 50X واستخدام موضوعي الضوء الأزرق (ديكستران الفلورسنت) والضوء الأبيض (Bisbenzimide) مرشح على التوالي .

3. تحليل البيانات المسجلة

ملاحظة: مع استخدام صورة نظام التحليل بمساعدة الحاسوب الكمي جميع المعلمات سجلت خارج الخط على النحو التالي ^29.

1. قياس مجال غير perfused ل، الأنسجة الميتة على التوالي ⁽² ملم).
   1. استخدام غرفة كاملة الصورة الممسوحة ضوئيا نافذة سجلت بهدف 5X (من 2.6.1) وديكستران الفلورسنت لقياس الأنسجة غير perfused لنخرية على التوالي. استخدام "AreaBo" وظيفة لقياس المجال غير perfused لالداكنة: الحدود في منطقة غير perfused لوحساب مساحة في مم ² باستخدام خوارزميات قياس المساحة في البرنامج.
2. قياس قطرها الاوعية الدموية الدقيقة في الشرايين، الأوردة والشعيرات الدموية (ميكرون).
   1. تحميل الفيديو أو الصور من تسجيلها AV-حزم أو مجالات الشعرية في البرنامج. للحصول على أفضل النتائج استخدام اللقطات أو الفيديو وفقا لأعلى التكبير فيها الحدود واضحة للسفينة هي واضحة للعيان.
   2. استخدام "DiamPe" وظيفة من البرنامج للتأكد من إجراء القياسات عمودي على جدار السفينة. للقيام بذلك بمناسبة نقطتين على جدار السفينة وبنقرة العلامة الثالثة القطر العمودي للسفينة. يقوم البرنامج بإجراء قياس في ميكرون.
   3. تكرار القياسات على نفس السفن لجميع التسجيلات في نفس المكان. قياس الشعيرات متعددة تتراكم متوسط ​​القطر.
3. تحليل خلايا الدم الحمراء (RBC) سرعة في الشرايين، والشعيرات الدمويةالثانية الأوردة (ملم / ثانية).
   1. لتصلب خلايا الدم الحمراء (RBC) السرعة (مم / ث) القياسات استخدام "VeloLSD" وظيفة من البرنامج واختيار نفس السفن في نافذة ديكستران الفلورسنت التي تم قياسها في قطر.
   2. نحللها مع نظام تحليل الصور بمساعدة الحاسوب باستخدام طريقة القسط التحول، الذي هو على أساس قياس التحول (مم) من نمط مستوى رمادي داخل الأوعية الأفراد على مر الزمن (ثانية).
4. قياس تدفق الدم في الأوعية الحجمي (PL / ثانية).
   1. حساب تدفق الدم الحجمي (PL / ثانية) في الشرايين، الأوردة والشعيرات الدموية من سرعة السفينة ومنطقة عبر قطاعات RBC (π * ص ²⁾ وفقا لمعادلة غروس وAroesty، وهذا هو، Q = V * π * ص ² ، على افتراض وعاء اسطواني الشكل ^30.
5. قياس الكثافة الشعرية وظيفية من الشعيرات الدموية RBC perfused ل(نضح المغذي: سم / سم 2).
   1. تحميل الحقل الشعري الفلورسنت سجلت مع التكبير 20X موضوعي في البرنامج. استخدام وظيفة "DensLA" لقياس الكثافة الشعرية وظيفية من microvessels RBC perfused ل.
   2. تتبع الشعيرات الدموية مع perfused المؤشر وبمناسبة السفن perfused ل. لا يعلم غير perfused ل-الشعيرات الدموية، الشرايين أو الأوردة. يقوم البرنامج بقياس الكثافة الشعرية وظيفية من الشعيرات الدموية في perfused لسم / سم ^2. كرر الخطوات للحقول الشعرية المسجلة الأخرى.
6. قياس تعرج من microvessels (إعادة عرض الاوعية الدموية الدقيقة)، مؤشرات مبكرة على الأوعية الدموية مثل برعم وبرعم، وتشكيل microvessels التي شكلت حديثا.
   1. سجلت تحميل أشرطة الفيديو أو إطارات من المجالات الشعرية الفلورسنت في البرنامج. تحديد السفن ذو حلقات واستخدام "TorqIx" وظيفة من البرنامج. تتبع تدفق السفن واضح مع المسار وينتهي فوق الحق. سوف يقوم البرنامجرسم خط مستقيم على الطريق مباشرة وسيتم تعيينها في العلاقة مع مسار تتبعها.
      ملاحظة: احترس من علامات الأوعية الدموية مثل براعم، براعم والشعيرات الدموية التي شكلت حديثا، والتي عادة ما تنطلق عموديا من الشعيرات الدموية الموجودة مسبقا. قياس كثافة هذه السفن التي شكلت حديثا كما هو موضح في الخطوة 3.5.
7. تحديد خصائص لموت الخلايا أفكارك، مثل التكثيف النووي، تجزئة و / أو تهامش (خلية / ملم ^2).
   1. تحميل أشرطة الفيديو المسجلة Bisbenzimide (الهدف 50X) في البرنامج. استخدام وظيفة "DenseNA". بمناسبة خلايا أفكارك وفقا للخصائص المذكورة مثل التكثيف النووي، التفتت وتهامش بنقرة الأيسر.
   2. بعد وضع العلامات المميزة جميع الخلايا في جميع أنحاء الفيديو، انقر فوق "N / A" في البرنامج، والتي سوف نعتمد تلقائيا كل خلايا تميز وتفرق في جميع أنحاء المنطقة. ستكون النتيجة أفكاركخلية / ملم ^2.
8. تحليل الكريات البيض التمسك البطانة الوعائية تمثل الالتهاب. الالتزام المتقطع من الكريات البيضاء (الكريات البيض المتداول، تمسك <30 ثانية: عدد بكرات / مم ² سطح البطانية) والالتزام الراسخ من كريات الدم البيضاء (الكريات البيض الشائكة، التزام> 30 ثانية: عدد ملصقات / مم ² سطح البطانية).
   1. تحليل الاستجابة الالتهابية من خلال إحصاء عدد رودامين الكريات البيضاء التي انضمت إلى بطانة البطانية من الوريدات بعد الشعرية لفترة زمنية من ≥30 ثانية ("ملصقات") والكريات البيض الالتزام بشكل متقطع المسمى (<30 ثانية، "بكرات") . وأعرب Venular الكريات البيض كما تمسك خلايا لكل ملم ² سطح البطانية.
9. قياس مستويات الرمادي داخل الأوعية الدموية والخلالي كمعلمة لتسرب الاوعية الدموية الدقيقة (الجزيئات تسرب E = E1 / E2).
   1. تقييم الجزيئات لeakage كمعلمة من نفاذية الاوعية الدموية الدقيقة بعد حقن الرابع من ديكستران الفلورسنت. Densitometrically تحديد مستويات الرمادي متعددة في الأنسجة المجاورة مباشرة لجدار الوعاء الدموي الشعري (E1)، وكذلك في هامشي بلازما خالية من الخلايا السفينة (E2). ثم حساب تسرب الجزيئات (E)، ونسبة E1 / E2 ^31.

4. بعد العملية الجراحية العناية

1. العودة للحيوان في قفص منفصل لتجنب الشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما. لا تترك حيوان غير المراقب حتى استعاد وعيه أنه كاف للحفاظ على الاستلقاء القصية. مراقبة الحيوانات يوميا لنزيف والمحلية وعلامات الإصابة النظامية وموقف الغرفة.
2. تقييم الحالة العامة للحيوان من خلال مراقبة النشاط الحركي، ووزن الجسم، وعلامات الألم والتسامح لخلع الملابس والسيارات والتشويه.
3. إبقاء الفئران في قفص واحد لتجنب موتوآل التلاعب في الغرفة. في أي علامة على الألم، وتطبيق البوبرينورفين بجرعة 0،05 حتي 0،1 ملغ / كغ من وزن الجسم، تحت الجلد في فترات 8 ساعة.

5. القتل الرحيم وExplantation غرفة ثنية الجلد

1. في يوم 10، تضحية الحيوانات باستخدام جرعة زائدة من دواء مخدر (150 ملغ / كغ بنتوباربيتال).
2. إزالة الغرفة وأخذ عينات من الأنسجة رفرف لفحوصات البروتين المناعية والجزيئية. الأنسجة لعينة الأنسجة التقليدية (الفورمالين) وفحوصات قياس الكمي البروتين (النتروجين السائل أو الثلج الجاف).

النتائج

نخر

نقطة النهاية الرئيسية لهذا النموذج - نخر الأنسجة بعد ارتفاع رفرف (أي تحريض نقص التروية الحاد المستمر) - يقاس مرارا ويتضح ظاهريا كما هو مبين في الشكل (3) على مدى 10 يوما. الترسيم النهائي للرفرف نخر يحدث عادة ...

Discussion

من أجل تقليل المضاعفات الدماغية، وبالتالي تحسين النتائج السريرية، مطلوب معرفة أكثر تفصيلا من العمليات الفسيولوجية المرضية في الأنسجة perfused لرفرف خطيرة. تطوير النماذج الحيوانية الجديدة التي تحاكي نقص التروية الحاد المستمر هي بالتالي إلزامية. وفقا لذلك، تمكنا من تطو...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
C57Bl/6 mice 6-8w 20-22g	Charles River
depilation cream	Veet		any depilation cream
titanium chamber	Irola	160001	Halteblech M
slotted cheese head screw	Screws and More	842210	DIN84 M2x10
hexagon full nut	Screws and More	93422	DIN934 M2
snap ring	Schaefer-Peters	472212	DIN472 J12x1,0
cover glass	Volab		custom-made cover glass 11,8mm in diameter
fixing foam	tesamoll	05559-100	tesamoll Standard I-Profile
ketamine hydrochloride	Parke Davis		Ketavet®
dihydroxylidinothiazine hydrochloride	Bayer		Rompun®
Buprenorphin	Essex Pharma		Temgesic®
Saline 0,9%
desinfection alcohol
Vicryl 5-0	Ethicon	V 490 H
Ethilon 5-0	Ethicon	EH 7823 H
1ml syringes
surgical skin marker with flexible ruler	Purple surgical	PS3151	any surgical skin marker and flexible ruler
pointed scissors
Micro-Scissors
normal scissors
2 clamps
fine anatomic forceps
micro-forceps
hex nuter driver	wiha	1018
screwdriver	wiha	685
snap ring plier	Knipex	4411J1	12-25mm
wire cutter	Knipex	70 02 160	Wire cutter is used to cut screws short; 160mm
trans-illumination light	IKEA	501.632.02	LED light Jansjö; any light
magnification glasses
intravital microscope	Zeiss	490035-0001-000	Scope.A1.Axiotech
LED system	Zeiss	423052-9501-000	Colibri.2
LED module 365nm	Zeiss	423052-9011-000
LED module 470nm	Zeiss	423052-9052-000
LED module 540-580nm	Zeiss	423052-9121-000
Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed	Zeiss	489062-9901-000	range 1: 350-390nm excitation wavelength split 395 / 402-448nm; range 2: 460-488nm, split 495nm / 500-557nm; range 3: 567-602nm, split 610nm / 615-infinite
Filter set 20 Rhodamine	Zeiss	485020-0000-000	540-552nm, split 560, emission 575-640nm
2,5x objective NA=0,06	Zeiss	421020-9900-000	A-Plan 2,5x/0.06
5x objective NA=0,16	Zeiss	420330-9901-000	EC Plan-Neofluar 5x/0.16 M27
10x objetive NA=0,30	Zeiss	420340-9901-000	EC Plan-Neofluar 10x/0.30 M27
20x objective NA=0.50	Zeiss	420350-9900-000	EC Plan-Neofluar 20x/0.50 M27
50x objective NA=0,55	Zeiss	422472-9960-000	LD Epiplan-Neofluar 50x/0.55 DIC 27
ZEN imaging software	Zeiss		ZenPro 2012
CapImage	Dr. Zeintl
Fluorescein isothiocyanate-dextran	Sigma-Aldrich	45946
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride	Sigma-Aldrich	B2261	harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause repiratory irritat
Rhodamine 6G chloride	Invitrogen	R634	harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child
Pentobarbital	Merial		Narcoren®