マウスの背部皮脂商工における虚血性組織損傷：皮膚弁モデル急性永続虚血を調査する

要約

提示されたマウス背側皮下脂肪チャンバーのウィンドウには、筋皮弁の急性永続的虚血のゾーンを可視化する。微小血管系および血行動態の定量化の直接的かつ反復的な評価のための生体エピ蛍光顕微鏡許す。形態学的および血行動態の結果は、さらに組織学的および分子解析と相関させることができる。

要約

深い専門知識と高度な外科技術にもかかわらず、大規模な組織壊死に巻か内訳に至るまで、虚血誘発性の合併症はまだ特に再建フラップ手術で、発生している。複数の実験的なフラップモデルが根本的な原因およびメカニズムを分析し、虚血性合併症を予防するための治療戦略を調査するために開発されてきた。ほとんどのモデルの制限要因は、直接かつ繰り返し微小血管のアーキテクチャと血行動態を可視化する欠け可能性である。プロトコールの目的は、これらの前述の要素を欠いて提携する十分に確立されたマウスモデルを提示することであった。ハーダーらは、未処理保つ場合、10日後に50％の壊死〜急性永続的虚血および結果を受けてランダム灌流パターン筋皮弁のモデルを開発した。生体落射蛍光顕微鏡を用いて、このチャンバモデルは、反復的な可視化を可能にする時間の経過とともに関心の異なる領域における形態および血行動態。アポトーシス、炎症、微小血管漏出および血管新生などの関連プロセスを検討し、免疫組織化学、分子、タンパク質アッセイに相関させることができる。現在までに、モデルは虚血挑戦組織の前、閉経期の影響とポストコンディショニングを調査いくつかの公表の実験的研究で実現可能性と再現性を証明しています。

概要

再建手術でさらさ腱、骨とインプラント材料の被覆率は、フラップの使用に依存している。フラップは、動脈流入および静脈流出を保証し、その血管茎上で転送された組織のブロックです。幅広い知識と転送されるフラップの様々な利用可能性にもかかわらず、創傷の破壊からの全組織喪失に至る虚血誘発性の合併症がまだ遭遇している。二意思による保存的治療と治癒がマイナー組織壊死後に期待することができるが、かなりのフラップ壊死は通常デブリードマンを含め、外科的改正が必要で、エアコン、二次再建を巻か。これは、罹患率が増加し入院を延長し、その結果、増加した医療費につながる。

動脈流入から最も離れた遠位のゾーン内の血管系の未定義のパターン、またはランダムに灌流領域を有するフラップが虚血性損傷を特に受けやすい。 ACCO rdingly、多数の実験的及び臨床的研究は、軸方向のパターンフラップ（定義された血液供給）及びランダムパターンフラップ（未定義の血液供給^）1-3両方に壊死の進行を評価した。主な結果は、一般的に壊死領域のサイズの巨視的評価に基づいている。より詳細には組織壊死の原因とメカニズムを評価するために、いくつかの研究は、微小循環の分析に焦点を当てた。別の技法は、ポーラログラフ電極^4-5と同様に、レーザードップラーフローメトリ^6-7、染料拡散^8、およびミクロスフェア^9-10を使用して血流の測定を用いて組織の酸素分圧の分析を含む、組織潅流を測定するために使用されてきた。これらの技術は、しかし、唯一の組織灌流の間接的なパラメータを測定可能にし、フラップの関心のある個々の領域内microhemodynamicプロセスのいずれかの形態学的分析を可能にしない。

T ">サンディソンは、彼がウサギ¹¹で行われるin vivo試験において 、長期化のための透明容器を使用した最初の人であることが知られている1943年- 。約20年後- Algireは適用可能であることがこのような透明チャンバーを適合させることが第一号だった腫瘍細胞は¹²のマイクロインプラントの挙動を研究するために、マウスにおける。によりマウスがたるんだ皮膚動物いわゆるされ、次の数年にわたって、いくつかの技術的改良の後、レアーおよび共同研究者は、適合させることができたという事実に小型·軽量チタンチャンバーを開発して背側皮下脂肪チャンバーは、このチャンバーは、生体内蛍光顕微鏡、形態学的および微小循環機能の数と異なる生理学的および病態生理学的条件の下で時間をかけてその変化の直接的かつ反復的な可視化を可能にする技術、そのようなを用いた評価を可能に虚血再灌流障害として^13。

PEの研究では正常および病的条件下では皮膚、筋肉や骨フラップのrfusionは2つの傾向が発生しました。まず、マウス¹⁴で有茎耳フラップとして背側皮下脂肪チャンバーを使用しない「急性」フラップモデル、横方向に基づいて、島皮弁をハムスター¹⁵及びラット¹⁶における有茎複合フラップで。第二に、背側皮下脂肪チャンバー許可反復微小循環とフラップの組み合わせが生体内蛍光顕微鏡で数日にわたって分析して「慢性」フラップモデル。それは、マウス¹⁷の皮下脂肪チャンバー内に統合されて、ランダムに灌流さ筋皮弁で構成されています。その幅対長さの比は、急性持続性の虚血の状況が一貫して10〜14日フラップ上昇した後、50％フラップ組織壊死〜になるように選択した。組織壊死のこの再現性の程度は、保護（ すなわち 、開発のレ両方のさらなる評価を可能にするS壊死）と有害な因子（ すなわち、フラップ病態生理の詳細壊死の開発）。最後の年の間に、別の閉経前、および組織保護物質^18-24を投与すると、熱²⁵および衝撃波²⁶などの生理的ストレッサーのローカルアプリケーションを含む、ポストコンディショニング手順、の効果を実証するいくつかの実験の出版物、浮上している。

壊死、微小血管形態および微小循環のパラメータの定量分析は、さらに、免疫組織化学的分析およびタンパク質アッセイに相関させることができる。ヘムオキシゲナーゼ1（HO-1）及びHSP-：血管内皮増殖因子（VEGF）、一酸化窒素合成酵素（NOS）、核因子カッパB（NF-κB）および熱ショックタンパク質（HSP-32を含む種々のタンパク質および分子70）組織保護において役割を果たすことが示されている。このチャンバーフラップモデルに基づいて、2つの修正は、オードが開発されているR皮膚移植治癒²⁷と軸パターン灌流²⁸と有茎フラップにおける血管新生の開発中に新生血管形成および微小循環を分析すること。我々は、マウスの皮下脂肪チャンバー内の虚血挑戦筋皮フラップを含み、再現性と信頼性モデルを提示。このモデルは、生体エピ蛍光顕微鏡により微小循環と血行動態の可視化および定量化を可能にする。

プロトコル

注：前に提示されたモデルの実装に対応する動物保護法が参照されなければならないと許可が地元当局から取得する必要があります。本研究では、すべての実験は、動物に関わる研究や動物の保護に関するドイツの法律のための指針に準拠して実施した。実験は、地元の動物管理委員会によって承認された。

1.動物の準備とフラップの外科標高

1. 22-24℃の室温で12時間昼夜サイクルで60から65までパーセントの相対湿度での単一ケージ内の動物にしてください。飲料水と標準的な実験用飼料へのマウスの自由なアクセスを許可します。常に生存手術中に無菌状態を維持する。
2. 90 mg / kg体重塩酸ケタミンおよび25mgを/含む10グラムの体重あたり0.1ミリリットル生理食塩水の腹腔内、マウスを麻酔（ip）注射kg体重dihydroxylidinothiazine塩酸塩。麻酔動物の準備、手術とその後の顕微鏡検査のために必要である。痛みを伴う刺激に対する応答を確認することで、適切な麻酔を確認してください。麻酔の時間の間に、乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を適用します。
3. 十分な麻酔の誘導後、電気シェーバーで背中をdepilate。以下、残りの毛を除去するために剃った領域に脱毛クリームを適用します。
4. 7-10分〜の脱毛クリームの滞留時間の間、皮膚鉗子、マイクロ鉗子、はさみ、マイクロはさみ、縫合材料やマーカーペンなどの器具を準備。チャンバーの基部でナットで2本のネジを適用することにより、チャンバシステムの気密性 ​​を保証するために、チャンバの相手の窓の周りに自己粘着性発泡体（ 図1 AC）を固定することにより、チタン室を消毒し、準備します。
5. 洗浄による背面からすべての脱毛クリームを削除ぬるま湯でそれオフ。その後、乾燥したアルコール含有溶液で皮膚を消毒する。
6. 腹臥位でマウスを置き、背中の正中線を定義します。一元的に皮膚をつかみ、倍（ 図2A）を作成するためにそれを持ち上げます。光源の任意の種類を使用してトランス照明により、provisorilyチタンフレーム（ 図2B）を配置する場所を決定します。ていることを確認してください頭蓋外側胸動脈（LTA）とチャンバーの窓の中心を通る尾もちろん深い曲折腸骨動脈（DCIA）の遠位枝（ 図2B-D）。チャンバーの位置決めが完了すると、チタンフレームの後の固定のために倍の一番下の皮膚の両方の層を穿孔。さて、チタンフレームを削除しやすい位置にマウスを置き、必要に応じて、背中の正中線を再定義。
7. xは1〜15の幅と長さの比が正中線から始まる脊椎に垂直なフラップを概説1mmで横方向に基づいて、ランダムに灌流フラップになります。そして、反対側（ 図2C、D）に至る2mmの追加の皮膚領域を概説する。このエリアには、ピンセットで採取し、後で目に見えるフラップエリアに干渉することなく、チタンフレームに縫合される。
8. マーキングファイナルに続いて、フラップを切開。そうすることで、LTAとDCIAの両方を横断するとフラップ（ 図2E）を高める。離断血管の凝固または連結する必要はない。
9. 以前に行った皮膚穿孔（ 図2F）を介して、チャンバのネジを置き、チャンバーのフレームの穴を使用して、フレームの背面部に昇格フラップのチャンバーの枠内で両方の前方と後方に皮下脂肪を固定し、5-0結節縫合（ 図2G）。
10. （5-0中断縫合により周囲の皮膚に戻ってフラップの垂直手足を縫合図。 2H、I）。
11. フラップの血管を観察するために、フラップの反対側に、 すなわち 2mmの小さな皮膚片に皮膚の横の半円形領域を切り出す。これは、90 mm ^​​2の表面を有し、チャンバの観察窓を通して直視を可能にする。
12. 顕微鏡検査時の画像品質を向上させるために顕微手術器具および光学拡大鏡または顕微鏡を用いて横紋筋からのゼラチン様緩い疎性結合組織を取り除く。筋肉組織層内の血管を傷つけないようにしてみてください。
13. 最後に、局所ビスベンズイミドおよび生理食塩水（ 図2J）とフラップbedew、頭側と後方、以前に前方の泡自己接着ストリップでenduedされたフレームのカウンターパートを搭載することにより、チャンバをシール。その後、スナップリングを使用してカバーガラスで観察窓を適用する。ガラスの下に空気の水疱を捕捉しないようにしてください（ 図2K、L）。皮膚は、接着力によってカバーガラスに付着する。

2.生体内落射蛍光顕微鏡

1. 理想的な光学的品質のための最初の顕微鏡分析のための外科調製後24時間を待ちます。この分析は、顕微鏡のベースラインを表しており、手術後3日目、5,7及び10で繰り返される。ステップ1.2に記載されるようにするたびに、マウスを麻酔。カスタムメイドのプレキシグラスキャリア上の横方向の褥瘡位置に動物を配置します。そうすれば、カバーガラスに付着したフラップの筋肉組織層は、アップ病棟に直面している。
2. 尾静脈または眼球後静脈叢に5％の緑色蛍光デキストラン（分子量15万）および0.05ミリリットルの1％高蛍光ローダミンファミリーの色素の0.05ミリリットルを注入。緑色蛍光デキストランを静脈内適用した場合、血液の非細胞成分を染色する（ニ）。 distのできる蛍光ローダミン汚れ白血球と血小板他の細胞および非細胞成分からinguished。最後に、結露の状態に応じて、多かれ少なかれ、蛍光発光する核成分をビスベンズイミド染色する。
3. その後、顕微鏡下でマウスを置きます。顕微鏡は、LEDシステムを含んでいるか確認します - 470＆425 nmの、365＆490 nmの、540＆580 nmのためのLEDの光の組み合わせだけでなく、対応するフィルターセット（62 HE BFP /、GFP / HcRed、レンジ1：350から390 nmのを励起波長、395nmで/ 402から448 nmの分割、範囲2：460から488ナノメートル、495ナノメートル/ 500から557 nmの分割、範囲3：567から602 nmのは、無限の20ローダミン、範囲に610ナノメートル/ 615ナノメートルを分割：540から552 nmの、560 nmの分割、エミッション575から640 nm）を。
4. 静止画や電荷結合素子ビデオカメラを使用してモーション映像を記録し、さらにオフライン分析のためのコンピュータのハードディスク上に保存します。
5. 異なる目的（2.5X、NA（開口数）=チャンバーのパノラマビューの0.06を使用します。5Xを、NA = 0.16、 10X、NA = 0.32、 20X、NAは0.50 =;関心領域の録音のための50X、NA = 0.55）。
6. 事実上、同じ高さの3つの領域、 すなわち 、近位、中央に、チャンバの窓を通して見えるフラップ表面を分割し、最も離れた血管の流入（ 図3F）から遠位領域。画像取得のために、各観察時点で、次のように進む。
   1. 5倍対物レンズを用いて遠位近位からチャンバのウィンドウ内の画像による組織画像をスキャンします。
   2. フラップの各エリアでは、容易に識別可能な分岐パターンを持つ2次または三次細動脈とそれに付随する小静脈を選択します。 5X、10X、20Xまたは対物レンズを用いて、簡単に全体の観察期間を通してバンドルを再局在化させるために、arteriolovenularバンドルのプリントアウトを行う。
   3. 20Xの対物レンズおよび50倍の対物レンズ、さらに記録5-6キャピラリーフィールドと "アポトーシス付きそれぞれフラップの面積当たり」フィールドに入力します。 5Xおよび50X対物レンズで撮影した画像は、青色光（蛍光デキストラン）および白色光（ビスベンズイミド）フィルタを使用するのに対し、すべての10倍で撮影​​した画像と20Xの目的は、それぞれ、青色光（蛍光デキストラン）および緑色光（ローダミン）フィルタを使用する。

記録されたデータの分析3。

^NOTE：29を以下のようにコンピュータ支援画像解析システムを用いることにより、オフラインで記録されたすべてのパラメータを定量化する。

1. 非灌流、それぞれ壊死組織さ（mm ^2）の面積を測定する。
   1. （2.6.1から）5倍の対物レンズで記録された完全なスキャンしたチャンバー窓画像と非灌流し、それぞれ壊死組織を測定するための蛍光デキストランを使用してください。非灌流さの領域を境界線とmは面積を計算：非灌流さ暗い領域を測定するために、「AreaBo」機能を使用してくださいソフトウェアの面積測定アルゴリズムを使用することによりm ²で^ある 。
2. 動脈、毛細血管および細静脈（μm）とにおける微小血管径の測定。
   1. 記録されたAV-バンドルまたはソフトウェアにキャピラリーフィールドからの負荷のビデオや写真。最良の結果を得るには、容器の明確な境界線がはっきり見える最高倍率で静止画や動画を使用しています。
   2. 測定は、血管の壁に垂直に行われていることを確認するソフトウェアの「DiamPe」機能を使用してください。そうするために容器の垂直な直径、血管の壁に第三のクリックマークの付いた二つの点をマーク。ソフトウェアは、μmで測定を行います。
   3. 同じ場所ですべての録音のために同じ船での測定を繰り返します。平均直径を蓄積するために、複数のキャピラリを測定します。
3. 動脈内の赤血球（RBC）の速度の分析は、毛細管ND細静脈（MM /秒）。
   1. 細動脈の赤血球（RBC）速度（MM / s）のための測定は、ソフトウェアの「VeloLSD」機能を使用し、直径が測定されたために、蛍光デキストランウィンドウ内の同じ血管を選択します。
   2. 時間（秒）を超える個々の血管の階調パターンのシフト量（mm）での測定に基づいているラインシフト法を用いて、コンピュータ支援画像分析システムを用いてそれを分析する。
4. 血管内容積の血流（PL /秒）の測定。
   1. RBC速度および血管断面積の細動脈、細静脈及び毛細血管内容積の血流（PL / sec）を算出する（π* R ^2）総とAroesty、すなわち、Qは= V *π* rは²の式に従って、円筒容器形状^30を仮定。
5. RBC灌流毛細血管の機能毛細血管密度の測定（栄養灌流：CM / cmの 2）。
   1. ソフトウェアに20X対物倍率で記録した蛍光キャピラリーフィールドをロードします。 RBC灌流微小血管の機能的な毛細血管密度を測定するために、「DensLA」機能を使用してください。
   2. カーソルで灌流し毛細血管をトレースし、灌流し、血管をマーク。マークしない毛細血管、細動脈や細静脈を非灌流した。ソフトウェアは、センチメートル/ cm ²単位灌流毛細血管の機能的毛細血管密度を測定する。他の記録された毛細血管のフィールドの手順を繰り返します。
6. 微小血管（微小血管リモデリング）、そのようなつぼみや新芽-形成と新たに形成された微小血管などの血管新生の初期徴候のくねりの測定。
   1. 負荷はソフトウェアにビデオや蛍光キャピラリーフィールドのフレームを記録した。 gyrose血管を特定し、ソフトウェアの「TorqIx」関数を使用します。コー​​ス明確な血管の流れをトレースし、右クリックで終了。ソフトウェアの意志直接的な方法のために直線を引くと、トレースされたパスに関連して、それを設定します。
      注：通常、既存の毛細血管から垂直に発するような芽、もやしと新たに形成された毛細血管のような血管新生の兆候、気を付けろ。ステップ3.5で説明したように、これらの新しく形成された血管の密度を測定します。
7. このような核凝縮、断片化および/ ​​または辺縁（細胞/ mm ^2）のようなアポトーシス細胞死のための特性の同定。
   1. ソフトウェアにビスベンズイミド-録画したビデオ（50Xの対物レンズ）をロード。 「DenseNA」機能を使用してください。そのような左クリックで核凝縮、断片化および辺縁などのような特性に応じてアポトーシスを起こした細胞をマーク。
   2. 映像全体のすべての特徴的な細胞をマークした後、自動的にすべてのマークされたセルをカウントし、エリア全体にそれを分割するソフトウェアに「N / A」をクリックします。結果は、アポトーシスになります細胞/ mm ^2。
8. 炎症を表す血管内皮への白血球の付着の分析。白血球の断続的な密着性（白血球ローリング、密着性<30秒：ローラの数/ mm ²の内皮表面）と、白血球の堅固な付着力（白血球付着、密着性> 30秒：ステッカー/ mm ²の内皮表面の数）。
   1. ローダミンの数をカウントすることによって炎症反応を分析≥30秒（「シール」）を断続的に付着した白血球（<30秒、「ローラー」）の期間の後毛細血管細静脈の内皮層に付着した白血球を標識し。細静脈白血球付着はmm ²内皮表面あたりの細胞として表される。
9. 微小血管の漏れ（高分子溢出E = E1 / E2）のためのパラメータとして血管内および間のグレーレベルの測定。
   1. 高分子リットルを評価蛍光デキストランの静脈注射後の微小血管透過性のパラメータとしてeakage。デンシトメトリー直接毛細血管壁（E1）に隣接して、ならびに容器（E2）の縁無細胞血漿中の組織に複数のグレーレベルを決定する。次に、E1 / E2 ³¹の比として高分子溢出（E）を計算する。

4.術後ケア

1. 完全に回復するまで、他の動物の会社を避けるために、別々のケージに動物を返します。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまでは無人の動物を放置しないでください。出血、地元や感染の全身徴候とチャンバーの位置のために毎日動物を監視します。
2. 運動活動、体重、苦痛の徴候、ドレッシングおよび自動切断に対する耐性を観察することによって、動物の一般的な状態を評価する。
3. ムトゥを避けるために、マウスをケージ当たり1を保つチャンバーのアル操作。痛みの兆候では、8時間の間隔で皮下に、0.05〜0.1 mg / kg体重の用量でブプレノルフィンを適用します。

5.安楽死や皮脂所の植

1. 10日目に、麻酔薬（150 mg / kgをペントバルビタール）の過剰摂取を使って動物を生け贄に捧げる。
2. チャンバーを取り外し、免疫組織化学、分子、タンパク質アッセイのためのフラップ組織をサンプリングする。従来の組織学（ホルマリン）、および定量化可能なタンパク質アッセイ（液体窒素やドライアイス）のサンプル組織。

結果

壊死

このモデルの主なエンドポイント-組織壊死次フラップ上昇（ すなわち、急性永続的虚血の誘導） -繰り返し測定され、10日間にわたって、図3に示すように、巨視的に示さ。フラップ壊死の最終的な境界は、通常、手術後5日目と7との間に発生し、 図3D-F（近位バイタルとフラップの遠位壊死ゾーンの間に発生する、血管?...

ディスカッション

虚血性合併症を減少させ、それによって臨床結果を改善するために、決定的に灌流フラップ組織における病態生理学的プロセスのより詳細な知識が必要である。急性持続性の虚血を模倣する新規の動物モデルの開発が必須である。したがって、我々は、サンプリングされたフラップ組織の免疫組織化学的および分子解析と相関させることができる筋肉と皮膚血管系の種々のパラメータを繰り?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
C57Bl/6 mice 6-8w 20-22g	Charles River
depilation cream	Veet		any depilation cream
titanium chamber	Irola	160001	Halteblech M
slotted cheese head screw	Screws and More	842210	DIN84 M2x10
hexagon full nut	Screws and More	93422	DIN934 M2
snap ring	Schaefer-Peters	472212	DIN472 J12x1,0
cover glass	Volab		custom-made cover glass 11,8mm in diameter
fixing foam	tesamoll	05559-100	tesamoll Standard I-Profile
ketamine hydrochloride	Parke Davis		Ketavet®
dihydroxylidinothiazine hydrochloride	Bayer		Rompun®
Buprenorphin	Essex Pharma		Temgesic®
Saline 0,9%
desinfection alcohol
Vicryl 5-0	Ethicon	V 490 H
Ethilon 5-0	Ethicon	EH 7823 H
1ml syringes
surgical skin marker with flexible ruler	Purple surgical	PS3151	any surgical skin marker and flexible ruler
pointed scissors
Micro-Scissors
normal scissors
2 clamps
fine anatomic forceps
micro-forceps
hex nuter driver	wiha	1018
screwdriver	wiha	685
snap ring plier	Knipex	4411J1	12-25mm
wire cutter	Knipex	70 02 160	Wire cutter is used to cut screws short; 160mm
trans-illumination light	IKEA	501.632.02	LED light Jansjö; any light
magnification glasses
intravital microscope	Zeiss	490035-0001-000	Scope.A1.Axiotech
LED system	Zeiss	423052-9501-000	Colibri.2
LED module 365nm	Zeiss	423052-9011-000
LED module 470nm	Zeiss	423052-9052-000
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Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed	Zeiss	489062-9901-000	range 1: 350-390nm excitation wavelength split 395 / 402-448nm; range 2: 460-488nm, split 495nm / 500-557nm; range 3: 567-602nm, split 610nm / 615-infinite
Filter set 20 Rhodamine	Zeiss	485020-0000-000	540-552nm, split 560, emission 575-640nm
2,5x objective NA=0,06	Zeiss	421020-9900-000	A-Plan 2,5x/0.06
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10x objetive NA=0,30	Zeiss	420340-9901-000	EC Plan-Neofluar 10x/0.30 M27
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50x objective NA=0,55	Zeiss	422472-9960-000	LD Epiplan-Neofluar 50x/0.55 DIC 27
ZEN imaging software	Zeiss		ZenPro 2012
CapImage	Dr. Zeintl
Fluorescein isothiocyanate-dextran	Sigma-Aldrich	45946
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride	Sigma-Aldrich	B2261	harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause repiratory irritat
Rhodamine 6G chloride	Invitrogen	R634	harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child
Pentobarbital	Merial		Narcoren®