Lésion tissulaire ischémique dans le pli de la Chambre Souris Dorsale: Un lambeau de peau modèle pour étudier l'ischémie aiguë et persistante

Résumé

La fenêtre de la chambre du pli cutané dorsal murin présenté visualise une zone d'ischémie aiguë et persistante d'un lambeau musculo. Intravitales épi-fluorescence permet de microscopie pour l'évaluation directe et répétitive de la microvascularisation et la quantification de l'hémodynamique. Morphologique et résultats hémodynamiques peuvent en outre être en corrélation avec des analyses histologiques et moléculaires.

Résumé

Malgré expertise profonde et techniques chirurgicales de pointe, les complications induites par ischémie allant de rupture de la plaie à une nécrose des tissus se produisent encore, notamment en chirurgie reconstructive de rabat. Modèles de volets expérimentaux multiples ont été développés pour analyser les causes et les mécanismes sous-jacents et d'étudier les stratégies de traitement pour prévenir les complications ischémiques. Le facteur limitant de la plupart des modèles est la possibilité manque de visualiser directement et de façon répétitive l'architecture microvasculaire et hémodynamique. L'objectif du protocole est de présenter un modèle de souris bien établie affilier ces éléments qui manquent avant mentionnés. Plus difficile et al. Ont mis au point un modèle de lambeau musculo avec un motif de perfusion aléatoire qui subit une ischémie aiguë et persistante et résultats dans ~ 50% de nécrose après 10 jours si elle est conservée non traitée. A l'aide de la microscopie intravitale épi-fluorescence, ce modèle permet la visualisation de la chambre répétitive demorphologie et l'hémodynamique dans différentes régions d'intérêt au fil du temps. Traitements associés tels que l'apoptose, l'inflammation, l'angiogenèse et microvasculaire fuite peuvent être étudiés et corrélés à des dosages de protéines immunohistochimiques et moléculaires. À ce jour, le modèle a prouvé la faisabilité et la reproductibilité dans plusieurs études expérimentales publiées étudier l'effet de pré-, péri- et post-conditionnement de tissu ischémie contestée.

Introduction

Couverture de exposé tendon, de l'os et l'implant en chirurgie reconstructive matériau repose sur l'utilisation de volets. Un clapet est un bloc de tissu qui est transférée sur son pédicule vasculaire qui garantit afflux artériel et le débit sortant veineux. Malgré une vaste expertise et la disponibilité d'une variété de volets à être transférés, les complications induites par ischémie allant de rupture de la plaie à la perte totale du tissu sont encore rencontrés. Tandis que le traitement conservateur et la guérison par seconde intention sont à craindre après une nécrose des tissus mineure, significative nécrose du lambeau nécessite généralement une reprise chirurgicale, y compris le débridement, le conditionnement des plaies et de la reconstruction secondaire. Cela augmente la morbidité, prolonge l'hospitalisation, et par conséquent conduit à une augmentation des coûts de soins de santé.

Volets avec un modèle indéfini de la vascularisation ou zones perfusés de façon aléatoire dans la zone distale la plus éloignée de l'entrée artérielle sont particulièrement sujettes à des lésions ischémiques. Acco rdingly, de nombreuses études expérimentales et cliniques ont évalué le développement d'une nécrose à la fois, les volets de modèle axial (d'approvisionnement en sang défini) et les volets de façon aléatoire (d'approvisionnement en sang non définie) ^1-3. Les principaux résultats sont généralement basées sur l'évaluation macroscopique de la taille de la zone nécrotique. Afin d'évaluer les causes et les mécanismes de la nécrose des tissus plus en détail, plusieurs études ont porté sur l'analyse de la microcirculation. Différentes techniques ont été utilisées pour mesurer la perfusion tissulaire, y compris l'analyse de la tension d'oxygène des tissus en utilisant des électrodes polarographiques ^4-5, ainsi que la mesure du flux sanguin en utilisant débitmétrie laser Doppler ^6-7, colorant diffusion ^{8, 9 à 10} et des microsphères. Ces techniques, cependant, ne permettent de mesurer des paramètres indirects de la perfusion tissulaire et ne permettent pas une analyse morphologique des procédés microhemodynamic intérieur d'une zone d'intérêt particulier d'un volet.

t "> Sandison est connu pour être le premier qui a utilisé une chambre transparente pour prolonger les études in vivo, qu'il accomplit chez les lapins ¹¹ En 1943 -. environ 20 ans plus tard - Algire fut le premier à adapter une telle chambre transparent pour être applicable chez la souris afin d'étudier le comportement des micro-implants de cellules tumorales ^12. En raison du fait que les souris sont les animaux dits de peau lâche et après quelques améliorations techniques au cours des années suivantes, Lehr et collègues ont pu adapter cette une chambre de pli cutané dorsal développement d'une chambre de titane plus petit et plus léger. Cette chambre permet l'évaluation en utilisant la microscopie à fluorescence intravitale, une technique qui permet la visualisation directe et répétitive d'un certain nombre d'morphologiques et microcirculatoires caractéristiques et leur évolution dans le temps dans différentes conditions physiologiques et pathophysiologiques, tels que l'ischémie-reperfusion ^13.

Dans l'enquête de perfusion de la peau, des muscles et des os volets dans des conditions normales et pathologiques deux tendances se sont produits: d'abord, les modèles «aiguë» des volets qui ne utilisent pas la chambre dorsale du pli cutané comme le pavillon de l'oreille pédiculé chez la souris ^14, le lambeau de peau de l'île sur la base latéralement chez le hamster ¹⁵ et le volet composite pédiculé chez le rat ^16. Deuxièmement, le modèle «chronique» de rabat où la combinaison d'un rabat avec une microcirculation répétitif dorsale plis cutanés chambre des permis des analyses sur plusieurs jours avec la microscopie à fluorescence intravitale. Il se compose d'un lambeau musculo perfusé de manière aléatoire, qui est intégré dans la chambre de pli ¹⁷ de la souris. Son rapport largeur-longueur a été choisie d'une situation d'ischémie aiguë et persistante des résultats toujours dans ~ 50% de nécrose des tissus de rabat 10 à 14 jours après rabat élévation. Cette mesure reproductible de nécrose tissulaire permet une évaluation plus poussée des deux, de protection (c.-à-développement de less nécrose) et des facteurs néfastes (par exemple, le développement de plus de nécrose) sur la physiopathologie rabat. Au cours des dernières années, plusieurs publications expérimentales démontrant l'effet de pré différent, péri- et post-conditionnement des procédures, y compris l'administration de substances de tissus de protection ^18-24 et l'application locale de facteurs de stress physiologiques tels que la chaleur et des ondes de choc ^{25 26,} ont vu le jour.

Les analyses quantitatives de nécrose, microvasculaire morphologie et paramètres microcirculatoires peuvent en outre être corrélés à des analyses immunohistochimiques et des dosages de protéines. Différentes protéines et des molécules dont le facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF), oxyde nitrique synthases (NOS), le facteur nucléaire kappa B (NF-kB) et les protéines de choc thermique (HSP-32: l'hème-oxygénase 1 (HO-1) et HSP- 70) se sont avérés jouer un rôle dans la protection des tissus. Sur la base de ce modèle, la chambre de clapet, deux modifications ont été développés in order à analyser la néovascularisation et la microcirculation pendant une greffe de peau guérison ²⁷ et développements angiogéniques dans un lambeau pédiculé avec motif axial perfusion ^28. Nous présentons un modèle reproductible et fiable qui comprend un lambeau musculo-ischémie contesté dans la chambre du pli cutané de la souris. Ce modèle permet la visualisation et la quantification de la microcirculation et l'hémodynamique par microscopie intravitale épi-fluorescence.

Protocole

NOTE: Avant la mise en œuvre du modèle présenté, les lois de protection des animaux correspondant doivent être consultés et doit être autorisée par les autorités locales. Dans ce travail, toutes les expériences ont été réalisées en conformité avec les principes directeurs pour les animaux de recherche impliquant et la législation allemande sur la protection des animaux. Les expériences ont été approuvés par le comité de protection des animaux.

1. Préparation des animaux et élévation chirurgicale de la poitrine

1. Gardez les animaux dans des cages individuelles à la température ambiante de 22-24 ° C et à une humidité relative de 60-65% avec un cycle jour et nuit de 12 heures. Autoriser souris libre accès à l'eau potable et nourriture de laboratoire standard. Toujours maintenir des conditions stériles pendant la chirurgie de survie.
2. Anesthésier les souris par voie intrapéritonéale (ip) par injection de 0,1 ml de solution saline pour 10 g de poids corporel contenant 90 mg de chlorhydrate kg de poids corporel / de la kétamine et 25 mg /kg de chlorhydrate pc dihydroxylidinothiazine. L'anesthésie est nécessaire pour la préparation des animaux, la chirurgie et la microscopie ultérieure. Confirmez anesthésie appropriée en cochant la réponse à un stimulus douloureux. Pendant le temps de l'anesthésie, appliquer la pommade sur les yeux vétérinaire pour prévenir la sécheresse.
3. Après l'induction de l'anesthésie suffisante, épiler le dos avec un rasoir électrique. Ci-après, appliquez une crème d'épilation à la zone rasée pour enlever les poils restant.
4. Pendant le temps de résidence de la crème d'épilation de ~ 7-10 min, préparer les instruments, y compris les pinces de la peau et pince micro, des ciseaux et ciseaux micro, matériel de suture et un marqueur. Désinfecter et préparer la chambre de titane en appliquant les deux vis avec l'écrou à la base de la chambre et en fixant mousse auto-adhésif (Fig. 1 AC) autour de la fenêtre de son homologue de la chambre à garantir l'étanchéité du système de chambre.
5. Retirez toutes les crèmes épilation du dos par lavagele tout avec de l'eau tiède. Puis sécher et désinfecter la peau avec une solution contenant de l'alcool.
6. Placer la souris en position couchée et définir la ligne médiane du dos. Saisissez la peau au centre et soulevez-le pour créer un pli (Fig. 2A). Par trans-illumination en utilisant tout type de source de lumière, décider où placer de manière provisoire le cadre de titane (Fig. 2B). Assurez-vous que les branches distales de l'artère thoracique latérale (LTA) céphalique et l'artère circonflexe iliaque profonde (DCIA) caudale cours à travers le centre de la fenêtre de la chambre (Fig. 2B-D). Une fois que le positionnement de la chambre est terminée, les deux couches de perforer la peau au niveau du fond de la pliure pour la fixation ultérieure de la trame de titane. Maintenant, retirez le cadre en titane, placez la souris en position couchée et redéfinir la ligne médiane du dos si nécessaire.
7. Exposer brièvement le volet perpendiculairement à la colonne vertébrale à partir de la ligne médiane, avec un rapport largeur-longueur de 15 x 11 mm pour conduire à un rabat latéralement base et perfusé au hasard. Puis définir une zone de peau supplémentaire de 2 mm étendant au côté opposé (Fig. 2C, D). Cette zone est captée par la pince, puis suturé au cadre de titane, sans interférer avec la zone de rabat visible.
8. Après la notation finale, inciser le rabat. Ce faisant, les sectionner à la fois la LTA et DCIA et élever le volet (Fig. 2E). Il n'y a pas besoin pour la coagulation ou la ligature des vaisseaux sectionnés.
9. Placez la vis de la chambre à travers les perforations de la peau faites précédemment (Fig. 2F) et fixer le pli cutané à la fois avant et en arrière dans le cadre de la chambre du volet élevée à la partie arrière du cadre en utilisant les trous du châssis de la chambre et un 5-0 points séparés (fig. 2G).
10. Suturer les branches verticales du volet arrière de la peau environnante au moyen de 5-0 points séparés ( Fig. 2H, I).
11. Exciser une zone semi-circulaire de la peau latérale de la petite bande de peau de 2 mm, soit de l'autre côté de la patte d'observer le système vasculaire du rabat. Ceci permet une vue directe à travers la fenêtre d'observation de la chambre qui a une surface de 90 mm ^​​2.
12. Retirez le tissu cellulaire lâche gélatineuse du muscle strié en utilisant des instruments de microchirurgie et loupe optique ou microscope afin d'améliorer la qualité de l'image lors de la microscopie. Essayez de ne pas endommager les vaisseaux dans les couches de tissus musculaires.
13. Enfin, étanchéité de la chambre par le montage de la contrepartie de la trame qui a déjà été revêtus de bandes auto-adhésives de mousse en avant, en arrière et crânienne, bedew le rabat avec bisbenzimide actualité et une solution saline (Fig. 2J). Par la suite, appliquer la fenêtre d'observation avec un couvercle en verre à l'aide d'un anneau élastique. Essayez de ne pas prendre au piège des cloques d'air sous le verre (Fig. 2K, L). La peau va adhérer au verre de couverture par les forces d'adhérence.

2. Intravitale épifluorescence Microscopie

1. Attendez 24 heures après la préparation chirurgicale pour la première analyse microscopique de la qualité optique idéal. Cette analyse représente la ligne de base de la microscopie et est répétée au jour 3, 5, 7 et 10 après la chirurgie. Chaque fois, anesthésier la souris comme décrit dans l'étape 1.2. Placer l'animal dans une position de décubitus latéral sur un support en plexiglas sur mesure. De cette façon, les couches de tissus musculaires du volet adhérant à la vitre de couverture sont vers le haut-quartiers.
2. Injecter 0,05 ml de 5% de la fluorescence verte de dextrane (poids moléculaire 150 000) et 0,05 ml de 1% de colorant fluorescent fortement de la famille de la rhodamine dans une veine de la queue ou le plexus veineux rétro-bulbaire. Le dextran fluorescent vert colore les composants non cellulaires du sang si elle est appliquée par voie intraveineuse (iv). La fluorescence de la rhodamine taches leucocytes et des plaquettes qui peuvent être distinguished des autres composants cellulaires et non cellulaires. Enfin, bisbenzimide colore composants nucléaires qui émettent plus ou moins de fluorescence en fonction de l'état de condensation.
3. Par la suite, placer la souris sous le microscope. Vérifiez que le microscope comprend un système LED - combinaisons de feux à LED pour 470 et 425 nm, 365 nm et 490, et 540 et 580 nm, ainsi que les jeux de filtres correspondants (62 HE BFP / GFP / HcRed, entre 1: 350 à 390 nm d'onde d'excitation, divisée 395 nm / 402-448 nm; intervalle de 2: 460-488 nm, 495 nm divisée / 500-557 nm; intervalle de 3: 567-602 nm, 610 nm divisée / 615 nm à l'infini 20 rhodamine, gamme. : 540-552 nm, 560 nm divisée, l'émission de 575 à 640 nm).
4. Enregistrez les images fixes et animées-photos à l'aide d'un système caméra vidéo à couplage de charge et de les enregistrer sur un disque dur d'ordinateur pour l'analyse plus loin en ligne.
5. Utilisez des objectifs différents (2.5X, NA (ouverture numérique) = 0,06 pour les vues panoramiques de la chambre; 5X,NA = 0,16; 10X, NA = 0,32; 20X, NA = 0,50; 50X, NA = 0,55) pour les enregistrements de régions d'intérêt.
6. Pratiquement, il faut diviser la surface de rabat qui est visible à travers la fenêtre de la chambre en trois zones d'égale hauteur, à savoir, une extrémité proximale, une centrale et une zone distale la plus éloignée de l'entrée vasculaire (Fig. 3F). Pour l'acquisition de l'image, procédez de la manière suivante à chaque point de temps d'observation:
   1. Numériser l'image des tissus par l'image dans la fenêtre de la chambre de proximal en distal en utilisant l'objectif 5X.
   2. Dans chaque région du volet, sélectionnez artérioles de deuxième ou de troisième ordre et leurs veinules d'accompagnement avec des motifs de branchement facilement identifiables. Utilisation de l'objectif 5X, 10X, 20X ou, faire des impressions des faisceaux de arteriolovenular afin de facilement relocaliser les faisceaux tout au long de la période d'observation.
   3. Avec l'objectif 20X et l'objectif 50X, d'autres dossier 5-6 champs capillaires et "apoptotique"champs par zone du volet respectivement. Toutes les images enregistrées avec le 10X et 20X objectifs utilisent la lumière bleue (dextran fluorescent) et feu vert (rhodamine) filtre, alors que les images enregistrées avec la 5X et 50X utilisation objectif lumière bleue (dextran fluorescent) et la lumière blanche (bisbenzimide) filtre, respectivement .

3. Analyse des données enregistrées

NOTE: Avec l'utilisation d'un système d'analyse d'image assistée par ordinateur quantifier tous les paramètres enregistrés hors ligne comme suit ^29.

1. Mesure de la zone de non-perfusion, du tissu nécrotique respectivement (mm ^2).
   1. Utilisez l'image complète de la chambre numérisée de fenêtre enregistrée avec l'objectif 5X (de 2.6.1) et le dextran fluorescent pour mesurer tissu non-perfusé respectivement nécrotique. Utilisez la fonction "AreaBo" pour mesurer la surface non-perfusé sombre: border la zone non-perfusé et calculer la surface en mm ² en utilisant Espace des algorithmes de mesure du logiciel.
2. La mesure du diamètre microvasculaire dans les artérioles, capillaires et veinules (um).
   1. Vidéo ou de chargement des images à partir de l'AV-faisceaux enregistrées ou les champs de capillaires dans le logiciel. Pour de meilleurs résultats, utilisez les images fixes ou des vidéos avec le plus fort grossissement où les frontières définitives de la cuve sont clairement visibles.
   2. Utilisez la fonction "DiamPe" du logiciel pour vous assurer que les mesures sont effectuées perpendiculairement à la paroi de la cuve. Pour ne marquent donc deux points sur le mur de la cuve et avec le troisième clic marque le diamètre perpendiculaire du navire. Le logiciel effectue la mesure en microns.
   3. Répéter les mesures sur les mêmes bateaux pour tous les enregistrements au même endroit. Mesurer capillaires multiples pour accumuler diamètre moyen.
3. Analyse des globules rouges du sang (RBC) vitesse dans les artérioles, capillaires unee veinules (mm / sec).
   1. Pour des artérioles de globules rouges (RBC) vitesse (mm / s) mesures utilisent la fonction "VeloLSD" du logiciel et choisir les mêmes navires dans la fenêtre dextran fluorescent dont les diamètres ont été mesurés.
   2. Analyser avec le système d'analyse d'image assistée par ordinateur à l'aide du procédé de changement de vitesse de la ligne, qui se trouve sur la base de la mesure de la vitesse (mm) d'un motif élémentaire de niveau de gris intravasculaire au cours du temps (sec).
4. Mesure de débit de sang dans les vaisseaux volumétrique (pl / s).
   1. Calculer le débit volumétrique du sang (pl / sec) dans artérioles, veinules et les capillaires de RBC vitesse et récipient zone de section transversale (π * r ²⁾ conformément à l'équation de Gross et Aroesty, soit Q = V * π * r ² , en supposant une forme de cuve cylindrique ^30.
5. Mesure de la densité capillaire fonctionnelle des capillaires RBC perfusés (perfusion nutritive: cm / cm 2).
   1. Chargez un domaine capillaire fluorescent enregistré avec objectif 20X dans le logiciel. Utilisez la fonction "DensLA" pour mesurer la densité capillaire fonctionnelle des microvaisseaux RBC perfusés.
   2. Tracer les capillaires perfusés avec le curseur et marquer les vaisseaux perfusés. Ne pas marquer non-perfusé capillaires, artérioles ou veinules. Le logiciel va mesurer la densité capillaire fonctionnelle des capillaires perfusés en cm / cm ^2. Répétez les étapes pour les autres champs capillaires enregistrées.
6. Mesure de la tortuosité des microvaisseaux (microvasculaire rénovation), les premiers signes de l'angiogenèse, comme Bud et pousse-formation et microvaisseaux nouvellement formés.
   1. Charge de vidéos ou de cadres de champs capillaires fluorescents dans le logiciel. Identifier les navires Gyrose et utiliser la fonction "TorqIx" du logiciel. Suivre le flux des vaisseaux définitive avec le cours et se terminer par un clic droit. Le logiciel seratracer une ligne droite pour la voie directe et le mettra en relation avec la voie tracée.
      NOTE: Attention aux signes de l'angiogenèse tels que les bourgeons, les pousses et les capillaires nouvellement formés, qui émanent généralement perpendiculairement à partir des capillaires préexistants. Mesurer la densité de ces vaisseaux nouvellement formés de la manière décrite dans l'étape 3.5.
7. L'identification des caractéristiques de la mort cellulaire par apoptose, tels que la condensation nucléaire, la fragmentation et / ou margination (cellules / mm ^2).
   1. Chargez les vidéos bisbenzimide-enregistrées (objectif 50x) dans le logiciel. Utilisez la fonction "DenseNA". Marquer les cellules apoptotiques selon les caractéristiques mentionnées comme la condensation nucléaire, la fragmentation et la marginalisation d'un clic gauche.
   2. Après avoir marqué toutes les cellules caractéristiques tout au long de la vidéo, cliquez sur "N / A" dans le logiciel, qui comptera automatiquement toutes les cellules marquées et diviser toute la région. Le résultat sera apoptotiquecellules / mm ^2.
8. Analyse de l'adhérence des leucocytes à l'endothélium vasculaire représentant inflammation. Adhérence des leucocytes intermittent (laminage leucocytes; adhésion <30 sec: nombre de rouleaux / mm ² de surface endothéliale) et l'adhésion ferme des leucocytes (coller leucocytes; adhésion> 30 sec: nombre d'autocollants / mm ² de surface endothéliale).
   1. Analyser la réponse inflammatoire en comptant le nombre de Rhodamine leucocytes qui ont adhéré à la paroi endothéliale des veinules post-capillaires, pour une période de temps de ≥30 sec ("stickers") et les leucocytes adhèrent de façon intermittente étiquetés (<30 sec, «rouleaux») . Veinulaire adhérence des leucocytes est exprimée en cellules par mm ² de surface de l'endothélium.
9. Mesure des niveaux de gris intravasculaires et interstitiels comme un paramètre pour une fuite microvasculaire (extravasation macromoléculaire E = E1 / E2).
   1. Évaluer l macromoléculaireeakage en tant que paramètre de la perméabilité microvasculaire après une injection intraveineuse d'un dextrane fluorescent. Densitométrie déterminer plusieurs niveaux de gris dans le tissu directement adjacent à la paroi du vaisseau capillaire (E1), ainsi que dans le plasma acellulaire marginale de la cuve (E2). Puis calculer extravasation macromoléculaire (E) comme le rapport de E1 / E2 ^31.

4. Soins postopératoires

1. Retour de l'animal dans une cage séparée pour éviter la compagnie des autres animaux jusqu'à guérison complète. Ne pas laisser un animal sans surveillance tant qu'il a repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal. De surveiller les animaux tous les jours de saignement, locale et des signes systémiques d'infection et de la position de la chambre.
2. Évaluer l'état général de l'animal par l'observation de l'activité motrice, le poids corporel, les signes de la douleur, de la tolérance à la vinaigrette et auto-mutilation.
3. Gardez la souris un par cage pour éviter mutual manipulation de la chambre. Au moindre signe de douleur, appliquer la buprénorphine à une dose de 0,05-0,1 mg / kg de poids corporel, voie sous-cutanée dans des intervalles de 8 h.

5. L'euthanasie et explantation de la Chambre des plis cutanés

1. Au jour 10, sacrifier des animaux en utilisant une surdose d'un anesthésique (150 mg / kg pentobarbital).
2. Retirer la chambre et un prélèvement de tissu à rabat pour les dosages de protéines immunohistochimiques et moléculaires. Exemples tissus pour l'histologie conventionnelle (formol) et des dosages de protéines quantifiables (azote liquide ou neige carbonique).

Résultats

Nécrose

Le critère d'évaluation principal de ce modèle - élévation de nécrose du lambeau de tissu suivant (ie, l'induction de l'ischémie aiguë et persistante) - est à plusieurs reprises mesurée et illustré macroscopique comme le montre la figure 3, sur une période de 10 jours. Délimitation final du rabat nécrose survient généralement entre 5 et 7 jours après l'intervention chirurgicale et est caractérisé par une f...

Discussion

Afin de diminuer les complications ischémiques et ainsi améliorer le résultat clinique, une connaissance plus approfondie des processus physiopathologiques dans le tissu rabat perfusé critique est nécessaire. Le développement de nouveaux modèles animaux qui miment l'ischémie aiguë et persistante est donc obligatoire. En conséquence, nous avons pu développer un modèle facilement reproductible et fiable permettant l'évaluation en temps réel morphologique, dynamique et fonctionnel répétitif de diver...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
C57Bl/6 mice 6-8w 20-22g	Charles River
depilation cream	Veet		any depilation cream
titanium chamber	Irola	160001	Halteblech M
slotted cheese head screw	Screws and More	842210	DIN84 M2x10
hexagon full nut	Screws and More	93422	DIN934 M2
snap ring	Schaefer-Peters	472212	DIN472 J12x1,0
cover glass	Volab		custom-made cover glass 11,8mm in diameter
fixing foam	tesamoll	05559-100	tesamoll Standard I-Profile
ketamine hydrochloride	Parke Davis		Ketavet®
dihydroxylidinothiazine hydrochloride	Bayer		Rompun®
Buprenorphin	Essex Pharma		Temgesic®
Saline 0,9%
desinfection alcohol
Vicryl 5-0	Ethicon	V 490 H
Ethilon 5-0	Ethicon	EH 7823 H
1ml syringes
surgical skin marker with flexible ruler	Purple surgical	PS3151	any surgical skin marker and flexible ruler
pointed scissors
Micro-Scissors
normal scissors
2 clamps
fine anatomic forceps
micro-forceps
hex nuter driver	wiha	1018
screwdriver	wiha	685
snap ring plier	Knipex	4411J1	12-25mm
wire cutter	Knipex	70 02 160	Wire cutter is used to cut screws short; 160mm
trans-illumination light	IKEA	501.632.02	LED light Jansjö; any light
magnification glasses
intravital microscope	Zeiss	490035-0001-000	Scope.A1.Axiotech
LED system	Zeiss	423052-9501-000	Colibri.2
LED module 365nm	Zeiss	423052-9011-000
LED module 470nm	Zeiss	423052-9052-000
LED module 540-580nm	Zeiss	423052-9121-000
Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed	Zeiss	489062-9901-000	range 1: 350-390nm excitation wavelength split 395 / 402-448nm; range 2: 460-488nm, split 495nm / 500-557nm; range 3: 567-602nm, split 610nm / 615-infinite
Filter set 20 Rhodamine	Zeiss	485020-0000-000	540-552nm, split 560, emission 575-640nm
2,5x objective NA=0,06	Zeiss	421020-9900-000	A-Plan 2,5x/0.06
5x objective NA=0,16	Zeiss	420330-9901-000	EC Plan-Neofluar 5x/0.16 M27
10x objetive NA=0,30	Zeiss	420340-9901-000	EC Plan-Neofluar 10x/0.30 M27
20x objective NA=0.50	Zeiss	420350-9900-000	EC Plan-Neofluar 20x/0.50 M27
50x objective NA=0,55	Zeiss	422472-9960-000	LD Epiplan-Neofluar 50x/0.55 DIC 27
ZEN imaging software	Zeiss		ZenPro 2012
CapImage	Dr. Zeintl
Fluorescein isothiocyanate-dextran	Sigma-Aldrich	45946
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride	Sigma-Aldrich	B2261	harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause repiratory irritat
Rhodamine 6G chloride	Invitrogen	R634	harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child
Pentobarbital	Merial		Narcoren®