Ишемическая тканей Травмы в спинной кожной складки палаты Mouse: кожный лоскут модель для изучения Острая стойких ишемии

Резюме

Окно мышиного спинной кожной складки камеры, представленной визуализирует зону острого упорной ишемии мышечного лоскута. Прижизненные разрешения микроскопии эпи-флуоресценции для прямого и повторяющихся оценки микрососудов и количественной оценки гемодинамики. Морфологические и гемодинамики результаты также могут быть связаны с гистологических и молекулярных анализов.

Аннотация

Несмотря глубокой экспертизы и передовых хирургических методов, вызванного ишемией осложнений, начиная от ран пробоя некроза обширной ткани по-прежнему происходят, особенно в реконструктивной хирургии лоскута. Несколько экспериментальных моделей закрылков были разработаны для анализа основных причин и механизмов и исследовать стратегии лечения для предотвращения ишемических осложнений. Сдерживающим фактором для большинства моделей является отсутствие возможности непосредственно и повторно визуализировать микрососудистую архитектуры и гемодинамики. Цель протокола было представить устоявшуюся модель мыши присоединения этих прежде упомянутые недостающие элементы. Тяжелее др. Разработали модель мышечного лоскута со случайным перфузии рисунком, который подвергается острой постоянную ишемию и результаты в ~ некроза на 50% через 10 дней, если хранятся лечить. С помощью прижизненной эпи-флуоресцентной микроскопии, эта камера модель позволяет повторяющийся визуализациюМорфология и гемодинамика в различных регионах, представляющих интерес с течением времени. Сопутствующие процессы, такие как апоптоз, воспаление, утечки микрососудов и ангиогенеза могут быть исследованы и коррелирует с иммуногистохимических и молекулярных белковых анализов. На сегодняшний день, эта модель доказала целесообразность и воспроизводимость в нескольких опубликованных экспериментальных исследований, изучающих влияние пре-, пери- и посткондиционирования ишемией оспариваемого ткани.

Введение

Охват подвергаются сухожилия, кости и имплантата материала в реконструктивной хирургии опирается на использование закрылков. Заслонка блок ткани, которая передается на ее сосудистой ножки, что гарантирует артериальное приток и венозный отток. Несмотря на широкое экспертизы и наличия различных лоскутов, зачисляемые, вызванного ишемией осложнений, начиная от ран пробоя к полной потере тканей по-прежнему встречаются. В то время как консервативное лечение и исцеление вторичным натяжением можно ожидать после некроза незначительной ткани, значительное некроз лоскута обычно требуется хирургического вмешательства, в том числе хирургической обработки раны, раны кондиционирования и вторичной реконструкции. Это повышает заболеваемость, продлевает пребывание в больнице и, следовательно, приводит к увеличению расходов на здравоохранение.

Клапаны с неопределенной структуре сосудистой или случайно перфузированных областях в дистальной зоне наиболее удаленной от притока артериальной особенно склонны к ишемии. Акко rdingly, многочисленные экспериментальные и клинические исследования оценивали развитие некроза в оба, осевая картина закрылки (определяется кровоснабжение) и случайным образом закрылки (определено кровоснабжение) ^1-3. Основные результаты, как правило, основаны на макроскопической оценки размера зоны некроза. Для того, чтобы оценить причины и механизмы некроза тканей более подробно, в нескольких исследованиях сосредоточено на анализе микроциркуляции. Различные методы были использованы для измерения тканевой перфузии, в том числе при анализе тканей напряжения кислорода с использованием полярографические электроды ^4-5, а также измерением кровотока при помощи лазерной доплеровской флоуметрии ^6-7, диффузию красителя ^8, и микросферы ^9-10. Эти методы, однако, только позволяют для измерения параметров косвенные тканевой перфузии и не дать возможность любому морфологического анализа microhemodynamic процессов внутри отдельной области, представляющей интерес лоскута.

т "> Сандисон, как известно, первым, кто использовал прозрачный камеру для продлен в естественных условиях исследования, которые он совершал в кроликов ¹¹ В 1943 -. около 20 лет спустя - Algire был первым адаптировать такую ​​прозрачную камеру для применения у мышей с целью изучения поведения микро-имплантаты опухолевых клеток ^12. В связи с тем, что мыши, которые так называемого дряблая кожа животных и после некоторых технических уточнений в течение последующих лет, Лер и сотрудники смогли адаптироваться такие Спинной кожной складки камера разрабатывает меньше и легче титана камеру. Эта камера включена оценка с помощью прижизненной флуоресцентной микроскопии, технику, обеспечивающую прямое и повторяющийся визуализацию ряда морфологических и микроциркуляторных особенностей и их изменений во времени при различных физиологических и патофизиологических условиях, например как ишемии-реперфузии травмы ^13.

При исследовании реrfusion из кожи, мышечных и костных лоскутов при нормальных и патологических условиях две тенденции произошло: во-первых, "острые" модели закрылков, которые не используют в спинной кожной складки камеру, таких как pedicled уха заслонки в мыши ^14, в поперечном направлении, основанный лоскут остров кожи в хомяка ¹⁵ и pedicled сложного лоскута у крыс ^16. Во-вторых, "хронический" лоскут модель, где сочетание клапаном с камеры позволяет спинной кожной складки повторяющихся микроциркуляции анализирует в течение нескольких дней с прижизненной флуоресцентной микроскопии. Он состоит из беспорядочно перфузии мышечный лоскут, который интегрирован в кожной складки камере мыши ^17. Его отношение ширины к длине было выбрано, что ситуация острого упорной ишемии последовательно приводит в ~ некроза лоскута ткани 50% от 10 до 14 дней после закрылков высоте. Это воспроизводимая степень некроза тканей позволяет дальнейшую оценку и защитные (т.е. развитие леы некроз) и вредные факторы (то есть, развитие более некроза) на закрылков патофизиологии. В последние годы, несколько экспериментальных публикации, демонстрирующие эффект различной пре-, пери- и процедур пост-кондиционирования, в том числе администрации тканей-защитная веществ ^18-24 и местного применения физиологических факторов стресса, таких как тепловой ²⁵ и ударных волн ^26, появились.

Количественные анализы некроза, микрососудистой морфологии и микроциркуляции параметров дополнительно могут быть соотнесены с иммуногистохимических анализов и белкового анализа. Различные белки и молекулы в том числе фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), азотной синтазы оксида (NOS), ядерный фактор каппа В (NF-kB) и белков теплового шока (HSP-32: гем-оксигеназы 1 (HO-1) и HSP- 70) было показано, играют важную роль в защите тканей. На основе этой модели камера закрылка, две модификации были разработаны в Ордг проанализировать образование новых сосудов и микроциркуляции во кожей трансплантата исцеления ²⁷ и кровеносных сосудов разработок в pedicled лоскута с осевым образов перфузии ^28. Мы представляем воспроизводимую и надежную модель, которая включает в себя ишемически оспариваемый мышечный лоскут в мышь кожной складки камеры. Эта модель позволяет визуализировать и количественно микроциркуляции и гемодинамики по прижизненной эпи-флуоресцентной микроскопии.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед осуществлением представленной модели, законы соответствующий защиты животных необходимо проконсультироваться и разрешение на это должно быть получено от местных властей. В этой работе, все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами для исследований с участием животных и немецкого законодательства о защите животных. Эксперименты были одобрены местным комитетом по уходу за животными.

1. Подготовка животных и Хирургическая Высота створки

1. Держите животных в отдельных клетках при комнатной температуре 22-24 ° C и при относительной влажности воздуха 60-65% с 12-часовой день и-ночь цикла. Разрешить мышей свободный доступ к питьевой воде и стандартной лабораторной чау. Всегда поддерживать стерильные условия во время операции выживания.
2. Обезболить мышь внутрибрюшинно (IP) инъекция 0,1 мл физиологического раствора на 10 г веса тела, содержащего 90 мг / кг массы тела кетамина гидрохлорид и 25 мг /кг массы тела dihydroxylidinothiazine гидрохлорид. Обезболивание необходимо для подготовки животного, хирургии и последующей микроскопии. Подтвердите правильное обезболивание путем проверки реакции на болезненным стимулом. Во время анестезии, применяется ветеринар мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость.
3. После индукции достаточной анестезии, удалять волосы назад с электрической бритвы. Далее, применяются депиляции крем на бритой области, чтобы удалить оставшиеся волосы.
4. Во время пребывания депиляции кремом ~ 7-10 мин, подготовить инструменты, в том числе щипцов кожи и микро щипцы, ножницы и микро ножницы, шовный материал и маркером. Лечить и подготовить титана камеру, применяя два винта с гайкой на базе палаты и фиксируя самоклеящейся пены (рис. 1 переменного тока) вокруг окна коллегой палаты гарантировать герметичность системы камеры.
5. Удалить все депиляции кремом от задней промывкойэто прочь с теплой водой. Тогда сухой и дезинфицировать кожу спиртовым раствором содержащих.
6. Поместите мышь в положении лежа и определить среднюю линию спины. Возьмитесь за кожей централизованно и поднимите ее вверх, чтобы создать раза (рис. 2A). К транс-подсветкой, используя любой вид источника света, решить, где provisorily разместить титана кадр (рис. 2В). Убедитесь, что дистальные ветви латеральной грудной артерии (LTA) краниально и глубокой огибающей подвздошной артерии (ГАОПК) каудально курса через центр окна палаты (рис. 2В-D). После того, как позиционирование камеры делается, проколите оба слои кожи в самом низу складки для последующего фиксации титана кадр. Теперь удалите титана кадр, поместите курсор в положении лежа и переопределить средней линии спины, если это необходимо.
7. Опишите лоскут перпендикулярно позвоночнику, начиная с средней линии с соотношением ширины к длине 15 х 11 мм, чтобы привести в боковом направлении и случайным образом на основе перфузии лоскута. Тогда наметить дополнительную область кожи 2 мм, проходящих на противоположной стороне (рис. 2С, D). Эта область определена с пинцетом, а затем пришивается к титана кадр, не вмешиваясь в видимой области лоскута.
8. После финале маркировки, надрезать заслонку. При этом, как секут LTA и ГАОПК и поднять заслонку (фиг. 2е). Там нет необходимости для коагуляции или лигирования перерезанного сосудов.
9. Поместите винт камеры через ранее сделанные перфорации кожи (рис. 2F) и фиксировать кожной складки и спереди и сзади в кадре палаты от поднятого лоскута к задней части рамы с помощью отверстия рамы палаты и 5-0 узловыми швами (рис. 2G).
10. Шовный вертикальные конечности лоскута обратно в окружающую кожу с помощью 5-0 узловыми швами ( Рис. 2Н, I).
11. Вырезания геми-круговой области боковых кожи к небольшой полосе кожи 2 мм, то есть, с другой стороны заглушкой, чтобы наблюдать сосудистую лоскута в. Это позволяет прямой вид через окно наблюдения камеры, которая имеет поверхность 90 мм ^2.
12. Снимите желатин, как свободную рыхлой соединительной ткани с поперечно-полосатых мышц, используя микрохирургические инструменты и оптическую лупу или микроскоп, чтобы улучшить качество изображения при микроскопии. Старайтесь не повредить сосуды в мышечных слоев ткани.
13. Наконец, уплотнения камеры путем установки коллегу кадра, который ранее был наделен Самоклеющаяся полос пены вперед, краниально и кзади, покрывать росой лоскута с местного bisbenzimide и физиологического раствора (рис. 2J). После этого, нанесите смотровое окно с защитным стеклом, используя стопорное кольцо. Старайтесь не обманывать любые воздушные пузыри под стеклом (рис. 2K, L). Кожа будет придерживаться покровного стекла силами адгезии.

2. Прижизненные эпифлуоресцентной микроскопия

1. Подождите 24 ч после хирургического подготовки к первому микроскопического анализа для идеального оптического качества. Этот анализ представляет собой базовую микроскопии и повторяется в день 3, 5, 7 и 10 после операции. Каждый раз, анестезию мыши, как описано в шаге 1.2. Место животное в боковом положении Пролежневая на заказ из оргстекла перевозчика. Таким образом, слои мышечной ткани лоскута придерживаясь покровного стекла сталкиваются вверх подопечных.
2. Вводят 0,05 мл 5% зеленой флуоресценции декстрана (молекулярная масса 150000) и 0,05 мл 1% высоко флуоресцентный краситель родамин семьи в хвостовую вену или ретро-бульбарной венозного сплетения. Зеленый флуоресцентный декстран окрашивает без клеточных компонентов крови, если применяется внутривенно (IV). Флуоресцентный родамин пятна лейкоцитов и тромбоцитов, которые могут быть расстояниеinguished от других сотовых и не-клеточных компонентов. Наконец, bisbenzimide окрашивает ядерные компоненты, которые излучают более или менее флуоресценции в зависимости от состояния конденсации.
3. Впоследствии, место мышь под микроскопом. Убедитесь микроскоп включает систему LED - комбинации светодиодных луча для 470 & 425 нм, 365 и 490 нм, и 540 & 580 нм, а также соответствующие наборы фильтров (62 HE BFP / GFP / HcRed, диапазон 1: 350-390 нм длина волны возбуждения, разделить 395 нм / 402-448 нм; Диапазон 2: 460-488 нм, разделить 495 нм / 500-557 нм; Диапазон 3: 567-602 нм, разделить 610 нм / 615 нм до бесконечности 20 родамин, диапазон. : 540-552 нм, разделить 560 нм, эмиссия 575-640 нм).
4. Запишите фото и Motion-изображения с помощью прибора с зарядовой связью видеокамера и сохранять их на жестком диске компьютера для дальнейшего автономного анализа.
5. Используйте различные цели (2.5x, NA (числовая апертура) = 0,06 для панорамных камеры; 5X,NA = 0,16; 10X, NA = 0,32; 20X, NA = 0,50; 50X, NA = 0,55) для записи в регионах, представляющих интерес.
6. Практически, разделить закрылков поверхность, которая видна через окно палаты в трех областях одинаковой высоты, то есть, в проксимальных, центральной и дистальной области наиболее удаленной от сосудистой притока (рис. 3F). Для получения изображения, перейдите следующим образом в каждый момент времени наблюдения точки:
   1. Сканирование изображения тканей по изображению в окне палаты от проксимальных к дистальной использованием цель 5X.
   2. В каждой области лоскута, выберите второй или третьей порядка артериол и сопровождающих их венулы с легкостью идентифицируемых видах ветвящихся. Использование цель 5X, 10X, или 20X, сделать распечатки на arteriolovenular пучков для того, чтобы легко повторно локализовать пучки на протяжении всего периода наблюдения.
   3. С целью 20Х и объектива 50X, дальнейших запись 5-6 капиллярных полях и "апоптоза"полей в зоне закрылка соответственно. Все изображения, записанные с 10X и 20X целей использовать синий свет (люминесцентные декстран) и зеленый свет (родамин) фильтр, в то время как изображения, записанные с 5X и 50X цель использования синего света (люминесцентные декстрана) и белого света (Bisbenzimide) фильтра, соответственно ,

3. Анализ записанных данных

Примечание: с использованием системы анализа изображений с помощью компьютера количественно все записанные параметры офф-лайн следующим образом ^29.

1. Измерение площади без перфузии, соответственно некротических тканей (мм ^2).
   1. Используйте полный сканируется камерный оконный изображение, записанное с целью 5X (от 2.6.1) и флуоресцентного декстрана производить измерения перфузии соответственно некротические ткани. Используйте функцию "AreaBo" для измерения не-перфузии темную область: на границе с нон-перфузии область и вычислить площадь в мм ² с помощью алгоритмов измерения в программном обеспечении области.
2. Измерение диаметра микрососудов в артериол, капилляров и венул (мкм).
   1. Загрузите видео или картинки из записанных AV-расслоений или капиллярных полей в программном обеспечении. Для достижения наилучших результатов используйте фотоснимки или видео с наибольшим увеличением где определенные границы судна отчетливо видны.
   2. Используйте функцию "DiamPe" ПО, чтобы убедиться, измерения проводятся перпендикулярно стене сосуда. Для этого отметьте две точки на стене судна и с третьего щелчка марки перпендикулярной диаметру сосуда. Программное обеспечение будет выполнять измерение в мкм.
   3. Повторите измерения на тех же судов для всех записей в том же месте. Измерьте несколько капилляров накапливать средний диаметр.
3. Анализ эритроцитов (RBC) скорости в артериол, капилляровй венул (мм / с).
   1. Для артериол красной клетки крови (РБК) скорости (мм / с) измерения использовать функцию "VeloLSD" ПО и выбрать те же сосуды в флуоресцентного декстрана окна, для которого диаметры были измерены.
   2. Проанализируйте его с системой анализа изображений с помощью компьютера, используя метод линия сдвига, который на основе измерения сдвига (мм) индивидуального внутрисосудистого рисунком серого уровня в течение долгого времени (с).
4. Измерение объемного кровотока в сосудах (пл / сек).
   1. Рассчитать объемный кровоток (пл / сек) в артериол, венул и капилляров от РБК скорости и емкости площади поперечного сечения (π * R ²⁾ в соответствии с уравнением Гросса и Aroesty, то есть, Q = V * π * R ² , при условии, цилиндрическую форму сосуда ^30.
5. Измерение функциональной плотности капиллярного РБК-перфузии капилляров (питательная перфузии: см / см 2).
   1. Загрузите записанный флуоресцентный поле капилляров с 20-кратным объективной увеличении в программном обеспечении. Используйте функцию "DensLA" для измерения функциональной плотности капилляров в РБК-перфузии микрососудов.
   2. Проследите перфузированных капилляры с курсором и отметьте перфузированных сосуды. Не отмечайте без перфузии капилляров, артериол и венул. Программное обеспечение будет измерять функциональной плотности капилляров из перфузированных капилляров в см / см ^2. Повторите шаги для других зарегистрированных капиллярных полях.
6. Измерение извитости микрососудов (микрососудов ремоделирования), ранние признаки ангиогенеза, таких как бутон и побегообразования и новообразованных микрососудов.
   1. Нагрузка видеозаписей или кадры люминесцентных полей капиллярных в программное обеспечение. Определить извитых сосудов и использовать функцию "TorqIx" программного обеспечения. Проследите определенную поток судно с курса и заканчиваться правой кнопкой мыши. Программное обеспечение будетнарисовать прямую линию на прямой путь и посажу в связи с трассируемого пути.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за признаками ангиогенеза, таких как почки, ростки и вновь образованных капилляров, которые, как правило, исходят перпендикулярно от уже существующих капилляров. Измерения плотности этих новообразованных сосудов, как описано в шаге 3.5.
7. Идентификация характеристик для апоптоза, таких как ядерной конденсации, фрагментации и / или margination (клеток / мм ^2).
   1. Загрузите Bisbenzimide-видеозаписей (50X объективные) в программное обеспечение. Используйте функцию "DenseNA". Отметить апоптоза клеток в соответствии с указанными характеристиками, такими как ядерный конденсации, фрагментации и margination с левой кнопкой мыши.
   2. После маркировки все характерные клетки по всему видео, нажмите "N / A" в программном обеспечении, которая автоматически рассчитывать все отмеченные клетки и разделить его по всей площади. Результат будет апоптическаяклеток / мм ^2.
8. Анализ лейкоцитов приверженности сосудистого эндотелия, представляющей воспаление. Периодическое соблюдение лейкоцитов (прокат лейкоциты; соблюдение <30 сек: количество роликов / мм ² эндотелия поверхность) и твердая приверженность лейкоцитов (прилипание лейкоцитов; соблюдение> 30 сек: количество наклеек / мм ² эндотелия поверхность).
   1. Анализ воспалительную реакцию путем подсчета количества родамина помечены лейкоциты, что прилипшие к эндотелиальной выстилки после венул в течение периода времени от ≥30 сек ("наклейки") и периодически прилипших лейкоцитов (<30 сек, "ролики") , Венулярного адгези лейкоцитов выражается в виде клеток на мм ² эндотелиальной поверхности.
9. Измерение внутрисосудистых и интерстициальных уровней серого в качестве параметра для утечки микрососудов (макромолекулярный экстравазация E = E1 / E2).
   1. Оцените макромолекулярный лeakage в качестве параметра микрососудистой проницаемости после внутривенной инъекции флуоресцентного декстрана. Денситометрии определить несколько уровней серого в ткани, непосредственно прилегающей к капиллярной стенки сосуда (E1), а также в краевых бесклеточной плазмы сосуда (E2). Затем рассчитать макромолекул транссудации (E) как отношение E1 / E2 ^31.

4. Послеоперационный уход

1. Вернуться животное в отдельной клетке, чтобы избежать компанию других животных, пока полностью не восстановился. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не восстановил достаточное сознание поддерживать грудины лежачее положение. Монитор животных ежедневно в течение кровотечения, местных и системных признаков инфекции и от положения камеры.
2. Оцените общее состояние животного, наблюдая двигательную активность, вес тела, признаки боли, терпимости к заправкой и авто членовредительства.
3. Держите мышей один в клетке, чтобы избежать Мутуаль манипулирование камеры. В каких-либо признаков боли, бупренорфин применять в дозе 0,05-0,1 мг / кг массы тела, подкожно в течение 8 ч интервалами.

5. Эвтаназия и Эксплантация от кожной складки палаты

1. На 10-й день, приносить в жертву животных с помощью передозировки анестезирующего препарата (150 мг / кг фенобарбитала).
2. Снимите камеру и попробовать закрылков ткани для иммуногистохимических и молекулярных белковых анализов. Примеры тканей для обычной гистологии (формалина) и количественному белкового анализа (жидкий азот или сухой лед).

Результаты

Некроз

Основной конечной точкой этой модели - некроз тканей следующей закрылка высоте (то есть, индукция острого упорной ишемии) - повторно измерены и проиллюстрировано макроскопически, как показано на рисунке 3 в течение 10 дней. Окончательное раз?...

Обсуждение

Для того чтобы уменьшить ишемических осложнений и тем самым улучшить клинические результаты, более детальное знание патофизиологических процессов в критическом перфузии лоскута ткани требуется. Разработка новых моделей на животных, которые имитируют острый постоянную ишемию Поэто?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
C57Bl/6 mice 6-8w 20-22g	Charles River
depilation cream	Veet		any depilation cream
titanium chamber	Irola	160001	Halteblech M
slotted cheese head screw	Screws and More	842210	DIN84 M2x10
hexagon full nut	Screws and More	93422	DIN934 M2
snap ring	Schaefer-Peters	472212	DIN472 J12x1,0
cover glass	Volab		custom-made cover glass 11,8mm in diameter
fixing foam	tesamoll	05559-100	tesamoll Standard I-Profile
ketamine hydrochloride	Parke Davis		Ketavet®
dihydroxylidinothiazine hydrochloride	Bayer		Rompun®
Buprenorphin	Essex Pharma		Temgesic®
Saline 0,9%
desinfection alcohol
Vicryl 5-0	Ethicon	V 490 H
Ethilon 5-0	Ethicon	EH 7823 H
1ml syringes
surgical skin marker with flexible ruler	Purple surgical	PS3151	any surgical skin marker and flexible ruler
pointed scissors
Micro-Scissors
normal scissors
2 clamps
fine anatomic forceps
micro-forceps
hex nuter driver	wiha	1018
screwdriver	wiha	685
snap ring plier	Knipex	4411J1	12-25mm
wire cutter	Knipex	70 02 160	Wire cutter is used to cut screws short; 160mm
trans-illumination light	IKEA	501.632.02	LED light Jansjö; any light
magnification glasses
intravital microscope	Zeiss	490035-0001-000	Scope.A1.Axiotech
LED system	Zeiss	423052-9501-000	Colibri.2
LED module 365nm	Zeiss	423052-9011-000
LED module 470nm	Zeiss	423052-9052-000
LED module 540-580nm	Zeiss	423052-9121-000
Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed	Zeiss	489062-9901-000	range 1: 350-390nm excitation wavelength split 395 / 402-448nm; range 2: 460-488nm, split 495nm / 500-557nm; range 3: 567-602nm, split 610nm / 615-infinite
Filter set 20 Rhodamine	Zeiss	485020-0000-000	540-552nm, split 560, emission 575-640nm
2,5x objective NA=0,06	Zeiss	421020-9900-000	A-Plan 2,5x/0.06
5x objective NA=0,16	Zeiss	420330-9901-000	EC Plan-Neofluar 5x/0.16 M27
10x objetive NA=0,30	Zeiss	420340-9901-000	EC Plan-Neofluar 10x/0.30 M27
20x objective NA=0.50	Zeiss	420350-9900-000	EC Plan-Neofluar 20x/0.50 M27
50x objective NA=0,55	Zeiss	422472-9960-000	LD Epiplan-Neofluar 50x/0.55 DIC 27
ZEN imaging software	Zeiss		ZenPro 2012
CapImage	Dr. Zeintl
Fluorescein isothiocyanate-dextran	Sigma-Aldrich	45946
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride	Sigma-Aldrich	B2261	harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause repiratory irritat
Rhodamine 6G chloride	Invitrogen	R634	harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child
Pentobarbital	Merial		Narcoren®