RNA تسلسل تحليل التفاضلية التعبير الجيني في Electroporated الفرخ الجنينية الحبل الشوكي

Summary

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

Abstract

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

Introduction

الدراسات الجينية على الكائنات الحية كثيرا ما تستخدم الجنين الدجاج كنموذج لأنه في Electroporation للالبيضة يمثل وسيلة سريعة وغير مكلفة لبالنقل جزئيا الهياكل الجنينية في الجسم الحي مع الحمض النووي يبني ^1-5. ناقلات التعبير Bicistronic التي تكود نسخة واحدة تحتوي مراسل فلوري مع الجينات في المصالح، مثل pCIG ⁶ أو ⁷ pMES، يسمح بالتحقق السريع للجودة ترنسفكأيشن في المنطقة المطلوب بموجب stereomicroscope قبل معالجة الأجنة لتحليل المصب.

مع التطورات الحديثة في تسلسل الحمض النووي، أصبح من الممكن الآن الحصول رقمية كاملة لمحات Transcriptome على التعبير من عينات الحمض النووي الريبي RNA باستخدام تسلسل ^8،9. لذا، بدلا من الأساليب تستغرق وقتا طويلا التي تمكن من تحليل سوى عدد قليل من المنتجات الجينات في موازاة ذلك، مثل الموقع التهجين، المناعية وQPCR، وإعداد مكتبات [كدنا في ليمكن عالية الإنتاجية تسلسل تقديم المعلومات من Transcriptome على كله. يمكن ملاحظة آثار التجريبية على مستويات التعبير الجيني من كل واحد بدوره تقدم رؤى قوية على مسارات غيرت من التركيبة المستخدمة. هذا أمر سهل لا سيما إذا كان التجمع الجيني للكائن المستخدم هو متاح، وبالتالي فإن الجنين الفرخ هو نموذج مناسب مرة أخرى.

إذا كان المستخدم لديه حق الوصول إلى مركز موثوق تسلسل الجينوم، القضية الرئيسية هي الحصول على عينات الحمض النووي الريبي جودة عالية. يوضح هذا العمل وسيلة للحصول على عينات من الحمض النووي الريبي من الأنابيب العصبية transfected مناسبة لتسلسل الحمض النووي الريبي، وكذلك الخطوات اللاحقة للسيليكون في تحليل مجموعات البيانات الناتجة عن ذلك. بعد Electroporation للفي HH12-13 تليها 48 ساعة الحضانة، تم تشريح الجذع transfected نصفين الحبل الشوكي في ظروف خالية من ريبونوكلياز، هي lysed على الفور وزيادة حمايتها من التدهور قبل منخفضة للغاية حتى تجميد تنقية RNA ومكتبة preparatأيون.

خادم العام غالاكسي ¹⁰ يوفر وصولا إلى تحرير الموارد لتحليل البيانات التسلسل الإنتاجية العالية. مقدار المساحة المعروضة للمستخدمين المسجلين يكفي للتجارب صغيرة، وبالتالي القضاء على الحاجة إلى البنية التحتية الحاسوبية المحلية. ويشمل تحليل البيانات RNA يليها الترشيح، والمحاذاة والكميات / المقارنة بين التعبير الجيني. على الرغم من أن هناك مبادئ توجيهية عامة لتحليل البيانات RNA يليها، ومعايير الترشيح سيعتمد إلى حد كبير على نوعية التسلسل وينبغي أن تحدد بعد تحليل ومراقبة الجودة للبيانات الخام.

يصف هذا البروتوكول الخطوات للحصول على ومقارنة ملامح-RNA يليها من الدجاج الجنينية النخاع الشوكي transfected في الجسم الحي. نتيجة التمثيلية، وأظهرت المقارنة بين مجموعات البيانات التي تم الحصول عليها من عينتين مراقبة مستقلة transfected مع ناقلات الفارغة أن الأسلوب هو استنساخه وينبغي أن يسمح بتحديد اكسبريس تفاضليالنصوص سد في العينات التجريبية. وبالتالي، تطبيق هذه الطريقة لها القدرة على زيادة كبيرة في عدد من الاكتشافات بعد تجربة واحدة واحدة، وبالتالي توفير مجموعة كبيرة من البيانات للتحقيق لاحق.

Protocol

1. Electroporate التركيبة الاهتمام في الأنابيب العصبية للأجنة الدجاج HH12-13 في البيضة

استخدام مراسل الفلورسنت، ويفضل في نسخة bicistronic أو تنصهر للبروتين في المصالح مع الإقحام الفيروسي 2A الببتيد ^11، لتمكين سرعة تحديد الأفراد ذوي مستويات مرضية من ترنسفكأيشن. ملاحظة: فترة حضانة نموذجية لهذه المرحلة حوالي 48 ساعة في 37.8 درجة مئوية.

1. فتح نافذة صغيرة في البيض بعد إزالة 3 مل من الألبومين مع حقنة إلى جانب 18 G × 1 1/2 إبرة. لتعزيز الجنين التصور، حقن كمية صغيرة من الحبر الهندي المخفف 01:50 في محلول معقم رينغر تحت الجنين ^1-4.
2. بعد تغطية الجنين بمحلول معقم رينغر، وضخ 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.2 و 0.1٪ الغذاء صبغ (F، D & C) محلول يحتوي على 2.5 ميكروغرام / ميكرولتر الحمض النووي حتى نهاية الخلفي من الأنبوب العصبي حتى يملأيصل إلى المنطقة الدماغ المؤخر. لelectroporate، أقطاب البلاتين موقف (0.5 ملم في القطر) مفصولة 4 مم ¹ على طول منطقة الجناح وتقديم 5 نبضات من 50 ميللي ثانية و 20 V مع فاصل من 100 ميللي ثانية بينهما ^4.
3. بعد Electroporation لل، واحتضان الأجنة التلاعب بها لمدة 48 ساعة وأكثر حتى تصل إلى مرحلة HH23 وتحديد الأفراد تقديم مستوى عال من ترنسفكأيشن في المنطقة الاجنحة تحت stereomicroscope الفلورسنت.
   ملاحظة: مدة حضانة المرض بعد Electroporation لليعتمد على الهدف من التجربة. يمكن البلازميدات electroporated تولد مستويات التعبير كبيرة بعد 2 ساعة ^2. وبالتالي، إذا كانت المصلحة تكمن في الجينات ظهور أوائل فترة الحضانة ما بعد Electroporation للويمكن تخفيضها.

2. الحصاد Transfected بنجاح الأجنة وتشريح الأنصاف الحبل الشوكي Electroporated

ملاحظة: يستمر هذا الإجراء 2-3 ساعة لكل 10 أجنة والعوائد 1-2 الحمض النووي الريبي مجموع ميكروغرام لكل الجنين. تشريح الأنابيب العصبية يتطلب حركات غرامة وربما تكون بعض جلسات التدريب الضروري قبل تطبيقه على عينات تجريبية.

1. تطهير أدوات تشريح المعدنية مع حل ريبونوكلياز إزالة التلوث أو عن طريق الخبز على 150 درجة مئوية لمدة 4 ساعات ¹² وإعداد برنامج تلفزيوني المعالجة DEPC. استخدام الوحيد الجديد مصدق خالية من ريبونوكلياز بلستيكور.
   ملاحظة: بعد الحصاد، فمن المهم اتباع الرعاية القياسية لمنع التلوث ريبونوكلياز خلال تشريح.
2. حصاد الأجنة باستخدام زوج من مقص تشريح غرامة وملعقة جمع منخول. الحفاظ على الأجنة في برنامج تلفزيوني الباردة المعالجة DEPC في 100 مم طبق بيتري.
3. مع زوج من ملاقط دقيقة، قطع منطقة الجناح كلها (بين الحد الخلفي لبرعم الطرف الأمامي والحد الأمامي لبرعم الطرف الخلفي) ونقل هذا القسم إلى طبق جديد يحتوي البارد PBS المعالجة DEPC.
4. استخدام اثنين من الإبر الزجاج غرامة لخرم في ثلاثة مختلفةيشير على كل جانب ظهراني الجنين بين الأنبوب العصبي والأديم المتوسط ​​المجاور للمحور.
5. إدخال الإبر الزجاج اثنين من ثقب في وسط والتحرك ببطء واحد منهم بعيدا على طول أنبوب المحور الأمامي الخلفي العصبي. كرر هذا للثقوب التي لا تصلها حركات الأولى. إزالة الأديم المتوسط ​​المجاور للمحور منفصلة مع زوج من ملاقط غرامة.
6. تحويل الجنين جانبية، إدراج نصائح من ملاقط بين الأنبوب العصبي والحبل الظهري وشريحة منهم في اتجاهين متعاكسين على طول المحور الأمامي الخلفي للفصل بين الهيكلين.
   ملاحظة: هذا أيضا يجب إزالة أكثر من الأديم المتوسط ​​لا تزال تعلق على الأنبوب العصبي.
7. إذا لزم الأمر، قم بإزالة أي أكبر قطعة من نسيج الأديم المتوسط ​​التي لا تزال تعلق عن طريق سحب مع زوج من ملاقط حين الضغط بخفة الأنبوب العصبي مع زوج آخر من الملقط. عند الانتهاء، ونقل بلطف الأنبوب العصبي إلى طبق آخر يحتوي على البارد المعالجة DEPC PBS باستخدامريبونوكلياز خالية من الزجاج ماصة باستير مقترنة لمضخة ماصة اليدوية والحفاظ على الجليد حتى يتم تشريح جميع الأنابيب.
8. تقسيم الأنابيب العصبية إلى نصفين. لهذا، أدخل طرف حاد من زوج من ملاقط مغلقة في التجويف وفتح لوحة السقف عن طريق تحريك ملاقط من خلال ذلك. بعد ذلك، فصل نصفين عن طريق خفض لوحة الأرض مع النصائح ملاقط.
9. نوع electroporated من نصفين غير electroporated تحت نطاق الفلورسنت تشريح ونقل إلى أنبوب 1.5 مل مليئة المعالجة DEPC PBS الجليد الباردة. إذا لزم الأمر، ونفض الغبار microtubes بلطف للافراج عن أي نوع من الأنسجة التي تعلق على الجدران البلاستيكية وتشجيع الترسيب من الأنابيب.
10. تدور في 100 x ج لمدة 3 ثوان، وإزالة ببطء شديد كما PBS قدر ممكن مع 1 مل ممص مكروى. تفعل هذا في حين تبحث في مصدر الضوء الذي يضيء من خلال microtube لمراقبة إذا تم امتصاص أي مادة الجنينية لطرف ماصة. إذا حدث هذا، الوفاء ببطء وتكرار centrifugaنشوئها.
11. إضافة 70 ميكرولتر من محلول تحلل لاستخراج الحمض النووي الريبي في الأنبوب العصبي نصف ونفض الغبار الأنبوب لخلط المحتويات. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ودوامة بقوة. تكرار حضانة 5 دقائق وvortexing لمرتين أخريين. تخزين في -80 درجة مئوية.
12. جمع ما لا يقل عن ثمانية نصفين الأنبوب العصبي لكل عينة لضمان العائد المناسب لاتخاذ الخطوة التالية. تجميع عينات أصغر إذا مطلوبة عدة جلسات Electroporation لل/ تشريح لجمع عدد كاف من الأنابيب العصبية. تخزين عينات كافية للمكررة أو يثلث لكل حالة.

3. تنقية RNA وإعداد مكتبات التسلسل البورشيد

1. إزالة عينات من -80 ° C تخزين ووضع على الجليد لمدة 15-30 دقيقة. استئناف ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة حتى تكتمل.
2. دوامة جيدا ويترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. الدوامة مرة أخرى وأجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 1 دقيقة لتكوير المواد غير القابلة للذوبان.
3. نقل طاف لأنبوب جديدوالشروع في استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لمجموع العزلة RNA دليل طقم التعليمات. أزل في الحد الأدنى للحجم الموصى بها لزيادة التركيز.
   ملاحظة: العلاج الدناز بعد تنظيف يوصى من أجل تجنب التلوث المحتمل لتسلسل الحمض النووي الجيني في قواعد البيانات-RNA يليها.
4. نفض الغبار الأنبوب لخلط محتويات وإزالة 5 ميكرولتر لتحليل ومراقبة الجودة. تخزين العينة المتبقية في -80 درجة مئوية حتى إعداد مكتبة. يجب إذابة هذه العينات مرة واحدة فقط لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي.
5. تشغيل RNA المنقى في صك Bioanalyzer باستخدام نانو عدة RNA 6000. يجب أن تكون قيمة رين على الأقل فوق 7 والمضي قدما.
6. إنشاء مكتبات باستخدام-RNA يليها متوافقة إعداد مكتبة والبورشيد ومتعدد يصل إلى 4 مكتبات في ممر واحد صك HiSeq المتوقع أن تولد 100 BP يقرأ احد. إذا كان ذلك ممكنا، وتشمل جميع العينات في نفس المدى للحد من التحف الفنية المحتملة.
   ملاحظة: يجب أن تسفر عن ما يصل الى 50 مليون صEADS في العينة، التي هي أكثر من كافية للحصول على تغطية لمعظم الجينات ^13.

4. قارن بين مجموعات البيانات-RNA يليها في خادم غالاكسي العامة ^10.

ملاحظة: مساحة التخزين خادم محدودة وتجارب مقارنة عينات كثيرة قد تتطلب حذف الملفات وسيطة ولدت في الخطوات الترشيح.

1. إنشاء حساب مستخدم في وحدة خدمة الجمهور غالاكسي ( https://usegalaxy.org ) وبروتوكول نقل الملفات تحميل قواعد البيانات البورشيد في شكل fastq.
2. إعداد الملفات التي يتم تحميلها مع أداة FastqGroomer ¹⁴ تحت NGS: القائمة مراقبة الجودة والتلاعب. إذا تم ترميز نقاط جودة بالفعل في PHRED + 33 (سانجر)، تخطي هذه الخطوة ببساطة عن طريق تغيير نوع الملف إلى fastqsanger تحت سمات لكل مجموعة البيانات.
3. تحليل نوعية العامة لكل مجموعة البيانات باستخدام أداة FastQC تحت NGS: مراقبة الجودة والتلاعب لينو.
   ملاحظة: ينبغي إيلاء اهتمام خاص لرسومات الناتجة عن محتوى تسلسل في تسلسل جودة قاعدة ولكل قاعدة، كما ستوفر هذه التقديرات للمعلمات المستخدمة لتقليم نهايات يقرأ.
4. تقليم يقرأ لتجاهل 3 "ينتهي مع البيانات منخفضة الجودة باستخدام أداة FASTQ الجودة المتقلب ¹⁴ تحت NGS: القائمة مراقبة الجودة والتلاعب. تعيين أداة لمعالجة 3 فقط 'ينتهي لدرجة جودة أقل من 20.
5. إزالة متواليات محول من يقرأ باستخدام أداة كليب ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) تحت NGS: القائمة مراقبة الجودة والتلاعب. تعيين أداة لتجاهل يقرأ مع أقل من 45 BP اليسار، إدخال سلسلة من محول المستخدمة واختيار الانتاج لتشمل كلا متواليات قص وغير قص. بالإضافة إلى ذلك، تختار عدم تجاهل تسلسل مع قواعد معروفة لأن معظم القواعد جودة منخفضة أزيلت بالفعل في الخطوة الأخيرة.
6. باستخدام أداة تسلسل تريم ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) تحت NGS: مراقبة الجودة والقائمة التلاعب، وتقليم الأسس الأولى ليقرأ لإزالة 5 "التحيز تسلسل الكشف عنها بواسطة FastQC (عادة 10).
   ملاحظة: عند هذه النقطة، انها فكرة جيدة لتشغيل FastQC مرة أخرى ومقارنتها مع التحليل السابق لتحديد ما إذا تم تحسين نوعية البيانات.
7. تحميل وتفريغ أحدث التجمع جينوم الدجاج للمتصفح الجينوم UCSC من البورشيد iGenomes ( http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn ) وتحميل كامل الجينوم FASTA شكل ملف وملف تنسيق GTF الجينات الشرح لتاريخ المجرة باستخدام ملف تحميل أداة ضمن القائمة إحضار بيانات.
8. خريطة يقرأ لكل عينة لجينوم الدجاج باستخدام اليجنر TopHat2 تحت ¹⁵وNGS: القائمة تحليل الحمض النووي الريبي. اختيار لاستخدام الجينوم من التاريخ (حدد الملف FASTA تحميلها في الخطوة 4.7).
9. بناء Transcriptome على توقع لكل عينة باستخدام أزرار أكمام تحت ¹⁶ خ ع: القائمة تحليل الحمض النووي الريبي. اختيار لاستخدام الشرح الإشارة كدليل (حدد الملف GTF التي تم تحميلها في الخطوة 4.7) وتشغيل خيارات تنفيذ تصحيح التحيز (من التاريخ، وملف FASTA من الخطوة 4.7) والاستخدام الصحيح قراءة متعددة.
10. دمج transcriptomes توقع لجميع العينات باستخدام Cuffmerge ¹⁶ تحت NGS: القائمة تحليل الحمض النووي الريبي. اختيار لاستخدام الشرح المرجعية (ملف GTF من الخطوة 4.7) وبيانات تسلسل (من التاريخ، وملف FASTA من الخطوة 4.7).
11. مقارنة ملفات BAM الناتجة عن TopHat2 لكل عينة باستخدام Cuffdiff ¹⁶ تحت NGS: القائمة تحليل الحمض النووي الريبي. في النصوص الحقل حدد ليTranscriptome على rged ولدت قبل Cuffmerge وتشغيل الخيارات نفذ تصحيح التحيز (من التاريخ، وملف FASTA من الخطوة 4.7) والاستخدام الصحيح قراءة متعددة.
12. نوع التعبير التفاضلي اختبار الجداول تصاعدي عدديا في العمود 13 (قيمة ف) باستخدام أداة ترتيب ظل تصفية وفرز القائمة.
    ملاحظة: الجينات / النصوص التي تبين التعبير فارق كبير بين ظروف تجريبية سيقدم أدنى قيم س.
13. للتحقق النتائج بصريا مع تغطية الرسوم البيانية، أولا تحويل الملفات إلى تنسيق BAM bedGraph باستخدام أداة إنشاء BedGraph تغطية الجينوم ¹⁷ ضمن القائمة BEDTools. تعطيل الإبلاغ عن المناطق بدون تغطية، واختيار لعلاج إدخالات كما تقسم فترات متميزة وتوسيع نطاق التغطية من قبل أحد العوامل التي تطبع عمق التسلسل لجميع مجموعات البيانات التي تقارن.
14. تحويل الملف إلى تنسيق bedGraph الناتجة العظيم الشأن باستخدامأداة الباروكة / BedGraph-إلى-العظيم الشأن ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) ضمن القائمة تنسيقات تحويل. تحميل الملفات العظيم الشأن من المسارات المخصصة في متصفح الجينوم UCSC ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) لتجميع galGal4 والبحث في الجينات التي تهم تصور التغطية في قواعد البيانات.

النتائج

للتحقق من صحة الطريقة الموصوفة، وقد تم توليد عينات سيطرة اثنين من الأجنة electroporated مع pMES ناقلات الفارغة ⁷ وعينة واحدة من أجنة transfected مع نفس ناقلات تحتوي على إدراج بناء SCRT2-ZNF، الذي يشفر المجالات الزنك وأصابع الدجاج SCRT2 ^18. وقد تم الحصول على عينات العائد 11-22 ميكر...

Discussion

نحن هنا توفير مبادئ توجيهية لتحليل الآثار بعد Electroporation للمن الحبل الشوكي الدجاج. على الرغم من Electroporation للناقلات الحمض النووي هو أكثر كثيرا ما تستخدم لبإفراط عن الجين من الفائدة، ويمكن للمرء أيضا استخدام التركيبات ترميز السلبيات المهيمنة، والبروتينات quimeric أو السلائ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Indian ink	Any supplier
18G x 1 1/2 needle	BD	305196
3 ml syringe	BD	309657
Tris	MP Biomedicals	819620
F D & C Blue 1	Spectra Colors Corporation	5.FC.0010P0	Food Dye used to visualize DNA injection
Ringer's solution (1 L)
- 7.2 g NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
- 0.37 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
- 0.225 g CaCl2•2H2O	Fisher Scientific	10043-52-4
- 0.217 g Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0.02 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
- ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4
- ddH2O to 1 L
- Filter and autoclave
PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L)
- 8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
- 0.2 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
- 1.15 g Na2HPO4•7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0.2 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
- ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2
- ddH2O to 1 L and filter
- 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate)	Sigma-Aldrich	D-5758
- Shake vigorously and let stand overnight at room temperature
- Autoclave
Sieved spoon	Any supplier
Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes	Corning Life Sciences	351007
RNaseZap RNase decontamination solution	Life Technologies	AM9780
Fine point surgical scissors	Any supplier
Straight fine point tweezers	Any supplier
Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes	Kimble Chase	40A502
9'' glass Pasteur pipette	Any supplier
Manual pipette pump	Any supplier
Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes	Corning Life Sciences	MCT-150-C
Microcentrifuge	Any supplier
RNAlater solution for RNA stabilization	Life Technologies	AM7020
RNAqueous total RNA isolation kit	Life Technologies	AM1912
Molecular Biology Grade Ethanol	Any supplier
RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies	5067-1511
2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies	G2939AA
Truseq RNA Sample Preparation Kit v2	Illumina	RS-122-2001/RS-122-2002