פגיעה ברקמות איסכמי בהגבו skinfold לשכת העכבר: דגם דש עור לחקור איסכמיה מתמיד חריפה

Summary

החלון של חדר skinfold הגב העכברי הציג מדמיין אזור של איסכמיה המתמשכת האקוטית של כנף musculocutaneous. היתרי Intravital עלית מיקרוסקופ פלואורסצנטי להערכה ישירה וחוזרת ונשנית של נימי הדם והכימות של פרמטרים המודינמיים. נוסף יכולים להיות מתואמות מורפולוגיים ותוצאות המודינמית עם ניתוחים היסטולוגית ומולקולריים.

Abstract

למרות מומחיות עמוקה וטכניקות ניתוחיות מתקדמות, סיבוכים הנגרם איסכמיה הנעים בין התמוטטות פצע נמק רקמות נרחבת עדיין מתרחשים, במיוחד בניתוחי דש שחזור. מודלים דש ניסיוניים מרובים פותחו כדי לנתח את סיבות ומנגנונים העומדים בבסיס ולחקור אסטרטגיות טיפול למניעת סיבוכי איסכמי. הגורם המגביל של רוב הדגמים הוא האפשרות חסרת ישירות ושוב ושוב לדמיין ארכיטקטורת כלי דם ופרמטרים המודינמיים. המטרה של הפרוטוקול הייתה להציג מודל עכבר מבוסס היטב השתייכות לפני שהוזכרו אלמנטים אלה לוקים בחסרים. קשה יותר et al. פיתח מודל של כנף musculocutaneous עם דפוס זלוף אקראי שעובר איסכמיה החריפה מתמשכת ותוצאות ב~ נמק 50% לאחר 10 ימים אם המשיך שלא טופל. בעזרת מיקרוסקופיה עלית הקרינה intravital, מודל תא זה מאפשר הדמיה חוזרת ונשנית שלמורפולוגיה פרמטרים המודינמיים באזורים שונים של ריבית על פני זמן. ניתן לחקור תהליכים נלווים כגון אפופטוזיס, דלקת, דליפת כלי דם ואנגיוגנזה ומתואמים מבחני חלבון immunohistochemical והמולקולריים. עד כה, המודל הוכיח היתכנות ושחזור במספר מחקרים ניסיוניים פרסמו חוקרים את ההשפעה של טרום, peri- וpostconditioning של רקמת תיגר ischemically.

Introduction

כיסוי של חומר גיד, עצם ושתל נחשף בניתוח השחזור מסתמך על השימוש בדשים. דש הוא גוש של רקמה המועברת על הגבעול של כלי הדם שלו, המבטיח זרימה בעורקים וורידי יצוא. למרות מומחיות רחבה והזמינות של מגוון רחב של דשים שיועברו, סיבוכים הנגרם איסכמיה הנעים בין התמוטטות פצע לסך אובדן רקמה עדיין נתקלו. בעוד ניתן לצפות טיפול שמרני וריפוי על ידי כוונה משנית לאחר נמק רקמת קטין, נמק דש משמעותי בדרך כלל דורש תיקון ניתוחי, כולל הטרייה, אוויר פצע ושחזור המשני. זה מגביר תחלואה, מאריך את השהות בבית חולים וכתוצאה מכך מביא לעלויות טיפול רפואי מוגברות.

דשים עם דפוס מוגדר של כלי דם או באזורי perfused באופן אקראי באזור דיסטלי המרוחק ביותר מזרם העורקים הם רגישים במיוחד לניזק איסכמי. עכו rdingly, מחקרים ניסיוניים וקליניים רבים העריכו את ההתפתחות של נמק בשני, דשי דפוס צירי (אספקת דם מוגדרת) ודשי תבנית אקראית (אספקת דם לא מוגדרת) ^1-3. הממצאים העיקריים מבוססים בדרך כלל על הערכה מקרוסקופית של גודל שטח נימקי. על מנת להעריך את הסיבות ומנגנונים של נמק רקמה יותר בפירוט, מספר מחקרים התמקדו בניתוח של זרימת דם. טכניקות שונות שימשו למדידת זלוף רקמות, כוללים הניתוח של מתח חמצן ברקמה באמצעות אלקטרודות polarographic ^4-5, כמו גם המדידה של זרימת דם באמצעות Flowmetry דופלר לייזר ^6-7, דיפוזיה צבע ^8, וmicrospheres ^9-10. טכניקות אלו, לעומת זאת, מאפשרות אך ורק למדידת פרמטרים עקיפים של זלוף רקמה ואינה מאפשרות ניתוח מורפולוגי של תהליכי microhemodynamic בתוך אזור בודד של עניין של כנף.

t "> סנדיסון ידוע להיות הראשון שהשתמש בתא שקוף לממושכות במחקרי vivo, שבם ביצעו בארנבות ¹¹ בשינה 1943 -. כ -20 שנים מאוחר יותר - Algire היה הראשון להסתגל תא כזה שקוף להיות ישים בעכברים כדי ללמוד את ההתנהגות של מיקרו-שתלים של תאים סרטניים ^12. בשל העובדה שעכברים הם מה שנקרא בעלי החיים עור רפויים ואחרי כמה חידודים טכניים לאורך השנים הבאות, להר ועמיתים לעבודה היו מסוגל להסתגל כזה תא skinfold גב פיתוח קאמרי טיטניום קטן וקלה. תא זה אפשר הערכה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי intravital, טכניקה המאפשרת הדמיה ישירה וחוזרת ונשנית של מספר המאפיינים המורפולוגיים וmicrocirculatory והשינויים שלהם לאורך זמן בתנאים פיסיולוגיים וpathophysiological שונים, כגון כפגיעת איסכמיה reperfusion ^13.

בחקירת PErfusion של דשי עור, שרירים ועצמות בתנאים רגילים ופתולוגיים שתי מגמות התרחשו: ראשית, דגמי "חריפים" הדש שאינו משתמשים בתא skinfold הגב כגון תנוך אוזן pedicled בעכבר ^14, דש עור האי מבוסס הרוחבית באוגר ¹⁵ והדש המורכב pedicled בחולדה ^16. שנית, המודל "הכרוני" הדש שבו השילוב של כנף עם microcirculatory חוזר על עצמו היתרים קאמריים skinfold גב מנתח על פני כמה ימים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי intravital. הוא מורכב מדש musculocutaneous perfused באופן אקראי המשתלב בתא skinfold של העכבר ^17. יחס רוחב-אורכה נבחר שמצב של איסכמיה המתמשכת החריפה תוצאות באופן עקבי ב~ 50% נמק רקמת דש 10-14 ימים לאחר העלאת דש. במידה לשחזור זה של נמק רקמות מאפשרת הערכה נוספת של שניהם, מגן (כלומר, פיתוח של lesשל נמק) וגורמים מזיקים (כלומר, התפתחות של נמק יותר) על הפתופיזיולוגיה דש. בשנים האחרונות, מספר פרסומים ניסיוניים הממחישים את ההשפעה של טרום שונים, peri- ונהלי פוסט-אוויר, כוללים מתן חומרי רקמת מגן ^18-24 והיישום המקומי של גורמי לחץ פיסיולוגיים כגון חום ²⁵ וזעזועים ^26, צמחו.

הניתוחים כמותיים של נמק, מורפולוגיה כלי דם ופרמטרי microcirculatory יכולים להמשיך להיות מתואמים לניתוחי immunohistochemical ומבחני חלבון. חלבונים שונים ומולקולות כולל פקטור הגדילה של אנדותל כלי דם (VEGF), synthases תחמוצת חנקן (NOS), kappa B גורם גרעיני (NF-κB) וחלבוני הלם חום (HSP-32: heme-oxygenase 1 (HO-1) וHSP- 70) הוכח לשחק תפקיד בהגנת רקמות. בהתבסס על מודל קאמרי דש זה, שני שינויים פותחו ביורדוr כדי לנתח ניאו-וסקולריזציה וזרימת דם בריפוי עור שתל ²⁷ והתפתחויות angiogenic בדש pedicled עם זלוף הדפוס צירי ^28. אנו מציגים מודל לשחזור ואמין הכולל דש musculocutaneous תיגר ischemically בתא skinfold העכבר. מודל זה מאפשר הדמיה וכימות של זרימת הדם ופרמטרים המודינמיים על ידי מיקרוסקופ עלית הקרינה intravital.

Protocol

הערה: לפני היישום של המודל שהוצג, חוקי הגנה על בעלי חיים המקביל יש להתייעץ ויש לקבל אישור מהרשויות המקומיות. בעבודה זו, כל הניסויים בוצעו בהתאם לעקרונות המנחים לבעלי חיים מחקר מעורב והחקיקה הגרמנית להגנה על בעלי החיים. הניסויים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי החיים המקומית.

1. הכנת בעלי חיים והעלאת כירורגי של הדש

1. לשמור על חיות בכלובים בודדים בטמפרטורת חדר של 22-24 מעלות צלזיוס ובלחות יחסי של 60-65% עם מחזור היום והלילה 12 שעות. לאפשר גישה חופשית עכברים למי שתייה ואוכל מעבדה סטנדרטית. תמיד לשמור על תנאים סטריליים במהלך ניתוח הישרדות.
2. הזרקה להרדים את העכבר על ידי intraperitoneal (IP) של 0.1 מיליליטר תמיסת מלח לBW 10 גרמו מכיל 90 מ"ג / קילוגרם BW קטמין הידרוכלוריד ו -25 מ"ג /hydrochloride dihydroxylidinothiazine BW קילוגרם. ההרדמה היא הכרחית להכנת בעלי חיים, ניתוחים ומיקרוסקופיה שלאחר מכן. לאשר הרדמה נכונה על ידי בדיקת התגובה לגירוי כואב. בזמן ההרדמה, להחיל משחה וטרינר על עיניים למניעת יובש.
3. לאחר האינדוקציה של הרדמה מספיק, לְהַשִׁיר שֵׂעַר חזרה עם מכונת גילוח חשמלי. מכאן והלאה, חל הסרת שיער קרם לאזור המגולח כדי להסיר את השיער שנשאר.
4. במהלך זמן מגורים של קרם הסרת השיער של ~ 7-10 דקות, להכין כלים, כולל מלקחיים עור ומלקחי מיקרו, מספריים ומספריים מיקרו, חומרים לתפירה ועט סימון. לחטא ולהכין את חדר טיטניום על ידי יישום שני הברגים עם האגוזים בבסיס של התא ועל ידי תיקון קצף מודבק עצמם (איור. 1 AC) סביב החלון של העמית של התא כדי להבטיח אטימות של המערכת הקאמרית.
5. הסר את כל מסי שעוות הקרם מאחור על ידי שטיפהאותו עם מים פושרים. ואז יבשים ולחטא את העור עם פתרון המכיל אלכוהול.
6. מניחים את העכבר במצב שכיבה ומגדיר את קו האמצע של הגב. לתפוס את העור באופן מרכזי ולהרים אותו כדי ליצור קפל (איור. 2 א). על ידי טרנס-תאורה תוך שימוש בכל סוג של מקור אור, להחליט היכן למקם את מסגרת טיטניום (איור. 2 ב) provisorily. ודא שהסניפים המרוחקים של העורק לרוחב בית החזה (LTA) cranially והעורק העמוק גֵרֵשׁ הכסל (DCIA) caudally כמובן דרך מרכז החלון של החדר (איור. 2 ב-ד). ברגע שהמיקום של החדר נעשה, לנקב שני השכבות של העור בחלק התחתון מאוד של הקפל לקיבעון מאוחר יותר של מסגרת טיטניום. עכשיו להסיר את מסגרת טיטניום, מניח את העכבר במצב שכיבה ולהגדיר מחדש את קו האמצע של הגב במידת צורך.
7. מתאר את הדש בניצב לשדרה מתחילה על קו האמצע עם יחס רוחב-אורך של 15 x 11 מ"מ לגרום לדש רוחבי מבוסס וperfused באופן אקראי. ואז מתאר אזור עור נוסף של 2 מ"מ המשתרע על הצד בצד הנגדי (איור. 2C, ד). אזור זה הוא הרים עם המלקחיים ולאחר מכן נתפר למסגרת טיטניום מבלי להפריע לאזור הדש הגלוי.
8. בעקבות סופי לציון, לחתוך את הדש. בכך, ויחצה שני LTA וDCIA ולרומם את הדש (איור. 2E). אין צורך בקרישה או קשירה של כלי transected.
9. הנח הבורג של תא הבידוד דרך הנקבים בעור שנעשו בעבר (איור. 2F) ולקבע את skinfold שני anteriorly ובדיעבד בתוך המסגרת של התא של הדש הגבוה לחלק האחורי של המסגרת באמצעות החורים של המסגרת של התא ו5-0 תפרים שהופסקו (איור. 2G).
10. לתפור את הגפיים האנכיים של הדש חזרה לעור שמסביב באמצעות 5-0 תפרים הופסקו ( איור. 2H, I).
11. בלו אזור חמי עגולה של לרוחב עור לרצועת העור הקטן של 2 מ"מ, כלומר, בצד של הדש מצד להתבונן בכלי הדם של הדש. זה מאפשר צפייה ישירה דרך חלון התצפית של החדר שיש לו שטח של 90 מ"מ ^2.
12. להסיר את הרקמה כמו ג'לטין-הרופפת areolar מהשריר המשורטט תוך שימוש במכשירי מייקר ועדשת מגדלת אופטית או מיקרוסקופ על מנת לשפר את איכות התמונה במיקרוסקופ. נסה לא לפגוע בכלים בתוך שכבות רקמת שריר.
13. לבסוף, לאטום את החדר על ידי ההרכבה העמית של המסגרת שכבר בעבר endued עם רצועות דבקות עצמית של קצף anteriorly, cranially ובדיעבד, bedew הדש עם bisbenzimide האקטואלי ומלוח (איור. י 2). לאחר מכן, להחיל את חלון התצפית עם מכסה זכוכית באמצעות טבעת הצמד. נסה לא ללכוד את כל שלפוחיות אוויר מתחת לזכוכית (איור. 2K, L,). העור יהיה לדבוק בכיסוי זכוכית על ידי כוחות הידבקות.

2. Intravital epifluorescence מיקרוסקופית

1. חכה 24 שעות לאחר הכנה כירורגית לניתוח המיקרוסקופי הראשון לאיכות אופטית אידיאלית. ניתוח זה מייצג את נקודת ההתחלה של מיקרוסקופיה וחוזר על עצמו ביום 3, 5, 7 ו -10 לאחר ניתוח. בכל פעם, להרדים את העכבר כמתואר בשלב 1.2. מניחים את החיה בעמדת decubital רוחב על מנשא פרספקס בהזמנה אישית. בדרך זו, שכבות רקמת השריר של דש שמירה על מכסה הזכוכית הם פונים כלפי מעלה-מחלקות.
2. הזרק 0.05 מיליליטר של 5% dextran הירוק פלואורסצנטי (משקל מולקולרי 150,000) ו 0.05 מיליליטר 1% צבע משפחת Rhodamine ניאון מאוד בוריד זנב או צומת ורידי רטרו-מחלה. Dextran הניאון הירוק מכתים את הרכיבים בלתי תאיים של הדם, אם מיושם דרך הווריד (iv). ניאון Rhodamine לויקוציטים כתמים וטסיות דם שיכול להיות distinguished ממרכיבים תאיים ובלתי תאיים אחרים. לבסוף, bisbenzimide כתמי רכיבים גרעיניים שפולטים פחות או יותר הקרינה בהתאם למצב של עיבוי.
3. כתוצאה מכך, במקום את העכבר מתחת למיקרוסקופ. ודא מיקרוסקופ כולל מערכת LED - שילובי LED אלומת 470 & 425 ננומטר, 365 & 490 ננומטר, ו540 & 580 ננומטר, כמו גם מערכות סינון המקבילה (62 HE BFP / GFP / HcRed, מגוון 1: ננומטר 350-390 גל עירור, לפצל 395 ננומטר / 402-448 ננומטר, טווח 2: 460-488 ננומטר, לפצל 495 ננומטר / 500-557 ננומטר, טווח 3: 567-602 ננומטר, לפצל 610 ננומטר ננומטר / 615 לאינסוף 20 Rhodamine, מגוון. : 540-552 nm, לפצל 560 ננומטר, פליטה 575-640 nm).
4. רשום את סטילס ותנועה-תמונות באמצעות מצלמת וידאו מכשיר תשלום מצמיד ולשמור אותן במחשב בדיסק קשיח לניתוח נוסף off-line.
5. השתמש ביעדים שונים (2.5x, NA (צמצם מספרי,) = 0.06 לתצוגות פנורמה של החדר, 5X,NA = -0.16, 10X, NA = 0.32; 20X, NA = 0.50; 50X, NA = 0.55) להקלטות של האזורים של עניין.
6. כמעט, לחלק את שטח הדש, כי הוא גלוי דרך החלון של החדר לשלושה אזורים בגובה שווה, כלומר, הפרוקסימלי, מרכזי, ואזור דיסטלי המרוחק ביותר מהיבוא של כלי הדם (איור. 3F). לרכישת תמונה, להמשיך את הדרך בכל נקודת זמן התצפית הבאה:
   1. סרוק את תמונת הרקמה על ידי תמונה בתוך החלון של החדר מהפרוקסימלי לדיסטלי באמצעות מטרת 5X.
   2. בכל אזור של הדש, בחר arterioles שנייה או מסדר השלישי וvenules נלווה אליהם עם דפוסי הסתעפות לזיהוי בקלות. באמצעות מטרת 5X, 10X, או 20X, להפוך את התדפיסים של חבילות arteriolovenular כדי קלות מחדש למקם את החבילות לאורך כל תקופת התצפית.
   3. במטרה 20X והאובייקטיבי 50X, שדות נימים נוספים שיא 5-6 ו" אפופטוטיים"שדות לכל אזור של דש בהתאמה. כל התמונות שתועדו עם 10X ו20X מטרות להשתמש באור הכחול (dextran ניאון) ואור ירוק (Rhodamine) מסנן, בעוד שתמונות שתועדו עם 5X ו50X אור הכחול שימוש אובייקטיבי (dextran ניאון) ואור לבן מסנן (Bisbenzimide), בהתאמה .

3. ניתוח של נתונים שנרשמו

הערה: עם השימוש במערכת ניתוח תמונה בעזרת מחשב לכמת את כל פרמטרים נרשמו off-line כדלקמן ^29.

1. מדידה של האזור של אי-perfused, רקמת בהתאמה נימקי ⁽² מ"מ).
   1. השתמש בתמונה המלאה הקאמרית סרוק החלון נרשמה במטרה 5X (מ2.6.1) וdextran הניאון למדידת רקמות בהתאמה נימקי-perfused שאינם. השתמש בפונקציה "AreaBo" כדי למדוד את השטח הכהה perfused עישון: גבול האזור-perfused שאינה ולחשב השטח במטרמ ^'2 על ידי שימוש באלגוריתמי מדידת התוכנה של חטיבה.
2. מדידת קוטר כלי דם בarterioles, נימים וvenules (מיקרומטר).
   1. וידאו עומס או תמונות מAV-החבילות המוקלטות או שדות הנימים לתוך התוכנה. לקבלת התוצאות הטובות ביותר להשתמש בתמונות סטילס או קטעי וידאו עם הגדלה הגבוהה ביותר שבו גבולות ברורים של כלי השיט גלויים לעין.
   2. השתמש בפונקציה "DiamPe" של התוכנה כדי לוודא המדידות מתבצעות ניצב לקיר של כלי השייט. כדי לעשות זאת לסמן שתי נקודות על החומה של הכלי ועם הסימן לחץ שליש מהקוטר האנכי של כלי השיט. התוכנה תבצע את המדידה במיקרומטר.
   3. חזור על המדידות באותו כלי עבור כל ההקלטות באותו המקום. למדוד נימים מרובות כדי לצבור קוטר ממוצע.
3. ניתוח של מהירות תאי דם אדומה (RBC) בarterioles, נימיםnd venules (מ"מ / שנייה).
   1. למהירות arteriolar תאי דם אדומה (RBC) מדידות (מ"מ / s) להשתמש בפונקצית "VeloLSD" של התוכנה ולבחור את אותו כלי בחלון dextran ניאון שהקטרים ​​נמדדו.
   2. לנתח אותו עם מערכת ניתוח תמונה בעזרת מחשב תוך שימוש בשיטת שינוי הקו, שהוא על בסיס המדידה של המשמרת (מ"מ) של דפוס רמת פרט תוך-אפור לאורך זמן (שניות).
4. מדידה של זרימת נפח דם בכלי (PL / sec).
   1. חישוב זרימת נפח דם (PL / sec) בarterioles, venules ונימים משטח חתך מהירות וכלי RBC (π * r ²⁾ על פי המשוואה של גרוס וAroesty, כלומר, Q = V * π * r ² , בהנחת שצורת כלי גלילית ^30.
5. מדידת צפיפות נימים פונקציונלית של נימים-perfused RBC (זלוף התזונתי: סנטימטר / סנטימטר 2).
   1. לטעון שדה נימי ניאון נרשם עם הגדלה 20X אובייקטיבית לתוך התוכנה. השתמש בפונקציה "DensLA" למדידת צפיפות נימים פונקציונלית של microvessels-perfused RBC.
   2. עקוב אחר נימי perfused עם הסמן ולסמן את כלי perfused. אל תסמן שאינו perfused נימים, arterioles או venules. התוכנה תהיה למדוד צפיפות נימים פונקציונלית של נימי perfused בס"מ / ² סנטימטר. חזור על השלבים לשדות נימים נרשמו אחרים.
6. מדידה של tortuosity של microvessels (שיפוץ כלי דם), סימנים מוקדמים של אנגיוגנזה כגון ניצן וניבט היווצרות וmicrovessels שהוקמה זה עתה.
   1. עומס נרשם בסרטי וידאו או מסגרות של שדות נימי ניאון לתוך התוכנה. לזהות כלי gyrose ולהשתמש בפונקציית "TorqIx" של התוכנה. עקוב אחר זרימת הכלי מובהקת מהקורס ומסתיים בקליק ימני. התוכנהלצייר קו ישר לאופן ישיר ויגדיר אותו ביחס לנתיב לייחס.
      הערה: תיזהר סימנים של אנגיוגנזה כגון ניצנים, נבטים ונימים שהוקמו זה עתה, אשר בדרך כלל נובעים בניצב לנימים קיימות מראש. מדוד את הצפיפות של כלי הוקמו זה עתה אלה כמתואר בשלב 3.5.
7. זיהוי של מאפיינים למוות של תאים אפופטוטיים, כגון עיבוי גרעיני, פיצול ו / או margination (תאים / מ"מ ^2).
   1. לטעון קטעי וידאו מוקלטים Bisbenzimide (אובייקטיבי 50X) לתוך התוכנה. השתמש בפונקציה "DenseNA". לסמן תאים אפופטוטיים פי המאפיינים שהוזכרו כגון עיבוי גרעיני, פיצול וmargination בלחיצה שמאלי.
   2. לאחר סימון כל התאים האופייניים בכל הווידאו, לחץ על "N / A" בתוכנה, אשר באופן אוטומטי לספור את כל תאים המסומנים ולחלק אותו בכל האזור. התוצאה תהיה אפופטוטייםתאים / מ"מ ^2.
8. ניתוח של דבקות ויקוציטים לאנדותל כלי הדם מייצג דלקת. דבקות לסירוגין של לויקוציטים (כדוריות דם לבנות מתגלגל; דבקות <30 שניות: מספר הגלילים / ² מ"מ משטח אנדותל) וקשר חזק של לויקוציטים (דבק לויקוציטים; דבקות> 30 שניות: מספר המדבקות / ² מ"מ משטח אנדותל).
   1. לנתח את התגובה הדלקתית על ידי ספירת מספר Rhodamine שכותרתו כדוריות דם לבנות שדבקו באנדותל רירית venules פוסט-נימים עבור תקופת זמן של ≥30 שניות ("מדבקות") וכדוריות הדם לבנות לסירוגין דבקות (<30 שניות, "רולים") . דבקות ויקוציטים Venular באה לידי ביטוי כתאים לכל מ"מ ² משטח אנדותל.
9. מדידה של רמות אפורות תוך-וביניים כפרמטר לדליפת כלי דם (E extravasation macromolecular = E1 / E2).
   1. להעריך l macromoleculareakage כפרמטר של חדירות כלי דם לאחר הזרקת IV של dextran ניאון. Densitometrically לקבוע רמות אפורות מרובות ברקמה סמוכה ישירות לדופן כלי דם נימים (E1), כמו גם בפלסמת התא ללא השולית של כלי השיט (E2). ואז לחשב extravasation macromolecular (E) כיחס E1 / ³¹ E2.

4. לאחר ניתוח טיפול

1. להחזיר את בעל החיים בכלוב נפרד כדי למנוע את חברתם של בעלי חיים אחרים, עד שהתאושש באופן מלא. אל תשאירו בעלי חיים ללא השגחה עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור על שכיבה sternal. צג חיות יומיות לדימום, מקומי וסימנים מערכתיים של זיהום ואת המיקום של החדר.
2. להעריך את המצב הכללי של בעלי החיים על ידי התבוננות פעילות מוטורית, משקל גוף, סימנים של כאב, סובלנות להלבשה ואוטומטית הטלת המום.
3. שמור על העכברים אחד בכל כלוב, כדי למנוע מוטוהמניפולציה אל של החדר. בכל סימן של כאב, להחיל עצירות במינון של 0.05-0.1 מ"ג / קילוגרם BW, תת עורי ב 8 מרווחי שעה.

5. המתת חסד וexplantation של לשכת skinfold

1. ביום 10, להקריב בעלי חיים באמצעות מנת יתר של סמים הרדמה (150 מ"ג / קילוגרם Pentobarbital).
2. הסר את התא ולדגום רקמות דש למבחני חלבון immunohistochemical ומולקולריים. רקמות לדוגמא עבור היסטולוגיה הקונבנציונלית (פורמלין) ומבחנים לכימות חלבון (חנקן נוזלי או קרח יבש).

תוצאות

הִתמַקְקוּת

נקודת הסיום העיקרית של מודל זה - גובה דש נמק רקמות לאחר (כלומר, אינדוקציה של איסכמיה המתמשכת האקוטית) - נמדדה שוב ושוב ומאויר macroscopically כפי שמוצגת באיור 3 על פני תקופה של 10 ימים. סימון סופי של נמק דש...

Discussion

על מנת להקטין את סיבוכי איסכמי ובכך לשפר את התוצאה הקלינית, נדרש ידע מפורט יותר של תהליכי pathophysiologic ברקמת דש perfused ביקורתי. פיתוח מודלים של בעלי החיים חדשים המחקים איסכמיה מתמשכת חריפה ולכן חובה. בהתאם לכך, היינו יכול לפתח מודל לשחזור בקלות ואמין המאפשר הערכה בזמן אמת מ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
C57Bl/6 mice 6-8w 20-22g	Charles River
depilation cream	Veet		any depilation cream
titanium chamber	Irola	160001	Halteblech M
slotted cheese head screw	Screws and More	842210	DIN84 M2x10
hexagon full nut	Screws and More	93422	DIN934 M2
snap ring	Schaefer-Peters	472212	DIN472 J12x1,0
cover glass	Volab		custom-made cover glass 11,8mm in diameter
fixing foam	tesamoll	05559-100	tesamoll Standard I-Profile
ketamine hydrochloride	Parke Davis		Ketavet®
dihydroxylidinothiazine hydrochloride	Bayer		Rompun®
Buprenorphin	Essex Pharma		Temgesic®
Saline 0,9%
desinfection alcohol
Vicryl 5-0	Ethicon	V 490 H
Ethilon 5-0	Ethicon	EH 7823 H
1ml syringes
surgical skin marker with flexible ruler	Purple surgical	PS3151	any surgical skin marker and flexible ruler
pointed scissors
Micro-Scissors
normal scissors
2 clamps
fine anatomic forceps
micro-forceps
hex nuter driver	wiha	1018
screwdriver	wiha	685
snap ring plier	Knipex	4411J1	12-25mm
wire cutter	Knipex	70 02 160	Wire cutter is used to cut screws short; 160mm
trans-illumination light	IKEA	501.632.02	LED light Jansjö; any light
magnification glasses
intravital microscope	Zeiss	490035-0001-000	Scope.A1.Axiotech
LED system	Zeiss	423052-9501-000	Colibri.2
LED module 365nm	Zeiss	423052-9011-000
LED module 470nm	Zeiss	423052-9052-000
LED module 540-580nm	Zeiss	423052-9121-000
Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed	Zeiss	489062-9901-000	range 1: 350-390nm excitation wavelength split 395 / 402-448nm; range 2: 460-488nm, split 495nm / 500-557nm; range 3: 567-602nm, split 610nm / 615-infinite
Filter set 20 Rhodamine	Zeiss	485020-0000-000	540-552nm, split 560, emission 575-640nm
2,5x objective NA=0,06	Zeiss	421020-9900-000	A-Plan 2,5x/0.06
5x objective NA=0,16	Zeiss	420330-9901-000	EC Plan-Neofluar 5x/0.16 M27
10x objetive NA=0,30	Zeiss	420340-9901-000	EC Plan-Neofluar 10x/0.30 M27
20x objective NA=0.50	Zeiss	420350-9900-000	EC Plan-Neofluar 20x/0.50 M27
50x objective NA=0,55	Zeiss	422472-9960-000	LD Epiplan-Neofluar 50x/0.55 DIC 27
ZEN imaging software	Zeiss		ZenPro 2012
CapImage	Dr. Zeintl
Fluorescein isothiocyanate-dextran	Sigma-Aldrich	45946
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride	Sigma-Aldrich	B2261	harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause repiratory irritat
Rhodamine 6G chloride	Invitrogen	R634	harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child
Pentobarbital	Merial		Narcoren®