Mouse Dorsal Skinfold Odası'nda İskemik Doku Yaralanması: Bir Cilt Flap Model Akut Kalıcı iskemisi Araştırma

Özet

Sunulan murin dorsal Deri kıvrım odasının penceresi kas deri flebi akut kalıcı iskemi bir bölge görüntüler. Mikrovasküler ve hemodinaminin miktarının doğrudan ve tekrarlayan değerlendirmesi için Intravital epi-floresan mikroskopi izin verir. Morfolojik ve hemodinamik sonuçlar daha histolojik ve moleküler analizler ile ilişkili olabilir.

Özet

Derin uzmanlık ve ileri cerrahi tekniklere rağmen, geniş doku nekrozuna yara arıza değişen iskemi kaynaklı komplikasyonlar hala özellikle rekonstrüktif flep cerrahisi, yaşanıyor. Çoklu deneysel flep modelleri altında yatan nedenleri ve mekanizmalarını analiz etmek ve iskemik komplikasyonları önlemek için tedavi stratejileri araştırmak için geliştirilmiştir. En modelleri sınırlayıcı faktör, doğrudan ve tekrar tekrar mikrovasküler mimarisi ve hemodinamikleri görselleştirmek için eksik olasılığıdır. Protokolün amacı bu daha önce belirtilen eksik unsurları affiliating köklü bir fare modeli sunmaktır. Harder ve ark. Tedavi edilmeyen muhafaza edilmesi durumunda 10 gün sonra% 50 nekroz ~ akut kalıcı iskemi ve sonuçları uğrar rastgele bir perfüzyon desenli bir kas deri flebi modeli geliştirmiştir. Intravital epi-floresan mikroskop yardımı ile, bu odacık model tekrarlayan görselleştirme sağlarmorfolojisi ve zamanla farklı ilgi bölgelerinde hemodinamik. Böyle apoptoz, inflamasyon, mikrovasküler sızıntı ve anjiyogenez gibi ilişkili süreçler incelenmiş ve immünhistokimyasal ve moleküler protein deneyleri korele edilebilir. Bugüne kadar, model, kansızlığın meydan doku pre, peri etkisi ve postconditioning araştıran yayımlanmış birkaç deneysel çalışmalarda yapılabilirliğini ve tekrarlanabilirlik kanıtlamıştır.

Giriş

Rekonstrüktif cerrahi maruz tendon kemik implant materyalin kapsamı kanatların kullanımına dayanır. Bir flep arteriyel giriş ve venöz çıkışı garanti kendi vasküler pedikül üzerinde aktarılan doku bloktur. Geniş uzmanlık ve transfer edilecek kapakların çeşitli varlığına rağmen, toplam doku kaybı yara arıza değişen iskemi kaynaklı komplikasyonlar hala rastlanmaktadır. Sekonder konservatif tedavi ve iyileşme minör doku nekrozu sonrasında beklenen Oysa, önemli flep nekroz genellikle cerrahi, yara klima ve ikincil yeniden yapılanma dahil cerrahi revizyon gerektirir. Bu, morbidite artar hastanede kalış süresini uzatır ve dolayısıyla artan sağlık maliyetleri yol açar.

Arteriyel girişi gelen en uzak distal bölgesinde bir damar tanımlanmamış desen veya rastgele perfüze alanları ile Flaps iskemik hasara yatkındır. Acco rdingly, çok sayıda deneysel ve klinik çalışmalar hem de nekroz gelişimini değerlendiren, eksenel model flepler (tanımlanmış kanlanma) ve rasgele model flepler (tanımlanmamış kan temini) ^1-3. Ana bulgular yaygın nekrotik alanın büyüklüğü makroskopik değerlendirilmesi dayanmaktadır. Nedenleri ve doku nekrozu mekanizmalarını değerlendirmek üzere daha ayrıntılı olarak, çeşitli çalışmalar mikrodolaşımında analizi üzerinde duruldu. Farklı teknikler polarografik elektrotlar ^4-5 ile doku oksijen geriliminin analizi, hem de lazer Doppler flowmetri ^6-7, boya difüzyonu ⁸ ve mikrosferler ^10/9 kullanarak kan akışının ölçümü de dahil olmak üzere, doku perfüzyonunu ölçmek için kullanılmıştır. Bu teknikler, ancak, sadece doku perfüzyonunun dolaylı parametreleri ölçmek için izin ve bir flep ilgi bireysel alanda microhemodynamic işlemlerin herhangi bir morfolojik analizine imkan yok.

t "> Sandison diye tavşanlarda ¹¹ gerçekleştirilen in vivo çalışmalarda, uzun süreli için şeffaf bir odasını kullandı kim birinci olmak bilinen 1943 yılında -. ​​Yaklaşık 20 yıl sonra - Algire uygulanabilir olması için böyle bir şeffaf odasına adapte ilk Tümör hücrelerinin ¹² mikro-implantların davranışlarını incelemek amacıyla farelerde. Nedeniyle fareler gevşek cilt hayvanları sözde ve sonraki yıllarda üzerinde bazı teknik iyileştirmelerden sonra, Lehr ve co-işçi gibi adapte başardık aslında Daha küçük ve hafif bir titanyum bölmeyi üreten bir sırt deri altı bölme. Bu bölme, intravital floresan mikroskobu, morfolojik ve mikro-özelliklerden sayısı ve farklı fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında zaman içinde değişikliklerin doğrudan ve tekrarlayan görüntülenmesi için bir teknik, bu tür kullanılarak değerlendirilmesini mümkün kılmıştır iskemi-reperfüzyon hasarı ¹³ olarak.

Pe soruşturmanormal ve patolojik şartlar altında cilt, kas ve kemik flep rfusion iki eğilim oluştu: Birincisi, böyle bir fare ¹⁴ pediküllü kulak kepçesi gibi dorsal Deri kıvrım odasını kullanmayın "akut" flep modelleri, yanal merkezli ada flep hamster ¹⁵ ve sıçanlarda ¹⁶ pedikül bileşik flep. İkinci olarak, dorsal deri kıvrım odası izinleri tekrarlayan mikrosirkülatuar ile bir flep kombinasyonu intravital floresan mikroskobu ile birkaç gün boyunca analiz "kronik" flap modeli. Bu fare ^17'nin deri altı bölmesi içinde entegre edilmiş bir rasgele perfüze muskülokutan kanat oluşur. Genişliği-uzunluk oranı, akut kalıcı iskemi durum sürekli olarak 10-14 gün kanat yüksekliği sonra,% 50 kanat doku nekrozu ~ sonuçlanan şekilde seçilmiştir. Doku nekrozu Bu tekrarlanabilir ölçüde, koruyucu (yani gelişimi les hem daha değerlendirilmesine olanaks nekrozu) ve zararlı etmenler (yani, kapak patofizyolojisi daha nekroz gelişimi). Son yıllarda, farklı peri öncesi ve doku koruyucu maddelerin ^18-24 idaresi ve ısı ²⁵ ve shockwaves ²⁶ gibi fizyolojik stres yerel uygulama da dahil olmak üzere son şartlandırma prosedürleri, etkisini gösteren çok sayıda deneysel yayınlar, ortaya çıkmıştır.

Nekroz, mikrovasküler morfolojisi ve mikrosirkülatuar parametrelerin kantitatif analizleri, immünohistokimyasal analizler ve protein deneyleri korele edilebilir. Vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), nitrik oksit sentaz (NOS) Nükleer Faktör kappa B (NF-KB) ve ısı şoku proteinlerinin (HSP-32 de dahil olmak üzere farklı proteinler ve molekül: heme oksijenaz 1 (HO-1) ve HSP- 70) doku korumada bir rol oynadığı gösterilmiştir. Bu bölme flep modeline dayanarak, iki modifikasyonlar accueillante geliştirilmiştirr eksenel desen perfüzyon ile ²⁸ pediküllü flep deri grefti iyileşmesi ²⁷ ve Anjiyojenik gelişmeler sırasında neovaskülarizasyonunu mikrodolaşımın analiz etmek. Biz fare Deri kıvrım odasında bir kansızlığın meydan muskülokutan kanadı içeren bir güvenilir ve tekrarlanabilir bir model sunuyoruz. Bu model Intravital epi-floresan mikroskop ile mikrodolaşımında ve hemodinami görselleştirme ve kantifizasyonunu.

Protokol

NOT: Ön sunulan modelin uygulanması, ilgili hayvan koruma yasaları danışılması gerekir ve izin yerel yönetimler alınmalıdır. Bu çalışmada, tüm deneyler araştırma içeren hayvanlar için yol gösterici ilkeler ve hayvanların korunması konusunda Alman mevzuatına uygun olarak yapılmıştır. Deneyler yerel hayvan bakım komitesi tarafından onaylandı.

1. Hayvan Hazırlama ve Kanatçığının Cerrahi Yükseklik

1. 22-24 ° C, oda sıcaklığında ve 12 saat gündüz-ve gece çevrimi ile% 60-65 bir görece nemde bir kafes hayvanları tutun. Içme suyu ve standart laboratuar yiyeceği fareler ücretsiz erişime izin ver. Her zaman hayatta kalma ameliyat sırasında steril koşulların muhafaza.
2. 90 mg / kg vücut ağırlığı kadar ketamin hidroklorid ve 25 mg / ihtiva eden, 10 g vücut ağırlığı başına 0.1 mi tuzlu su çözeltisinin intraperitonal ile fare anestezisi (ip) enjeksiyonukg vücut ağırlığı dihydroxylidinothiazine hidroklorür. Anestezi hayvan hazırlanması, cerrahi ve daha sonra mikroskopi için gereklidir. Bir ağrılı uyaranlara yanıt kontrol edilerek uygun Anesthetization onaylayın. Anestezi süresi boyunca, kuruluğunu önlemek için gözlerin veteriner merhem uygulayın.
3. Yeterli anestezi indüksiyonu sonrası, bir elektrikli tıraş makinesi ile arka tüylerini. Bundan sonra, kalan saç kaldırmak için traş bölgeye epilasyon krem ​​uygulayın.
4. 7-10 dk'lık Depilasyon kremi kalış süresi sırasında, cilt forseps ve mikro forseps, makas ve mikro makas, dikiş materyali ve bir işaretleyici kalem gibi araçları hazırlamak. Dezenfekte ve bölmenin üssünde somun ile iki vidayı uygulayarak ve kamara sisteminin sıkılığını garanti sanığa muadili penceresinin etrafında kendinden yapışkanlı köpük (Res. 1 AC) sabitleyerek titanyum odası hazırlamak.
5. Yıkanarak arkasındaki tüm epilasyon kremi kaldırılık su ile kapalı. Daha sonra, kuru ve bir alkol ihtiva eden bir çözelti ile cilt dezenfekte.
6. Yüzükoyun fare ve arka orta hat tanımlar. Merkezi cilt kavramak ve bir kat (Şekil. 2A) oluşturmak için yukarı doğru kaldırın. Işık kaynağı her türlü kullanarak trans-aydınlatma ile, provisorily titanyum çerçeve (Şekil. 2B) yerleştirmek için nereye karar. Emin olun kraniyale yanal torasik arter (LTA) ve sanığa penceresinin merkezi aracılığıyla kaudale ders derin sirkumfleks iliak arter (DCIA) uzak dalları (Şekil. 2B-D). Odasının konumlandırılması yapıldıktan sonra, titanyum çerçeve, daha sonra tespit için kıvrımın en altındaki cildin her iki katmanın delikli. Şimdi, titanyum çerçevesini kaldırma yüzükoyun fare ve gerektiğinde arka orta hat yeniden tanımlar.
7. Omurga 15 x 1 bir genişlik-boy oranı ile orta hatta başlangıç ​​dik kanadı Planı1 mm'lik bir yanal göre ve rastgele perfüze kanadın sonuçlanır. Daha sonra, karşı tarafa uzanan 2 mm'lik bir ek deri alan belirtin (Şek. 2C, d). Bu alan, forseps ile toplandı ve daha sonra görünür kanat alanı ile müdahale etmeden titanyum çerçeveye dikilir.
8. Işaretleme son ardından, flep kesilirken. Bunu yaparken, LTA'ya ve DCIA hem transect ve kapağını (Şekil. 2E) yükseltmek. Nakledilmiş damarların pıhtılaşması ya da bağlanması için herhangi bir gerek yoktur.
9. Önceden yapılmış deri deliklerinin (Res. 2F) üzerinden bölmenin vidayı yerleştirin ve sanığa çerçevesinin delik ve bir 5-0 kullanarak çerçevenin arka kısmına yükseltilmiş flep bölmenin çerçevesi içinde hem anterior ve posteriorda skinfold sabitleşmek kesintiye dikişler (Res. 2G).
10. (5-0 sütür ile deriye geri kanadın dikey bacaklarda sütüre Şek. 2H, J).
11. Kapağın damar sistemini gözlemlemek için kapağın diğer tarafında, yani 2 mm'lik küçük bir deri şerit deri yanal bir yarı-dairesel bir alanı eksize edin. Bu 90 mm ^​​2 arasında bir yüzeye sahiptir, bölmenin gözlem penceresi üzerinden doğrudan olarak bakma olanağı tanır.
12. Mikroskopi sırasında görüntü kalitesini iyileştirmek amacıyla mikrocerrahi aletleri ve optik büyütücü lens veya mikroskop kullanılarak çizgili kas jelatin benzeri gevşek areolar doku çıkarın. Kas doku katmanları içinde damarlarının zarar değil deneyin.
13. Son olarak, topikal bisbenzimid ve tuzlu su (Şek. 2J) ile kanat çiy taneleriyle ıslatmak, kraniyal ve arkaya doğru, önceden öne köpük kendinden yapışkan şeritleriyle endued edilmiş çerçevenin karşıt montaj odacığı mühür. Bundan sonra, bir çırpıda halkayı kullanarak cam kapak ile gözlem penceresi uygulayın. Cam altında herhangi bir hava kabarcıklarına tuzağa çalışın (Res. 2K L). Cilt yapışma güçleri tarafından cam kapak uyacaktır.

2. Intravital Epifloresans Mikroskopi

1. İdeal optik kalite için ilk mikroskopik analiz için cerrahi hazırlık 24 saat sonra bekleyin. Bu analiz, mikroskopi taban çizgisini temsil eder ve ameliyat sonrasında günde 3, 5, 7 ve 10 tekrar edilir. Adım 1.2 açıklandığı gibi her zaman, fare uyutmak. Ismarlama bir pleksiglas bir taşıyıcı üzerinde bir yanal dekübital pozisyonda hayvan yerleştirin. Bu şekilde, cam kapak yapışan flep kas doku tabakaları yukarı-koğuşta karşı karşıya.
2. Bir kuyruk damarından ya da retrobulbar venöz pleksus içinde% 5 yeşil floresan dekstran (molekül ağırlığı 150,000) ve 0.05 ml% 1 yüksek seviyede florasan Rodamin ailesi boya 0.05 ml enjekte edilir. Yeşil fluoresan dekstran intravenöz uygulanması halinde, kanın hücresel olmayan bileşenler leke (IV). Dist olabilir floresan Rodamin lekeleri lökosit ve trombositdiğer hücresel ve hücresel olmayan bileşenleri inguished. Son olarak, yoğunlaşma durumuna göre daha az ya da flüoresan yayan çekirdek bileşenlerinin bisbenzimid boyar.
3. Daha sonra, mikroskop altında fare yerleştirin. Mikroskop bir LED sistemi içerir olun - 470 ve 425 nm, 365 ve 490 nm ve 540 ve 580 nm LED ışın kombinasyonları gibi gelen filtre setleri (62 HE BPP / GFP / HcRed, aralık 1: 350-390 nm , 460-488 nm 495 nm / 500-557 nm bölünmüş; aralığı 3: aralık 2; uyarma dalga boyu, 395 nm / 402-448 nm bölünmüş 567-602 nm, sonsuz için 610 nm / 615 nm bölmek 20 Rodamin, aralık. : 540-552 nm) emisyon 575-640 nm, 560 nm bölünmüş.
4. Fotoğraf ve şarj çiftli cihaz video kamera kullanarak hareket görüntü kaydedebilir ve daha fazla off-line analiz için bir bilgisayar sabit diske kaydedebilirsiniz.
5. Farklı hedefleri (2.5X, NA (sayısal açıklık) = odasının panorama görünümleri için 0,06 kullanın, 5X,NA = 0.16; 10X, NA 0.32 =; 20X, NA 0.50 =; Ilgi bölgelerin kayıtları için 50X, NA = 0.55).
6. Hemen hemen eşit yükseklikte, yani bir proksimal, merkezi ve en uzak damar girişi (Res. 3F) bir distal alanın üç bölüme bölmenin penceresinden görünür kanat yüzeyini bölün. Görüntü elde etmek için, her bir gözlem zaman noktasında şu şekilde devam edin:
   1. 5X objektif kullanarak uzağa yakınsaldan bölmenin penceresi içinde görüntü ile doku görüntüyü tarayın.
   2. Flep her alanda kolayca tanımlanabilen dallanma desenleri ile ikinci veya üçüncü dereceden arteriyolleri ve beraberindeki venüllerinde seçin. 5X, 10X ya da 20X objektif kullanarak, kolayca bütün gözlem süresi boyunca paketlerini yeniden lokalize etmek için arteriolovenular demetlerinin çıktı olun.
   3. 20X objektif ve 50X objektif, daha fazla kayıt 5-6 kılcal alanları ve "apoptotik ileSırasıyla flep alanı başına "alanlar. 10X ve 20X hedefleri ile kaydedilen tüm görüntüler yeşil ışık (Rodamin) filtresi, oysa, 5X ve 50X objektif kullanımı mavi ışık (floresan dekstran) ve beyaz ışık (bisbenzimid) filtresi ile kaydedilen görüntüler sırasıyla mavi ışık (floresan dekstran) ve kullanımı .

Kaydedilen Verilerin 3. Analiz

Not: ^29, aşağıdaki gibi, bir bilgisayar destekli görüntü analiz sisteminin kullanımı off-line Tüm kaydedilen parametrelerin ölçülmesi ile.

1. Alanının ölçülmesi perfüze olmayan sırasıyla nekrotik doku ^(mm2).
   1. (2.6.1 itibaren) 5X amacı ile kaydedilen tam taranan odası penceresi görüntü ve non-perfüze sırasıyla nekrotik doku ölçmek için floresan dekstran kullanın. Perfüze olmayan alan Border ve m alan hesaplamak: perfüze olmayan karanlık alanı ölçmek için "AreaBo" işlevini kullanınYazılımın Alan ölçümü algoritmalar kullanarak m ^2.
2. Arterioller, kılcal damarların ve venüllerden (mikron) mikrovasküler çapı ölçümü.
   1. Kaydedilen AV-demetleri veya yazılım içine kılcal alanlardan yük video ve resimler. En iyi sonuçlar, en yüksek büyütme ile fotoğraf veya videoları kullanmak için geminin kesin sınırları açıkça görünür olduğu yere.
   2. Ölçümler geminin duvarına dik gerçekleştirildiğinden emin olmak için yazılımın "DiamPe" işlevini kullanın. Bunu yapmak için geminin dik çapı geminin duvar ve üçüncü tıklama işareti ile iki noktalarını işaretleyin. Yazılım um ölçümü yapacak.
   3. Aynı yerde tüm kayıtları için aynı damarlar üzerindeki ölçümleri tekrarlayın. Ortalama çapa birikmesine çok kılcal ölçün.
3. Arteriyollerde kırmızı kan hücresi (RBC) hızının analizi, kılcalnd venülleri (mm / sn).
   1. Arteriolar kırmızı kan hücresi (RBC) hız için (mm / s) ölçümleri yazılımın "VeloLSD" fonksiyonunu kullanmak ve çapları ölçülmüş olan floresan dekstran penceresinde aynı damarları seçin.
   2. Süresi (san) içinde tek bir damar içi gri seviye Desenin kayması (mm) ölçümü temelinde olduğu satır kaydırma yöntemi kullanılarak bilgisayar destekli görüntü analiz sistemi ile analiz edin.
4. Damarlarda hacim kan akışı (ul / sn) ölçümü.
   1. RBC hız ve damar kesit alanından arteriyoller, venüller ve kılcal hacim kan akımı (ul / sn) hesaplayın (π * ^r2) Gross ve Aroesty, yani S = V * π * r, ² aşağıdaki denkleme göre , silindirik bir kap şekil ³⁰ varsayılmıştır.
5. RBC perfüze kılcal fonksiyonel kılcal yoğunluk ölçümü (besleyici perfüzyon: cm / cm 2).
   1. Yazılımın içine 20X objektif büyütme ile kaydedilmiş floresan kılcal alanını yükleyin. RBC-perfüze mikrodamarlar fonksiyonel kılcal yoğunluğunu ölçmek için "DensLA" işlevini kullanın.
   2. Imleç ile perfüze kılcal damarları Trace ve perfüze damarları işaretleyin. Işaretlemek yok kılcal damarlar, arteriyolleri veya venüllerinde perfüze olmayan. Yazılım cm / cm ² perfüze kılcal damarların fonksiyonel kılcal yoğunluğunu ölçmek olacaktır. Diğer kaydedilen kılcal alanlar için adımları tekrarlayın.
6. Mikrodamarlar (mikrovasküler remodeling) gibi tomurcuk ve filiz-oluşumu ve yeni oluşan mikrodamarlar olarak anjiyojenisinin erken belirtileri kıvrımlarında ölçümü.
   1. Yük yazılımı içine videoları veya floresan kılcal alanların kareleri kaydedildi. Gyrose damarlarını tanımlamak ve yazılımın "TorqIx" işlevini kullanın. Ders ile kesin damar akışını izlemek ve bir sağ tıklama ile biter. Yazılım olacakdoğrudan yol düz bir çizgi çizin ve takip yolu ile ilgili olarak ayarlamak.
      NOT: Genellikle önceden varolan kılcal dik olarak yayılan bu tür tomurcukları, filizleri ve yeni oluşan kılcal olarak anjiyogenez belirtileri, dikkat edin. Aşama 3.5 de tarif edildiği gibi bu, yeni oluşan damarların yoğunluğu ölçülür.
7. Nükleer yoğunlaşma, parçalanma ve / veya marjinalleşmesi (hücre / mm ²⁾ olarak apoptotik hücre ölümü için özellikleri, belirlenmesi.
   1. Yazılımın içine bisbenzimid-kaydedilmiş videoları (50X objektif) yükleyin. "DenseNA" işlevini kullanın. Böyle bir sol tıklama ile nükleer yoğunlaşması, parçalanma ve marjinalleşmesi olarak belirtilen özelliklerine göre apoptotik hücreleri işaretlemek.
   2. Video boyunca tüm karakteristik hücreleri işaretleme sonra, otomatik olarak tüm işaretli hücrelerin sayısı ve alanı boyunca onu böler, hangi yazılım "N / A" seçeneğini tıklatın. Sonuç apoptotik olacakhücre / ^mm2.
8. Inflamasyon temsil vasküler endotelyuma lökosit yapışması analizi. Lökositlerin Aralıklı bağlılık (lökositler haddeleme; bağlılık <30 sn: silindirlerin sayısı / mm ² endotelyal yüzey) ve lökositlerin firma bağlılık (lökositler yapışmasını; bağlılık> 30 sn: çıkartmalar / mm ² endotel yüzey sayısı).
   1. Rodamin sayısını sayarak enflamatuvar yanıtı analiz eder (<30 saniye "silindirler") ≥30 saniye arasındaki bir zaman periyodu ("etiketleri"), post-kılcal venüllerin endotelinde yapıştırılmış lökositler ve aralıklı olarak yapışan lökositlerin etiketli . Venüler lökosit yapışmasını ^mm2 endotel yüzeyi başına hücre olarak ifade edilir.
9. Mikrovasküler sızıntısı (makro-moleküler fışkırma e = E1 / E2) için bir parametre olarak damar içi ve interstisyel gri seviyelerinin ölçülmesi.
   1. Makromoleküler l değerlendirinbir fluoresan dekstran iv enjeksiyonundan sonra, mikrovasküler geçirgenliğin bir parametre olarak eakage. Densitometrik olarak doğrudan bir kapiller damar duvarı (E1) bitişik, hem de kabın (E2) marjinal hücresiz plazma dokuda çoklu gri seviyesini belirlemektedir. Daha sonra E1 / E2 ³¹ oranı olarak damardan makromoleküler fışkırmaya (E) hesaplar.

4. Ameliyat Sonrası Bakım

1. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirket önlemek için ayrı bir kafes içinde hayvan dönün. Bu sternal yatma korumak için yeterli bilince kavuşana kadar sahipsiz bir hayvan bırakmayın. Kanama, lokal ve sistemik enfeksiyon işaretleri ve bölmenin konumu için günlük olarak hayvanlar izleyin.
2. Pansuman ve otomatik kurcalanmaları motor aktivite, vücut ağırlığı, ağrı belirtileri, tolerans gözlemleyerek hayvanın genel durumunu değerlendirin.
3. Mutu önlemek için bir kafes için fareler bir tutunodasının al manipülasyon. Ağrının herhangi bir işareti de, 8 saat aralıklarla deri altından, 0.05-0.1 mg / kg vücut ağırlığı bir dozda buprenorfin geçerlidir.

5. Ötanazi ve Skinfold Odası Eksplantasyonu

1. 10. günde, bir anestetik ilaç (150mg / kg kadar pentobarbital) bir doz aşımı ile hayvanlar kurban.
2. Odasını kaldırmak ve immünohistokimyasal ve moleküler protein deneyleri için flep doku örnek. Geleneksel histoloji (formalin) ve ölçülebilir protein tayini (sıvı azot veya kuru buz) için örnek dokular.

Sonuçlar

Nekroz

Bu model, temel nokta - doku nekrozu, aşağıdaki kanat yüksekliği (örneğin akut iskemi, kalıcı indüksiyonu) - tekrar tekrar ölçülür ve 10 günlük bir süre boyunca, Şekil 3 'de gösterildiği gibi makroskopik olarak gösterilen. Flep nekroz nihai sınır çizimi genellikle ameliyattan 5 gün sonra ve 7 arasında meydana ve Şek. 3D-F (proksimal hayati ve flep distal nekrotik bölge arasında gelişen vazodi...

Tartışmalar

Klinik sonucu iskemik komplikasyonları azaltmak ve böylece iyileştirmek için, eleştirel perfüze flep dokusunda patofizyolojik süreçlerin daha detaylı bilgisi gereklidir. Akut kalıcı iskemi taklit yeni hayvan modellerinin geliştirilmesi, bu nedenle zorunludur. Buna göre, örneklenmiş kanat dokusunun immünohistokimyasal ve moleküler analiz ile ilişkili olabilir kas ve deri damarsal çeşitli parametrelerin tekrarlayan, morfolojik, dinamik ve fonksiyonel gerçek zamanlı değerlendirilmesini sağlayan bir ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
C57Bl/6 mice 6-8w 20-22g	Charles River
depilation cream	Veet		any depilation cream
titanium chamber	Irola	160001	Halteblech M
slotted cheese head screw	Screws and More	842210	DIN84 M2x10
hexagon full nut	Screws and More	93422	DIN934 M2
snap ring	Schaefer-Peters	472212	DIN472 J12x1,0
cover glass	Volab		custom-made cover glass 11,8mm in diameter
fixing foam	tesamoll	05559-100	tesamoll Standard I-Profile
ketamine hydrochloride	Parke Davis		Ketavet®
dihydroxylidinothiazine hydrochloride	Bayer		Rompun®
Buprenorphin	Essex Pharma		Temgesic®
Saline 0,9%
desinfection alcohol
Vicryl 5-0	Ethicon	V 490 H
Ethilon 5-0	Ethicon	EH 7823 H
1ml syringes
surgical skin marker with flexible ruler	Purple surgical	PS3151	any surgical skin marker and flexible ruler
pointed scissors
Micro-Scissors
normal scissors
2 clamps
fine anatomic forceps
micro-forceps
hex nuter driver	wiha	1018
screwdriver	wiha	685
snap ring plier	Knipex	4411J1	12-25mm
wire cutter	Knipex	70 02 160	Wire cutter is used to cut screws short; 160mm
trans-illumination light	IKEA	501.632.02	LED light Jansjö; any light
magnification glasses
intravital microscope	Zeiss	490035-0001-000	Scope.A1.Axiotech
LED system	Zeiss	423052-9501-000	Colibri.2
LED module 365nm	Zeiss	423052-9011-000
LED module 470nm	Zeiss	423052-9052-000
LED module 540-580nm	Zeiss	423052-9121-000
Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed	Zeiss	489062-9901-000	range 1: 350-390nm excitation wavelength split 395 / 402-448nm; range 2: 460-488nm, split 495nm / 500-557nm; range 3: 567-602nm, split 610nm / 615-infinite
Filter set 20 Rhodamine	Zeiss	485020-0000-000	540-552nm, split 560, emission 575-640nm
2,5x objective NA=0,06	Zeiss	421020-9900-000	A-Plan 2,5x/0.06
5x objective NA=0,16	Zeiss	420330-9901-000	EC Plan-Neofluar 5x/0.16 M27
10x objetive NA=0,30	Zeiss	420340-9901-000	EC Plan-Neofluar 10x/0.30 M27
20x objective NA=0.50	Zeiss	420350-9900-000	EC Plan-Neofluar 20x/0.50 M27
50x objective NA=0,55	Zeiss	422472-9960-000	LD Epiplan-Neofluar 50x/0.55 DIC 27
ZEN imaging software	Zeiss		ZenPro 2012
CapImage	Dr. Zeintl
Fluorescein isothiocyanate-dextran	Sigma-Aldrich	45946
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride	Sigma-Aldrich	B2261	harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause repiratory irritat
Rhodamine 6G chloride	Invitrogen	R634	harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child
Pentobarbital	Merial		Narcoren®