Ischemica lesioni dei tessuti nel Skinfold Camera del mouse Dorsale: un modello lembo cutaneo per Indagare Ischemia acuta persistente

Riepilogo

La finestra della camera di murino plica dorsale presentato visualizza una zona di ischemia acuta persistente di un lembo muscolocutaneo. Intravitale epi-fluorescenza permette di microscopia per la valutazione diretta e ripetitiva del microcircolo e la quantificazione di emodinamica. Morfologiche e risultati emodinamici possono ulteriormente essere correlati con le analisi istologiche e molecolari.

Abstract

Nonostante la profonda esperienza e le tecniche chirurgiche avanzate, complicazioni ischemia indotta che vanno dalla rottura della ferita alla vasta necrosi dei tessuti sono ancora in corso, in particolare in chirurgia ricostruttiva lembo. Più modelli con patta sperimentali sono stati sviluppati per analizzare le cause ei meccanismi alla base e di indagare le strategie di trattamento per prevenire le complicanze ischemiche. Il fattore limitante della maggior parte dei modelli è la possibilità privo di visualizzare direttamente e ripetutamente architettura microvascolare e l'emodinamica. L'obiettivo del protocollo è stato quello di presentare un modello di topo consolidata affiliazione questi elementi mancanti prima menzionati. Harder et al. Hanno sviluppato un modello di un lembo muscolocutaneo con un pattern di perfusione casuale che subisce ischemia persistente acuta e provoca ~ 50% di necrosi dopo 10 giorni se conservato non trattato. Con l'aiuto di intravitale microscopia a fluorescenza, questo modello da camera permette la visualizzazione ripetitiva dimorfologia e l'emodinamica in diverse regioni di interesse nel corso del tempo. Processi associati, quali l'apoptosi, infiammazione, perdite microvascolare e l'angiogenesi possono essere studiati e correlati alle analisi di proteine ​​immunoistochimica e molecolare. Fino ad oggi, il modello ha dimostrato la fattibilità e la riproducibilità in diversi studi sperimentali pubblicati che indagano l'effetto di pre-, peri- e postcondizionamento del tessuto ischemically sfidato.

Introduzione

Copertura del materiale esposto tendini, osso e impianto nella chirurgia ricostruttiva si basa sull'utilizzo di lembi. Un lembo è un blocco di tessuto che viene trasferito sul suo peduncolo vascolare che garantisce l'afflusso arterioso e deflusso venoso. Nonostante competenze ampio e la disponibilità di una varietà di lembi da trasferire, complicazioni ischemia indotta vanno dalla ripartizione ferita alla perdita totale del tessuto sono ancora incontrati. Considerando che il trattamento conservativo e la guarigione per seconda intenzione si può aspettare dopo la necrosi dei tessuti minore, significativa necrosi lembo di solito richiede una revisione chirurgica, tra cui debridement, condizionata della ferita e la ricostruzione secondaria. Questo aumenta la morbilità, prolunga degenza e di conseguenza porta ad un aumento dei costi di assistenza sanitaria.

Flaps con un pattern indefinito di vasi o aree perfusi a caso nella zona distale più lontano dal flusso arterioso sono particolarmente inclini a danno ischemico. Acco rdingly, numerosi studi sperimentali e clinici hanno valutato lo sviluppo di necrosi in entrambi, lembi modello assiale (apporto di sangue definito) e lembi di pattern casuale (apporto di sangue non definita) ^1-3. I risultati principali sono comunemente basati sulla valutazione macroscopica della dimensione dell'area necrotica. Per valutare le cause ei meccanismi di necrosi tissutale più in dettaglio, numerosi studi focalizzati sull'analisi del microcircolo. Diverse tecniche sono state usate per misurare la perfusione dei tessuti, compresa l'analisi della tensione di ossigeno tissutale utilizzando elettrodi polarografiche ^4-5, nonché la misurazione del flusso sanguigno mediante laser Doppler flussimetria ^6-7, tintura diffusione ^8, e microsfere ^9-10. Queste tecniche, tuttavia, consentono solo per misurare parametri indiretti di perfusione tissutale e non consentono alcuna analisi morfologica dei processi microhemodynamic all'interno di una singola area di interesse di un lembo.

t "> Sandison si caratterizza per essere il primo che ha utilizzato una camera trasparente per prolungato in vivo, che aveva svolto in conigli ¹¹ Nel 1943 -. circa 20 anni dopo - Algire fu il primo ad adattare una camera così trasparente applicabile nei topi per studiare il comportamento di micro-impianti di cellule tumorali ^12. A causa del fatto che i topi sono i cosiddetti animali pelle libera e dopo alcuni parametri tecnici negli anni successivi, Lehr e collaboratori sono stati in grado di adattare tale dorsale camera plica sviluppare una camera di titanio più piccolo e leggero. Questa camera di abilitare valutazione mediante microscopia a fluorescenza intravitale, una tecnica che permette la visualizzazione diretta e ripetitivo di una serie di caratteristiche morfologiche e microcircolo e loro evoluzione nel tempo in diverse condizioni fisiologiche e fisiopatologiche, tale come danno da ischemia-riperfusione ^13.

Nell'inchiesta di perfusion di pelle, muscoli e ossa lembi in condizioni normali e patologiche due tendenze si è verificato: In primo luogo, i modelli a ribalta "acuti" che non utilizzano la camera plica dorsale come il padiglione auricolare peduncolato nel topo ^14, il lembo cutaneo isola basato lateralmente nel criceto ¹⁵ e il lembo composito peduncolato nel ratto ^16. In secondo luogo, il modello flap "cronica", in cui la combinazione di un lembo con una plica dorsale camera permessi microcircolo ripetitivo analisi per diversi giorni con microscopia a fluorescenza intravitale. È costituito da un lembo muscolocutaneo perfuso casuale che è integrato nella camera plica del mouse ^17. Il rapporto tra larghezza e lunghezza è stato scelto che una situazione di ischemia persistente acuta si traduce costantemente in ~ 50% necrosi del tessuto lembo 10 a 14 giorni dopo il sollevamento del lembo. Questa misura riproducibile di necrosi tissutale permette un'ulteriore valutazione di entrambi, protezione (cioè, lo sviluppo di less necrosi) e fattori negativi (ad esempio, sviluppo di più di necrosi) sulla fisiopatologia patta. Negli ultimi anni, diverse pubblicazioni sperimentali che dimostrano l'effetto di diversi pre-, peri- e le procedure post-condizionamento, compresa la somministrazione di sostanze di tessuto-protezione ^18-24 e l'applicazione locale di fattori di stress fisiologici come il calore ²⁵ e ²⁶ onde d'urto, sono emerse.

Le analisi quantitative di necrosi, microvascolare morfologia e parametri microcircolatori possono inoltre essere correlate ad analisi immunoistochimica e saggi di proteine. Diverse proteine ​​e molecole, tra cui il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), ossido nitrico sintasi (NOS), fattore nucleare kappa B (NF-kB) e le proteine ​​da shock termico (HSP-32: eme-ossigenasi 1 (HO-1) e HSP- 70) hanno dimostrato di giocare un ruolo nella protezione dei tessuti. Sulla base di questo modello lembo camera, due modifiche sono state sviluppate in order per analizzare la neovascolarizzazione e la microcircolazione della pelle durante il trapianto di guarigione ²⁷ e gli sviluppi angiogenici in un lembo peduncolato con motivo assiale perfusione ^28. Vi presentiamo un modello riproducibile e affidabile che include un lembo muscolocutaneo ischemically contestato nella camera del mouse plica. Questo modello permette la visualizzazione e la quantificazione del microcircolo e l'emodinamica da intravitale microscopia a fluorescenza.

Protocollo

NOTA: Prima di implementazione del modello presentato, le leggi di protezione degli animali corrispondente devono essere consultati e il permesso deve essere ottenuto dalle autorità locali. In questo lavoro, tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con i principi guida per la ricerca sugli animali e la normativa tedesca in materia di protezione degli animali. Gli esperimenti sono stati approvati dal comitato cura degli animali locale.

1. Preparazione degli animali e chirurgica Elevazione della Flap

1. Tenere animali in gabbie a temperatura ambiente di 22-24 ° C e ad una umidità relativa del 60-65% con un 12-hr ciclo giorno e notte. Consenti topi libero accesso all'acqua potabile e chow standard di laboratorio. Mantenere sempre condizioni di sterilità durante l'intervento chirurgico la sopravvivenza.
2. Anestetizzare il mouse intraperitoneale (ip) iniezione di 0,1 ml di soluzione salina per 10 g di peso corporeo, contenente 90 mg / kg di peso corporeo ketamina cloridrato e 25 mg /kg di peso corporeo dihydroxylidinothiazine cloridrato. L'anestesia è necessaria per la preparazione degli animali, chirurgia e successiva microscopia. Verificare che l'anestesia controllando la risposta ad uno stimolo doloroso. Durante il tempo di anestesia, si applicano veterinario pomata sugli occhi per prevenire la secchezza.
3. Dopo l'induzione dell'anestesia sufficienti, depilare la parte posteriore con un rasoio elettrico. Di seguito, applicare la crema depilazione alla zona rasata per rimuovere i capelli rimanenti.
4. Durante il tempo di permanenza della crema depilazione di ~ 7-10 minuti, preparare gli strumenti, comprese le pinze della pelle e micro pinze, forbici e micro forbici, materiale di sutura e un pennarello. Disinfettare e preparare la camera di titanio applicando le due viti con dado alla base della camera e fissando autoadesiva in schiuma (Fig. 1 AC) attorno alla finestra della controparte della camera di garantire la tenuta del sistema camerale.
5. Rimuovere tutti i crema depilazione dal retro mediante lavaggiocon acqua tiepida. Quindi asciugare e disinfettare la pelle con una soluzione contenente alcol.
6. Posizionare il mouse in posizione prona e definire la linea mediana della schiena. Afferrare la pelle a livello centrale e sollevarlo per creare una piega (Fig. 2A). Con trans-illuminazione utilizzando qualsiasi tipo di sorgente luminosa, decidere dove posizionare provisorily il telaio in titanio (Fig. 2B). Accertarsi che i rami distali dell'arteria toracica laterale (LTA) cranialmente e la profonda arteria circonflessa iliaca (DCIA) caudalmente corso attraverso il centro della finestra della camera (Fig. 2B-D). Dopo il posizionamento della camera è fatto, forare entrambi gli strati della pelle nella parte inferiore della piega per la successiva fissaggio del telaio in titanio. Ora rimuovere il telaio in titanio, posizionare il mouse in posizione prona e ridefinire la linea mediana della schiena, se necessario.
7. Outline l'aletta perpendicolarmente alla colonna vertebrale a partire dalla linea mediana con un rapporto tra larghezza e lunghezza di 15 x 11mm ad producono un lembo laterale based e perfuso in modo casuale. Poi delineare un'area cutanea ulteriore 2 mm estendono al lato controlaterale (Fig. 2C, D). Questa zona è scelto con la pinza e poi suturato al telaio in titanio senza interferire con la zona lembo visibile.
8. Dopo la marcatura finale, incidere il lembo. In tal modo, la transezione sia LTA e DCIA ed elevare il lembo (Fig. 2E). Non è necessario per la coagulazione o legatura dei vasi sezionati.
9. Posizionare la vite della camera attraverso le perforazioni della pelle fatte in precedenza (Fig. 2F) e fissare la plica sia anteriormente e posteriormente nel telaio della camera del elevati lembo alla parte posteriore del telaio utilizzando i fori del telaio della Camera e un 5-0 punti staccati (Fig. 2G).
10. Suturare gli arti verticali del lembo alla pelle circostante per mezzo di 5-0 punti staccati ( Fig. 2H, I).
11. Accise un'area emi-circolare laterale pelle per la piccola striscia di pelle di 2 mm, cioè, sull'altro lato del lembo di osservare vascolare del lembo. Questo permette visione diretta attraverso la finestra di osservazione della camera che ha una superficie di 90 mm ^​​2.
12. Rimuovere il tessuto areolare sciolto la gelatina-come dal muscolo striato con strumenti di microchirurgia e lente di ingrandimento ottico e microscopio al fine di migliorare la qualità dell'immagine durante la microscopia. Cercate di non danneggiare i vasi all'interno degli strati di tessuto muscolare.
13. Infine, sigillare la camera montando la controparte del telaio che è stato in precedenza rivestiti di strisce auto-aderente di schiuma anteriormente, posteriormente e cranialmente, irrorare il deflettore con Bisbenzimide attualità e soluzione salina (Fig. 2J). Successivamente, applicare la finestra di osservazione con un vetro di copertura con un anello elastico. Cercate di non intrappolare eventuali bolle d'aria sotto il vetro (Fig. 2K, L). La pelle si atterrà al vetro di copertura da parte delle forze di adesione.

2. intravitale epifluorescenza Microscopia

1. Attendere 24 ore dopo la preparazione chirurgica per la prima analisi microscopica per qualità ottica ideale. Questa analisi rappresenta la linea di base di microscopia e si ripete a giorno 3, 5, 7 e 10 dopo l'intervento chirurgico. Ogni volta, anestetizzare il mouse come descritto al punto 1.2. Posto l'animale in posizione decubito laterale su un supporto di plexiglas su misura. In questo modo, gli strati dei tessuti muscolari del lembo adesione al vetro di copertura si trovano ad affrontare verso l'alto.
2. Iniettare 0,05 ml di 5% di fluorescenza destrano verde (peso molecolare 150.000) e 0,05 ml di 1% molto colorante fluorescente famiglia rodamina in una vena della coda o il plesso venoso retro-bulbare. Il destrano fluorescente verde macchia i componenti non cellulari del sangue, se applicati per via endovenosa (iv). La fluorescenza Rhodamine macchie leucociti e piastrine che possono essere distinguished da altri componenti cellulari e non cellulari. Infine, Bisbenzimide macchie componenti nucleari che emettono più o meno di fluorescenza in funzione dello stato di condensa.
3. Successivamente, posizionare il mouse sotto il microscopio. Assicurarsi che il microscopio include un sistema a LED - combinazioni di fasci LED per 470 e 425 nm, 365 nm e 490, e 540 e 580 nm, nonché i corrispondenti set di filtri (62 HE BFP / GFP / HcRed, compreso tra 1: 350-390 nm di eccitazione lunghezza d'onda, diviso 395 nm / 402-448 nm; Campo 2: 460-488 nm, diviso 495 nm / 500-557 nm; Campo 3: 567-602 nm, 610 nm divisa / 615 nm a infinito 20 Rodamina, gamma. : 540-552 nm, diviso 560 nm, emissione 575-640 nm).
4. Registrare le immagini fisse e in movimento-immagini utilizzando una videocamera dispositivo ad accoppiamento di carica e salvarli su un disco rigido del computer per l'analisi ulteriore off-line.
5. Utilizzare diversi obiettivi (2.5X, NA (apertura numerica) = 0,06 per le viste panoramiche della camera, 5X,NA = 0,16; 10X, NA = 0,32; 20X, NA = 0,50; 50X, NA = 0,55) per le registrazioni delle regioni di interesse.
6. Praticamente, dividere la superficie lembo che è visibile attraverso la finestra della camera in tre aree di uguale altezza, cioè, una prossimale, centrale, e una zona distale più lontana dal flusso vascolare (Fig. 3F). Per l'acquisizione delle immagini, procedere come segue ad ogni tempo di osservazione:
   1. Acquisire l'immagine del tessuto di immagine all'interno della finestra della camera da prossimale a distale con l'obiettivo 5X.
   2. In ogni zona del lembo, selezionare arteriole secondo o terzo ordine e le loro venule di accompagnamento con i modelli di ramificazione facilmente identificabili. Utilizzando l'obiettivo 5X, 10X, 20X o, effettuare le stampe dei fasci arteriolovenular per facilmente ri-localizzare i bundle per tutto il periodo di osservazione.
   3. Con l'obiettivo 20X e l'obiettivo 50X, altri record di 5-6 campi capillari e "apoptotico"campi per area del lembo rispettivamente. Tutte le immagini registrate con il 10X e 20X obiettivi utilizzano la luce blu (destrano fluorescente) e la luce verde (rodamina) del filtro, mentre le immagini registrate con la 5X e 50X uso oggettiva luce blu (destrano fluorescente) e luce bianca (Bisbenzimide) del filtro, rispettivamente, .

3. Analisi dei dati registrati

NOTA: Con l'uso di un sistema di analisi di immagine computerizzato quantificare tutti i parametri registrati off-line come segue ^29.

1. Misurazione della superficie non perfuso, il tessuto necrotico rispettivamente (mm ^2).
   1. Utilizzare l'immagine completa della camera scansionata finestra registrata con l'obiettivo 5X (da 2.6.1) e il destrano fluorescente per misurare il tessuto non perfuso rispettivamente necrotico. Utilizzare la funzione "AreaBo" per misurare l'area non perfuso scuro: Bordo della zona non perfuso e calcolare l'area in mm ² utilizzando algoritmi di misura Area del software.
2. Misurazione del diametro microvascolare in arteriole, capillari e venule (micron).
   1. Carica video o immagini da AV-fasci o campi capillari nel software registrati. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare le immagini fisse o video con il massimo ingrandimento in cui i confini precisi del vaso sono chiaramente visibili.
   2. Utilizzare la funzione "DiamPe" del software per assicurarsi che le misurazioni vengono effettuate perpendicolarmente alla parete del vaso. Per farlo contrassegnare due punti sulla parete della nave e con il terzo contrassegno click il diametro perpendicolare della nave. Il software eseguirà la misura in micron.
   3. Ripetere le misurazioni sulle stesse navi per tutte le registrazioni nello stesso luogo. Misura più capillari di accumulare diametro medio.
3. Analisi dei globuli rossi (RBC) di velocità in arteriole, capillari unand venule (mm / sec).
   1. Per le cellule del sangue (globuli rossi) Velocità rosso arteriolare (mm / s) misurazioni utilizzare la funzione "VeloLSD" del software e scegliere lo stesso navi nella finestra destrano fluorescente per cui sono stati misurati i diametri.
   2. Analizzare con il sistema di analisi di immagine computerizzato con il metodo di spostamento, che si trova sulla base della misura dello spostamento (mm) di un individuo intravascolare Reticolo livello di grigio nel tempo (sec).
4. Misurazione del flusso volumetrico sangue nei vasi (pl / sec).
   1. Calcolare volumetrica del flusso sanguigno (pl / sec) in arteriole, venule e capillari di velocità e vaso sezione trasversale RBC (π * r ²⁾ secondo l'equazione di Gross e Aroesty, cioè, Q = V * π * r ² , assumendo una forma recipiente cilindrico ^30.
5. Misurazione del funzionale densità capillare dei capillari RBC-perfusi (perfusione nutritivo: cm / cm 2).
   1. Caricare un campo capillare fluorescente registrato con 20X di ingrandimento obiettivo nel software. Utilizzare la funzione "DensLA" su misura funzionale densità capillare dei microvasi RBC-perfusi.
   2. Tracciare i capillari perfusi con il cursore e segnare i vasi perfusi. Non contrassegnare non perfuso capillari, arteriole e venule. Il software misurerà funzionale densità capillare dei capillari perfusi in cm / cm ^2. Ripetere la procedura per gli altri campi capillari registrati.
6. Misura della tortuosità dei microvasi (rimodellamento microvascolare), i primi segni di angiogenesi, come gemma e germogliare formazione e microvasi neoformati.
   1. Carica video registrati o telai di campi capillari fluorescenti nel software. Identificare le navi piegato e utilizzare la funzione "TorqIx" del software. Tracciare il flusso vaso definitivo con il corso e terminare con un clic destro. Il software saràdisegnare una linea retta per il modo diretto e fisserà in relazione con la strada tracciata.
      NOTA: Attenzione ai segni di angiogenesi, come gemme, germogli e capillari di nuova formazione, che di solito emanano perpendicolarmente dai capillari preesistenti. Misurare la densità di questi vasi neoformati come descritto al punto 3.5.
7. Identificazione delle caratteristiche per la morte cellulare per apoptosi, come ad esempio la condensazione nucleare, frammentazione e / o emarginazione (cellule / mm ^2).
   1. Caricare video Bisbenzimide-registrati (obiettivo 50X) nel software. Utilizzare la funzione "DenseNA". Contrassegnare cellule apoptotiche secondo le caratteristiche menzionate come condensazione nucleare, frammentazione e margination con un clic sinistro.
   2. Dopo aver segnato tutte le cellule caratteristici di tutto il video, fare clic su "N / A" nel software, che conterà automaticamente tutte le cellule marcate e dividerlo in tutta l'area. Il risultato sarà apoptoticocellule / mm ^2.
8. Analisi dei leucociti adesione all'endotelio vascolare rappresenta infiammazione. Aderenza intermittente dei leucociti (leucociti rotolamento; aderenza <30 sec: numero di rulli / mm ² di superficie endoteliale) e ferma adesione dei leucociti (globuli bianchi attaccare; aderenza> 30 sec: il numero di adesivi / mm ² di superficie endoteliale).
   1. Analizzare la risposta infiammatoria contando il numero di rodamina leucociti aderenti al rivestimento endoteliale delle venule post-capillari per un periodo di tempo di ≥30 sec ("adesivi") ei leucociti intermittenza aderenti etichettati (<30 sec, "rulli") . Venulare leucociti aderenza è espressa in cellule per mm ² di superficie endoteliale.
9. Misurazione dei livelli di grigio intravascolari e interstiziali come parametro per la perdita microvascolare (macromolecolare stravaso E = E1 / E2).
   1. Valutare macromolecolare leakage come parametro di permeabilità microvascolare dopo un'iniezione endovenosa di un destrano fluorescente. Densitometricamente determinare diversi livelli di grigio nel tessuto direttamente adiacente alla parete del vaso capillare (E1), nonché nel plasma privo di cellule marginali della nave (E2). Quindi calcolare stravaso macromolecolare (E) come rapporto di E1 / E2 ^31.

4. Cura postoperatoria

1. Rispedire l'animale in una gabbia separata per evitare la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale. Monitorare gli animali ogni giorno di sanguinamento, locale e segni sistemici di infezione e la posizione della camera.
2. Valutare lo stato generale dell'animale osservando l'attività motoria, il peso corporeo, segni di dolore, la tolleranza per la medicazione e auto-mutilazioni.
3. Tenere il mouse uno per gabbia per evitare MutuAl manipolazione della camera. In qualsiasi segno di dolore, applicare Buprenorfina alla dose di 0,05-0,1 mg / kg di peso corporeo, per via sottocutanea in 8 intervalli hr.

5. L'eutanasia e Espianto della Camera Skinfold

1. Al giorno 10, sacrificare animali con una dose eccessiva di un farmaco anestetico (150 mg / kg di pentobarbital).
2. Rimuovere la camera e gustare il tessuto lembo per analisi di proteine ​​immunoistochimici e molecolari. Tessuti di esempio per l'istologia convenzionale (formalina) e saggi proteici quantificabili (azoto liquido o ghiaccio secco).

Risultati

Necrosi

L'endpoint principale di questo modello - necrosi tissutale conseguente sollevamento del lembo (cioè, l'induzione di ischemia acuta persistente) - viene ripetutamente misurata ed illustrato macroscopicamente come mostrato in Figura 3 per un periodo di 10 giorni. Delimitazione finale del lembo necrosi avviene di solito tra 5 e 7 giorni dopo l'intervento chirurgico ed è caratterizzato da una frangia rossa, cioè, la zona...

Discussione

Per ridurre le complicanze ischemiche e quindi migliorare l'esito clinico, è necessaria una conoscenza più dettagliata dei processi fisiopatologici in tessuto lembo critico perfusi. Lo sviluppo di nuovi modelli animali che imitano l'ischemia persistente acuta è quindi obbligatoria. Di conseguenza, siamo stati in grado di sviluppare un modello facilmente riproducibile e affidabile che consente per la valutazione ripetitive in tempo reale morfologica, dinamica e funzionale dei vari parametri di muscoli e vascol...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
C57Bl/6 mice 6-8w 20-22g	Charles River
depilation cream	Veet		any depilation cream
titanium chamber	Irola	160001	Halteblech M
slotted cheese head screw	Screws and More	842210	DIN84 M2x10
hexagon full nut	Screws and More	93422	DIN934 M2
snap ring	Schaefer-Peters	472212	DIN472 J12x1,0
cover glass	Volab		custom-made cover glass 11,8mm in diameter
fixing foam	tesamoll	05559-100	tesamoll Standard I-Profile
ketamine hydrochloride	Parke Davis		Ketavet®
dihydroxylidinothiazine hydrochloride	Bayer		Rompun®
Buprenorphin	Essex Pharma		Temgesic®
Saline 0,9%
desinfection alcohol
Vicryl 5-0	Ethicon	V 490 H
Ethilon 5-0	Ethicon	EH 7823 H
1ml syringes
surgical skin marker with flexible ruler	Purple surgical	PS3151	any surgical skin marker and flexible ruler
pointed scissors
Micro-Scissors
normal scissors
2 clamps
fine anatomic forceps
micro-forceps
hex nuter driver	wiha	1018
screwdriver	wiha	685
snap ring plier	Knipex	4411J1	12-25mm
wire cutter	Knipex	70 02 160	Wire cutter is used to cut screws short; 160mm
trans-illumination light	IKEA	501.632.02	LED light Jansjö; any light
magnification glasses
intravital microscope	Zeiss	490035-0001-000	Scope.A1.Axiotech
LED system	Zeiss	423052-9501-000	Colibri.2
LED module 365nm	Zeiss	423052-9011-000
LED module 470nm	Zeiss	423052-9052-000
LED module 540-580nm	Zeiss	423052-9121-000
Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed	Zeiss	489062-9901-000	range 1: 350-390nm excitation wavelength split 395 / 402-448nm; range 2: 460-488nm, split 495nm / 500-557nm; range 3: 567-602nm, split 610nm / 615-infinite
Filter set 20 Rhodamine	Zeiss	485020-0000-000	540-552nm, split 560, emission 575-640nm
2,5x objective NA=0,06	Zeiss	421020-9900-000	A-Plan 2,5x/0.06
5x objective NA=0,16	Zeiss	420330-9901-000	EC Plan-Neofluar 5x/0.16 M27
10x objetive NA=0,30	Zeiss	420340-9901-000	EC Plan-Neofluar 10x/0.30 M27
20x objective NA=0.50	Zeiss	420350-9900-000	EC Plan-Neofluar 20x/0.50 M27
50x objective NA=0,55	Zeiss	422472-9960-000	LD Epiplan-Neofluar 50x/0.55 DIC 27
ZEN imaging software	Zeiss		ZenPro 2012
CapImage	Dr. Zeintl
Fluorescein isothiocyanate-dextran	Sigma-Aldrich	45946
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride	Sigma-Aldrich	B2261	harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause repiratory irritat
Rhodamine 6G chloride	Invitrogen	R634	harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child
Pentobarbital	Merial		Narcoren®