Lesiones tejido isquémico en la Cámara de los pliegues cutáneos dorsal del ratón: Un modelo de la piel de la aleta para Investigar la isquemia aguda persistente

Resumen

La ventana de la cámara de pliegue cutáneo dorsal murino presentado visualiza una zona de isquemia aguda persistente de un colgajo musculocutáneo. Intravital permisos de microscopía de fluorescencia para epi-evaluación directa y repetitiva de la microvasculatura y la cuantificación de la hemodinámica. Morfológicas y resultados hemodinámicos más pueden ser correlacionados con los análisis histológicos y moleculares.

Resumen

A pesar de la experiencia profunda y técnicas quirúrgicas avanzadas, las complicaciones inducidas por la isquemia que van desde la ruptura de la herida a la extensa necrosis de los tejidos siguen ocurriendo, sobre todo en la cirugía de colgajo reconstructiva. Se han desarrollado varios modelos experimentales de solapa para analizar las causas y los mecanismos subyacentes e investigar estrategias de tratamiento para prevenir complicaciones isquémicas. El factor limitante de la mayoría de los modelos es la posibilidad de que carecen para visualizar directamente y repetitivamente arquitectura microvascular y la hemodinámica. El objetivo del protocolo es presentar un modelo de ratón bien establecida afiliarse estos elementos carecen antes mencionados. Harder et al. Han desarrollado un modelo de un colgajo musculocutáneo con un patrón al azar de perfusión que sufre la isquemia aguda y persistente resultados en ~ 50% de necrosis después de 10 días si se mantiene sin tratar. Con la ayuda de intravital microscopía de epi-fluorescencia, este modelo de cámara permite la visualización repetitiva demorfología y la hemodinámica en diferentes regiones de interés con el tiempo. Procesos asociados, tales como la apoptosis, la inflamación, la fuga microvascular y la angiogénesis pueden ser investigados y correlacionados con ensayos de proteínas inmunohistoquímicos y moleculares. Hasta la fecha, el modelo ha demostrado la factibilidad y reproducibilidad en varios estudios experimentales publicados que investigaron el efecto de pre, peri y poscondicionamiento de tejido isquémicamente desafiado.

Introducción

Cobertura de material de tendón, hueso y el implante expuesto en la cirugía reconstructiva se basa en el uso de colgajos. Un colgajo es un bloque de tejido que se transfiere en su pedículo vascular que garantiza el flujo arterial y flujo de salida venoso. A pesar de una amplia experiencia y la disponibilidad de una variedad de aletas para ser transferidos, que aún se registran complicaciones inducidas por la isquemia que van desde la ruptura de la herida a la pérdida total del tejido. Mientras que el tratamiento conservador y la curación por segunda intención se puede esperar después de la necrosis del tejido menor, necrosis del colgajo significativa por lo general requiere revisión quirúrgica, incluyendo el desbridamiento, el acondicionamiento de la herida y reconstrucción secundaria. Esto aumenta la morbilidad, prolonga la estancia hospitalaria y en consecuencia conduce a un aumento de los costos de atención de salud.

Flaps con un patrón definido de la vasculatura o áreas perfundidos al azar en la zona distal más alejada del flujo de entrada arterial son particularmente propensos a daño isquémico. Acco rdingly, numerosos estudios experimentales y clínicos han evaluado el desarrollo de necrosis en tanto, colgajos de patrón axial (suministro de sangre definida) y colgajos de patrón aleatorio (suministro de sangre no definido) ^3.1. Las principales conclusiones se basan comúnmente en la evaluación macroscópica de la extensión de la zona necrótica. Con el fin de evaluar las causas y mecanismos de la necrosis de los tejidos más en detalle, varios estudios se centraron en el análisis de la microcirculación. Diferentes técnicas han sido utilizadas para medir la perfusión del tejido, incluyendo el análisis de la tensión de oxígeno del tejido usando electrodos polarográficos ^4-5, así como la medición del flujo de sangre usando flujometría láser Doppler ^6-7, tinte de difusión ^8, y las microesferas ^9-10. Estas técnicas, sin embargo, sólo permiten medir parámetros indirectos de la perfusión tisular y no permiten ningún análisis morfológico de los procesos microhemodynamic dentro de una zona individual de interés de un colgajo.

t "> Sandison es conocido por ser el primero que ha utilizado una cámara transparente para prolongada en los estudios in vivo, que se realizó en conejos ¹¹ En 1943 -. aproximadamente 20 años más tarde - Algire fue el primero en adaptar una cámara de tan transparente que es aplicable en ratones con el fin de estudiar el comportamiento de los micro-implantes de células tumorales ^12. Debido al hecho de que los ratones son los llamados animales de piel suelta y después de algunas mejoras técnicas en los años siguientes, Lehr y compañeros de trabajo fueron capaces de adaptar tales una cámara de pliegue cutáneo dorsal desarrollo de una cámara de titanio más pequeño y ligero. Esta cámara de activar la evaluación mediante microscopía de fluorescencia intravital, una técnica que permite la visualización directa y repetitiva de un número de características morfológicas y de la microcirculación y sus cambios en el tiempo bajo diferentes condiciones fisiológicas y fisiopatológicas, tales como la lesión por isquemia-reperfusión ^13.

En la investigación del PErfusion de colgajos de piel, músculo y hueso en condiciones normales y patológicas dos tendencias se produjo: En primer lugar, los modelos de solapa "agudos" que no utilizan la cámara del pliegue cutáneo dorsal como la oreja pediculado en el ratón ^14, el colgajo de piel isla basada lateralmente en el hámster ¹⁵ y la solapa de material compuesto pediculado en la rata ^16. En segundo lugar, el modelo de aleta "crónica" donde la combinación de una aleta con una cámara lo permite pliegues cutáneos dorsal de la microcirculación repetitivo analiza lo largo de varios días con microscopía de fluorescencia intravital. Se compone de un colgajo musculocutáneo perfundido al azar que está integrado en la cámara de los pliegues cutáneos del ratón ^17. Su proporción entre anchura y longitud que se eligió una situación de isquemia aguda persistente como resultado consistentemente en ~ 50% de necrosis tisular aleta 10 a 14 días después de la elevación del colgajo. Esta medida reproducible de necrosis de los tejidos permite una evaluación posterior de ambos, de protección (es decir, el desarrollo de less necrosis) y factores perjudiciales (es decir, desarrollo de más necrosis) en la fisiopatología solapa. Durante los últimos años, varias publicaciones experimentales que demuestren el efecto de diferentes pre, peri y procedimientos post-acondicionamiento, incluyendo la administración de sustancias de protección de tejido ^18-24 y la aplicación local de factores de estrés fisiológicos tales como el calor ²⁵ y ^{26 de} ondas de choque, han surgido.

Los análisis cuantitativos de la necrosis, la morfología microvascular y los parámetros de la microcirculación más pueden ser correlacionados a los análisis inmunohistoquímicos y ensayos de proteínas. Diferentes proteínas y moléculas, incluyendo el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), óxido nítrico sintasas (NOS), factor nuclear kappa B (NF-kB) y proteínas de choque térmico (HSP-32: hemo-oxigenasa 1 (HO-1) y HSP- 70) han sido demostrado que desempeñan un papel en la protección de los tejidos. Basándose en este modelo tapa de la cámara, dos modificaciones se han desarrollado en order para analizar la neovascularización y la microcirculación de la piel durante la cicatrización del injerto ²⁷ y desarrollos angiogénicos en un colgajo pediculado con el patrón axial perfusión ^28. Presentamos un modelo reproducible y fiable que incluye un colgajo musculocutáneo isquémicamente desafiado en la cámara de los pliegues cutáneos del ratón. Este modelo permite la visualización y cuantificación de la microcirculación y la hemodinámica por intravital microscopía de epi-fluorescencia.

Protocolo

NOTA: Antes de la implementación del modelo presentado, las leyes de protección animal correspondiente deben ser consultados y deben obtener permiso de las autoridades locales. En este trabajo, todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con los principios rectores de los animales de investigación que involucra y la legislación alemana sobre protección de los animales. Los experimentos fueron aprobados por el comité local de cuidado de los animales.

1. Preparación de Animales y elevación quirúrgica del colgajo

1. Mantener a los animales en jaulas individuales a temperatura ambiente de 22-24 ° C y con una humedad relativa de 60-65% con un ciclo de día y noche de 12 horas. Permitir ratones libre acceso al agua potable y comida estándar de laboratorio. Siempre mantener condiciones estériles durante la cirugía de la supervivencia.
2. Anestesiar el ratón por vía intraperitoneal (ip) de inyección de 0,1 ml de solución salina por 10 g de peso corporal que contiene 90 mg / kg de peso corporal clorhidrato de ketamina y 25 mg /kg de peso corporal clorhidrato dihydroxylidinothiazine. La anestesia es necesario para la preparación animal, la cirugía y la microscopía subsiguiente. Confirmar anestesia adecuada por el control de la respuesta a un estímulo doloroso. Durante el tiempo de anestesia, aplique ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad.
3. Después de la inducción de la anestesia suficiente, depilarse la espalda con una rasuradora eléctrica. De aquí en adelante, aplique crema de depilación a la zona de afeitado para eliminar el resto del cabello.
4. Durante el tiempo de residencia de la crema de depilación de ~ 7-10 min, preparar instrumentos, incluyendo fórceps de la piel y micro forceps, tijeras y micro tijeras, material de sutura y un rotulador. Desinfectar y preparar la cámara de titanio mediante la aplicación de los dos tornillos con la tuerca en la base de la cámara y por la fijación autoadhesiva de espuma (Fig. 1 AC) alrededor de la ventana de la contraparte de la cámara para garantizar la estanqueidad del sistema de cámara.
5. Quite toda la crema de depilación de la parte posterior por lavadoapagado con agua tibia. Entonces seco y desinfectar la piel con una solución que contiene alcohol.
6. Coloque el ratón en posición prona y definir la línea media de la espalda. Sujete la piel de forma centralizada y levántela para crear un pliegue (Fig. 2A). Por trans-iluminación utilizando cualquier tipo de fuente de luz, decidir dónde colocar provisoriamente el marco de titanio (Fig. 2B). Asegúrese de que las ramas distales de la arteria torácica lateral (LTA) craneal y la arteria circunfleja ilíaca profunda (DCIA) caudalmente curso a través del centro de la ventana de la cámara (Fig. 2B-D). Una vez que el posicionamiento de la cámara se hace, perforar ambas capas de la piel en la parte inferior de la tapa para la fijación posterior del marco de titanio. Ahora retire el marco de titanio, coloque el ratón en posición prona y redefinir la línea media de la espalda si es necesario.
7. Esquema de la aleta perpendicular a la columna vertebral a partir de la línea media con una relación entre anchura y longitud de 15 x 11 mm para dar como resultado un colgajo de base lateral y perfundido al azar. Luego delinear un área de la piel adicional de 2 mm que se extienden hacia el lado contralateral (Fig. 2C, D). Esta área se recogió con las pinzas y posteriormente se sutura a la estructura de titanio sin interferir con el área de la aleta visible.
8. Tras el marcado final, incisión del colgajo. Al hacerlo, seccionar tanto el LTA y DCIA y elevar la tapa (Fig. 2E). No es necesario para la coagulación o la ligadura de los vasos seccionados.
9. Coloque el tornillo de la cámara a través de las perforaciones de la piel previamente realizadas (Fig. 2F) y fijar el pliegue cutáneo, tanto anterior y posteriormente dentro del marco de la cámara de la solapa elevada a la parte trasera del bastidor usando los agujeros del marco de la cámara y un 5-0 suturas interrumpidas (Fig. 2G).
10. Suturar las extremidades verticales de la solapa posterior a la piel circundante por medio de suturas interrumpidas 5-0 ( Fig. 2H, I).
11. Extirpar una zona de hemi-circular de la piel lateral a la tira pequeña de la piel de 2 mm, es decir, en el otro lado de la aleta para observar la vasculatura del colgajo. Esto permite la visión directa a través de la ventana de observación de la cámara que tiene una superficie de 90 mm ^​​2.
12. Retire el tejido areolar suelto gelatinoso del músculo estriado utilizando instrumentos de microcirugía y lente de aumento óptico o microscopio con el fin de mejorar la calidad de la imagen durante la microscopía. Trate de no dañar los vasos dentro de las capas de tejidos musculares.
13. Finalmente, sellar la cámara mediante el montaje de la contraparte de la trama que ha sido previamente dotado con tiras auto adherentes de espuma anteriormente, cranealmente y posteriormente, bedew la solapa con bisbenzimide tópica y solución salina (Fig. 2J). A partir de entonces, aplicar la ventana de observación con una cubierta de vidrio utilizando un anillo de retención. Trate de no atrapar ningún ampollas de aire bajo el cristal (fig. 2 K, L). La piel se adhiere a la cubierta de vidrio por las fuerzas de adhesión.

2. intravital microscopía de epifluorescencia

1. Espere 24 horas después de la preparación quirúrgica para el primer análisis microscópico de la calidad óptica ideal. Este análisis representa la línea de base de la microscopía y se repite en el día 3, 5, 7 y 10 después de la cirugía. Cada vez, anestesiar el ratón como se describe en el paso 1.2. Colocar el animal en posición decúbito lateral en un soporte de plexiglás hechos a medida. De esa manera, las capas de tejido musculares del colgajo se adhiere a la cubierta de vidrio queden mirando hacia arriba-hacia.
2. Inyectar 0,05 ml de 5% de dextrano de fluorescencia verde (peso molecular 150.000) y 0,05 ml de 1% de colorante de la familia altamente fluorescente Rodamina en una vena de la cola o el plexo venoso retro-bulbar. El dextrano fluorescente verde tiñe los componentes no celulares de la sangre si se aplica por vía intravenosa (iv). El fluorescente rodamina manchas de leucocitos y plaquetas que puede ser distinguished de otros componentes celulares y no celulares. Finalmente, bisbenzimide tiñe componentes nucleares que emiten más o menos la fluorescencia de acuerdo con el estado de la condensación.
3. Posteriormente, colocar el ratón bajo el microscopio. Asegúrese de que el microscopio incluye un sistema de LED - LED para combinaciones de haces 470 y 425 nm, 365 y 490 nm, y 540 y 580 nm, así como los conjuntos de filtros correspondientes (62 HE BFP / GFP / HcRed, rango de 1: 350 a 390 nm longitud de onda de excitación, divide 395 nm / 402-448 nm; intervalo de 2: 460-488 nm, divide 495 nm / 500 hasta 557 nm, rango 3: 567-602 nm, divide 610 nm / 615 nm a 20 Rodamina infinita, gama. : 540-552 nm, divide 560 nm, emisión de 575 a 640 nm).
4. Registre las imágenes fijas y en movimiento-imágenes usando una cámara de vídeo del dispositivo de acoplamiento de carga y guardarlos en un disco duro de la computadora para el análisis adicional fuera de línea.
5. Utilice diferentes objetivos (2.5 veces, NA (apertura numérica) = 0,06 para las vistas panorámicas de la cámara; 5X,NA = 0,16; 10X, NA = 0,32; 20X, NA = 0,50; 50X, NA = 0,55) para las grabaciones de las regiones de interés.
6. Prácticamente, dividir la superficie de la pestaña que es visible a través de la ventana de la cámara en tres áreas de igual altura, es decir, una proximal, una central, y una zona distal más alejada de la entrada vascular (Fig. 3F). Para la adquisición de imágenes, proceda de la siguiente manera en cada punto de tiempo de observación:
   1. Escanear la imagen del tejido por imagen dentro de la ventana de la cámara de proximal a distal usando el objetivo de 5X.
   2. En cada área de la solapa, seleccione las arteriolas de segundo o tercer orden y sus vénulas acompañan con patrones de ramificación fácilmente identificables. Usando el objetivo de 5X, 10X, 20X o, hacer impresiones de los haces de arteriovenosas con el fin de volver a localizar fácilmente los haces durante todo el período de observación.
   3. Con el objetivo de 20X y el objetivo 50X, otros campos capilares récord de 5-6 y "apoptótica"campos por área de la aleta, respectivamente. Todas las imágenes grabadas con la 10X y 20X objetivos usan la luz azul (dextrano fluorescente) y la luz verde (rodamina) filtro, mientras que las imágenes grabadas con el 5X y 50X uso objetivo de color azul claro (dextrano fluorescente) y la luz blanca (bisbenzimide) filtro, respectivamente .

3. El análisis de los datos registrados

NOTA: Con el uso de un sistema de análisis de imagen asistido por ordenador cuantificar todos los parámetros registrados fuera de línea ²⁹ de la siguiente manera.

1. Medición de la zona de no-perfundido, el tejido necrótico, respectivamente (mm ^2).
   1. Utilice la imagen completa cámara de escaneado ventana grabado con el objetivo de 5X (de 2.6.1) y el dextrano fluorescente para medir tejido no perfundido respectivamente necrótico. Utilice la función "AreaBo" para medir el área no perfundida oscuro: Frontera de la zona para no perfundido y calcular el área en mm ² mediante el uso de algoritmos de medición de área del software.
2. Medición de diámetro microvascular en las arteriolas, capilares y vénulas (M).
   1. Carga de vídeo o imágenes de los AV-haces grabados o los campos de capilares en el software. Para obtener los mejores resultados, utilice los alambiques o videos con la más alta magnificación, donde las fronteras definitivas de la embarcación son claramente visibles.
   2. Utilice la función "DiamPe" del software para asegurarse de que las mediciones se realizan perpendicular a la pared del vaso. Para ello marca de dos puntos en la pared del recipiente y con la tercera marca clic el diámetro perpendicular de la embarcación. El software realizará la medición en micras.
   3. Repita las mediciones en los mismos buques de todas las grabaciones en el mismo lugar. Mida múltiples capilares para acumular diámetro medio.
3. Análisis de la velocidad de glóbulos rojos (RBC) en las arteriolas, capilares unnd vénulas (mm / seg).
   1. Para las arteriolas de glóbulos rojos (RBC) de velocidad (mm / s) mediciones utilizan la función "VeloLSD" del software y eligen los mismos buques en la ventana de dextrano fluorescente para el que se han medido los diámetros.
   2. Analizar con el sistema de análisis de imagen asistido por ordenador usando el método de desplazamiento de la línea, que está en la base de la medición del desplazamiento (mm) de un patrón de nivel de gris intravascular individuo con el tiempo (sec).
4. Medición del flujo sanguíneo en los vasos volumétrica (pl / seg).
   1. Calcular el flujo volumétrico de la sangre (pl / seg) en las arteriolas, vénulas y capilares a partir de la velocidad y el recipiente de área de sección transversal RBC (π * r ²⁾ de acuerdo con la ecuación de Gross y Aroesty, es decir, Q = V * π * r ² , suponiendo un recipiente de forma cilíndrica ^30.
5. Medida de la densidad capilar funcional de los capilares perfundidos-RBC (perfusión nutritivo: cm / cm 2).
   1. Cargar un campo capilar fluorescente grabado con 20X aumento del objetivo en el software. Utilice la función "DensLA" para medir la densidad capilar funcional de microvasos perfundidos-RBC.
   2. Traza los capilares perfundidos con el cursor y marcar los vasos perfundidos. No marque no perfundido capilares, arteriolas o vénulas. El software medir la densidad capilar funcional de los capilares perfundidos en cm / cm ^2. Repita los pasos para los otros campos capilares registrados.
6. La medición de la tortuosidad de los microvasos (remodelación microvascular), los primeros signos de la angiogénesis tales como brote y brote de formación de microvasos y de nueva formación.
   1. Cargar vídeos o marcos de campos capilares fluorescentes registró en el software. Identificar los vasos Gyrose y utilizar la función de "TorqIx" del software. Trazar el flujo recipiente definitivo con el curso y terminar con un clic derecho. El software lo harádibujar una línea recta por el camino directo y pondrá en relación con el camino trazado.
      NOTA: Tenga cuidado con los signos de la angiogénesis tales como yemas, brotes y capilares recién formados, que por lo general emanan perpendicularmente desde los capilares preexistentes. Medir la densidad de estos vasos recién formados como se describe en el paso 3.5.
7. Identificación de las características de la muerte celular por apoptosis, tales como la condensación nuclear, la fragmentación y / o marginación (células / mm ^2).
   1. Cargar vídeos grabados-bisbenzimide (objetivo 50X) en el software. Utilice la función "DenseNA". Marque las células apoptóticas de acuerdo con las características mencionadas, tales como la condensación nuclear, la fragmentación y la marginación con un clic izquierdo.
   2. Después de marcar todas las células característicos de todo el video, haga clic en "N / A" en el software, que contará de forma automática todas las células marcadas y se divide en toda la zona. El resultado será apoptóticacélulas / mm ^2.
8. Análisis de la adhesión de leucocitos al endotelio vascular representa la inflamación. Adherencia intermitente de los leucocitos (leucocitos de rodadura; adherencia <30 s: número de rodillos / mm ² de superficie endotelial) y la adhesión firme de los leucocitos (leucocitos se pegue; adherencia> 30 s: número de pegatinas / mm ² de superficie endotelial).
   1. Analizar la respuesta inflamatoria mediante el recuento del número de leucocitos de rodamina que se adhirieron al revestimiento endotelial de las vénulas post-capilares para un período de tiempo de ≥30 seg ("pegatinas") y los leucocitos se adhieren de forma intermitente marcado (<30 seg, "rodillos") . La adhesión de leucocitos venular se expresa como células por mm ² de superficie endotelial.
9. Medición de niveles de gris intravasculares e intersticiales como un parámetro para la fuga microvascular (extravasación macromolecular E = E1 / E2).
   1. Evaluar l macromoleculareakage como un parámetro de la permeabilidad microvascular después de una inyección iv de un dextrano fluorescente. Densitométricamente determinar múltiples niveles de gris en el tejido directamente adyacente a la pared del vaso capilar (E1), así como en el plasma libre de células marginal del recipiente (E2). A continuación, calcular la extravasación macromolecular (E) como la relación de E1 / E2 ^31.

4. Cuidado Postoperatorio

1. Volver al animal en una jaula separada para evitar la compañía de otros animales hasta que se recupere completamente. No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener el decúbito esternal. Monitorear los animales todos los días para el sangrado, local y signos sistémicos de infección y la posición de la cámara.
2. Evaluar el estado general del animal mediante la observación de la actividad motora, el peso corporal, signos de dolor, la tolerancia al apósito y auto-mutilación.
3. Mantener los ratones uno por jaula para evitar Mutual manipulación de la cámara. En cualquier señal de dolor, aplique buprenorfina a una dosis de 0,05 a 0,1 mg / kg de peso corporal, por vía subcutánea en intervalos de 8 h.

5. La eutanasia y Explantación de la Cámara de los pliegues cutáneos

1. En el día 10, sacrificar los animales utilizando una sobredosis de un fármaco anestésico (150 mg / kg de pentobarbital).
2. Retire la cámara y muestra el tejido colgajo para ensayos de proteínas inmunohistoquímicos y moleculares. Tejidos de muestra para histología convencional (formol) y ensayos de proteínas cuantificables (nitrógeno líquido o hielo seco).

Resultados

Necrosis

El objetivo principal de este modelo - necrosis de tejidos después de la elevación del colgajo (es decir, la inducción de la isquemia aguda persistente) - se mide y se ilustra macroscópicamente como se muestra en la Figura 3 durante un período de 10 días repetidamente. Demarcación final de necrosis del colgajo ocurre generalmente entre 5 y 7 días después de la cirugía y se caracteriza por una franja roja, es decir, la zon...

Discusión

Con el fin de disminuir las complicaciones isquémicas y así mejorar el resultado clínico, se requiere un conocimiento más detallado de los procesos fisiopatológicos en el tejido perfundido aleta críticamente. El desarrollo de nuevos modelos animales que imitan la isquemia aguda persistente tanto, es obligatorio. En consecuencia, hemos sido capaces de desarrollar un modelo fácilmente reproducible y fiable que permite repetitivo evaluación morfológica, dinámica y funcional en tiempo real de varios parámetros de...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
C57Bl/6 mice 6-8w 20-22g	Charles River
depilation cream	Veet		any depilation cream
titanium chamber	Irola	160001	Halteblech M
slotted cheese head screw	Screws and More	842210	DIN84 M2x10
hexagon full nut	Screws and More	93422	DIN934 M2
snap ring	Schaefer-Peters	472212	DIN472 J12x1,0
cover glass	Volab		custom-made cover glass 11,8mm in diameter
fixing foam	tesamoll	05559-100	tesamoll Standard I-Profile
ketamine hydrochloride	Parke Davis		Ketavet®
dihydroxylidinothiazine hydrochloride	Bayer		Rompun®
Buprenorphin	Essex Pharma		Temgesic®
Saline 0,9%
desinfection alcohol
Vicryl 5-0	Ethicon	V 490 H
Ethilon 5-0	Ethicon	EH 7823 H
1ml syringes
surgical skin marker with flexible ruler	Purple surgical	PS3151	any surgical skin marker and flexible ruler
pointed scissors
Micro-Scissors
normal scissors
2 clamps
fine anatomic forceps
micro-forceps
hex nuter driver	wiha	1018
screwdriver	wiha	685
snap ring plier	Knipex	4411J1	12-25mm
wire cutter	Knipex	70 02 160	Wire cutter is used to cut screws short; 160mm
trans-illumination light	IKEA	501.632.02	LED light Jansjö; any light
magnification glasses
intravital microscope	Zeiss	490035-0001-000	Scope.A1.Axiotech
LED system	Zeiss	423052-9501-000	Colibri.2
LED module 365nm	Zeiss	423052-9011-000
LED module 470nm	Zeiss	423052-9052-000
LED module 540-580nm	Zeiss	423052-9121-000
Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed	Zeiss	489062-9901-000	range 1: 350-390nm excitation wavelength split 395 / 402-448nm; range 2: 460-488nm, split 495nm / 500-557nm; range 3: 567-602nm, split 610nm / 615-infinite
Filter set 20 Rhodamine	Zeiss	485020-0000-000	540-552nm, split 560, emission 575-640nm
2,5x objective NA=0,06	Zeiss	421020-9900-000	A-Plan 2,5x/0.06
5x objective NA=0,16	Zeiss	420330-9901-000	EC Plan-Neofluar 5x/0.16 M27
10x objetive NA=0,30	Zeiss	420340-9901-000	EC Plan-Neofluar 10x/0.30 M27
20x objective NA=0.50	Zeiss	420350-9900-000	EC Plan-Neofluar 20x/0.50 M27
50x objective NA=0,55	Zeiss	422472-9960-000	LD Epiplan-Neofluar 50x/0.55 DIC 27
ZEN imaging software	Zeiss		ZenPro 2012
CapImage	Dr. Zeintl
Fluorescein isothiocyanate-dextran	Sigma-Aldrich	45946
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride	Sigma-Aldrich	B2261	harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause repiratory irritat
Rhodamine 6G chloride	Invitrogen	R634	harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child
Pentobarbital	Merial		Narcoren®