ARN-Seq analyse de l'expression génique différentielle dans électroporation embryon de poulet de la moelle épinière

Résumé

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

Résumé

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

Introduction

Les études génétiques sur les organismes vivants utilisent fréquemment l'embryon de poulet comme modèle parce que dans l'électroporation in ovo représente un moyen rapide et peu coûteux pour la transfection partiellement structures embryonnaires in vivo avec des constructions d'ADN ^1-5. Des vecteurs d'expression bicistronique qui codent pour un produit de transcription contenant un rapporteur fluorescent en même temps que le gène d'intérêt, comme pCIG ⁶ ou ⁷ PMES, permettent une vérification rapide de la qualité de la transfection dans la région souhaitée sous un stéréomicroscope avant de traiter les embryons pour l'analyse en aval.

Avec les progrès récents dans le séquençage de l'ADN, il est maintenant possible d'obtenir des profils d'expression numériques entières du transcriptome à partir d'échantillons d'ARN en utilisant l'ARN-Seq ^8,9. Par conséquent, au lieu des méthodes fastidieuses qui permettent l'analyse de seulement un petit nombre de produits de gènes en parallèle, telles que l'hybridation in situ, immunohistochimie et PCR quantitative, la préparation de banques d'ADNc pour enséquençage à haut débit peut fournir des informations de l'ensemble du transcriptome. Observation des effets expérimentaux sur les niveaux de tous les gènes d'expression peut à son tour conduire à dégager sur les voies modifiés par la construction utilisée. Ceci est particulièrement facile si un assemblage génomique de l'organisme utilisé est disponible, donc l'embryon de poulet est de nouveau un modèle approprié.

Si l'utilisateur a accès à un centre de séquençage du génome fiable, le principal problème est l'obtention d'échantillons d'ARN de haute qualité. Ce travail démontre une méthode pour obtenir des échantillons d'ARN à partir de tubes de neurones transfectées appropriés pour l'ARN-Seq, ainsi que les étapes en aval pour l'analyse in silico des ensembles de données obtenus. Après électroporation à HH12-13 suivie par 48 heures d'incubation, le tronc transfectées moitiés de la moelle épinière ont été disséqués dans des conditions exemptes de ribonucléase, immédiatement lysées et plus protégés de la dégradation par ultra-bas jusqu'à ce que le gel purification d'ARN et bibliothèque preparation.

Le serveur public Galaxy ¹⁰ donne accès à des ressources gratuites pour l'analyse des données de séquençage à haut débit. La quantité d'espace offert pour les utilisateurs enregistrés est suffisant pour de petites expériences, éliminant ainsi le besoin d'une infrastructure informatique locale. L'analyse des données de l'ARN-Seq comprend le filtrage, l'alignement et la quantification / comparaison de l'expression du gène. Bien qu'il existe des lignes directrices générales pour l'analyse des données de l'ARN-Seq, les paramètres de filtrage dépendra en grande partie sur la qualité de séquençage et devraient être déterminés après analyse de contrôle de la qualité des données brutes.

Ce protocole décrit les étapes pour obtenir et comparer les profils d'ARN-Seq de poulet embryonnaire de la moelle épinière transfectées in vivo. Comme un résultat représentatif, la comparaison des ensembles de données obtenues à partir de deux échantillons de contrôle indépendants transfectées avec un vecteur vide ont montré que le procédé est reproductible et devrait permettre l'identification de différentiellement exprestranscriptions sed dans les échantillons expérimentaux. Par conséquent, l'application de cette méthode a le potentiel d'augmenter considérablement le nombre de découvertes après une expérience unique et de fournir ainsi un vaste ensemble de données pour l'enquête subséquente.

Protocole

1. électroporer la construction d'intérêt dans les tubes neuraux de HH12-13 embryons de poulet in ovo

Utilisez un rapporteur fluorescent, de préférence dans une transcription bicistronique ou fusionnée à la protéine d'intérêt avec un 2a virale intercalant peptide ^11, pour permettre l'identification rapide des individus avec des niveaux satisfaisants de transfection. REMARQUE: Le temps d'incubation typique pour ce stade est d'environ 48 heures à 37,8 ° C.

1. Ouvrir une petite fenêtre dans les œufs après avoir enlevé 3 ml d'albumine avec une seringue couplée à un 18 G x 1 1/2 aiguille. Pour améliorer la visualisation embryon, injecter une petite quantité d'encre de Chine diluée à 1:50 dans la solution de Ringer stérile sous l'embryon ^1-4.
2. Après avoir recouvert l'embryon avec une solution de Ringer stérile, injecter une solution 10 mM Tris-HCl, pH 8,2 et 0,1% de colorant alimentaire (F, D & C) contenant 2,5 pg / pl d'ADN à travers l'extrémité postérieure du tube neural jusqu'à ce qu'il remplissejusqu'à la région du cerveau postérieur. Pour l'électroporation, des électrodes de platine de positionnement (0,5 mm) de diamètre 4 mm séparées par ^une région le long du flanc et de fournir des impulsions de 5 à 50 ms et 20 V avec un intervalle de 100 ms entre les ^quatre.
3. Après électroporation, incuber embryons manipulés pendant 48 heures de plus jusqu'à ce qu'ils atteignent HH23 de stade et d'identifier les personnes présentant un niveau élevé de transfection à la région flanc sous un stéréomicroscope fluorescent.
   REMARQUE: La durée d'incubation après l'électroporation dépend du but de l'expérience. Les plasmides par électroporation peuvent générer des niveaux d'expression importants après 2 h ^2. Ainsi, si l'intérêt réside dans les gènes de l'apparition précoce de la période d'incubation post-électroporation peut être réduite.

2. Récolte succès transfectées embryons et disséquer les moitiés de la moelle épinière électroporation

Remarque: Cette procédure dure 2 à 3 heures pour 10 embryons et les rendements 1-2 Ug d'ARN total par embryon. La dissection de tubes neuraux nécessite des mouvements fins et quelques séances de pratique peut être nécessaire avant de l'appliquer à des échantillons expérimentaux.

1. Décontaminer les outils de dissection métalliques avec une solution de décontamination RNase ou par cuisson à 150 ° C pendant 4 heures et ¹² préparer traitée au DEPC PBS. Utilisez uniquement du matériel en plastique sans RNase certifié.
   NOTE: Après la récolte, il est important de suivre un traitement standard pour prévenir la contamination RNase lors de la dissection.
2. Récolter les embryons en utilisant une paire de ciseaux fins de dissection et une collection cuillère tamisé. Gardez les embryons dans le froid traitée au DEPC PBS dans une boîte de 100 mm de Pétri.
3. Avec une paire de pinces fines, découper la région du flanc ensemble (entre la limite postérieure du bourgeon de membre antérieur et la limite antérieure du bourgeon de membre postérieur) et transférer cette section à un nouveau plat contenant froid traitée au DEPC PBS.
4. Utilisez deux aiguilles fines de verre de perforer à trois différentsles points de chaque côté dorsolatéral de l'embryon entre le tube neural et le mésoderme paraxial.
5. Introduire les deux aiguilles de verre dans la perforation centrale et se déplacent lentement l'un d'entre eux une distance le long de l'axe antéro-postérieur du tube neural. Répétez cette opération pour les perforations qui ne sont pas atteints par les premiers mouvements. Retirez le mésoderme paraxial individuelle avec une paire de pinces fines.
6. Tourner l'embryon côté, insérer les extrémités des pinces entre le tube neural et la notochorde et faites-les glisser dans des directions opposées le long de l'axe antéro-postérieur de séparer les deux structures.
   NOTE: Ce devrait également éliminer la plupart du mésoderme encore attachés au tube neural.
7. Si nécessaire, retirez les morceaux plus gros de tissu mésodermique qui restent attachées en tirant avec une pince à épiler tout en tenant légèrement le tube neural avec une autre paire de pinces. Lorsque vous avez terminé, doucement transférer le tube neural à un autre plat contenant PBS froid de DEPC-traités à l'aide d'unRNase-free pipette Pasteur en verre reliée à une pompe manuelle de la pipette et de garder sur de la glace jusqu'à ce que tous les tubes sont disséqués.
8. Diviser les tubes neuraux en deux moitiés. Pour cela, insérez la pointe acérée d'une paire de pinces fermé dans la lumière et ouvrir la plaque de toit en déplaçant les pinces à travers elle. Après cela, séparer les deux moitiés en coupant la plaque de fond avec les pincettes conseils.
9. Trier électroporation moitiés de non-électroporation sous un microscope à dissection à fluorescence et le transfert d'un tube de 1,5 ml rempli avec glacée traitée au DEPC PBS. Si nécessaire, feuilleter les microtubes doucement pour libérer tous les tissus fixés aux parois en matière plastique et de favoriser la sédimentation des tubes.
10. Spin à 100 g pendant 3 secondes et enlever très lentement autant que possible PBS avec 1 ml micropipette. Pour ce faire, tout en regardant une source de lumière qui brille à travers le microtube pour surveiller si tout matériel embryonnaire est aspiré à la pointe de la pipette; si cela se produit, décharger lentement et répéter la centrifugation.
11. Ajouter 70 ul de solution de lyse pour l'extraction de l'ARN par neural moitié du tube et secouez le tube pour mélanger le contenu. Incuber à température ambiante pendant 5 min et vigoureusement vortex. Répéter l'incubation de 5 min et agitation au vortex à deux reprises. Conserver à -80 ° C.
12. Recueillir au moins huit moitiés du tube neural par exemple pour assurer un rendement adéquat pour l'étape suivante. En commun des échantillons plus petits si plusieurs sessions électroporation / dissection doivent amasser un nombre suffisant de tubes neuraux. Stocker suffisamment d'échantillons pour des doubles ou des triples exemplaires pour chaque condition.

3. Purifier l'ARN et préparer des banques pour Illumina séquençage

1. Retirer les échantillons de -80 ° C stockage et placer sur la glace pendant 15-30 min. Reprendre décongélation à température ambiante jusqu'à la fin.
2. Vortex bien et laissez à température ambiante pendant 5 min. Vortex nouveau et centrifuger à 15 000 g pendant 1 min à granulés insoluble.
3. Transférer le surnageant dans un nouveau tubeet procéder à l'extraction de l'ARN selon le total isolement d'ARN instructions du manuel du kit. On élue dans le volume minimum recommandé pour augmenter la concentration.
   REMARQUE: traitement à la DNase après nettoyage est recommandé afin d'éviter la contamination potentielle des séquences d'ADN génomique dans les ensembles de données d'ARN-Seq.
4. Feuilletez le tube pour mélanger le contenu et enlever 5 pi pour l'analyse de contrôle de la qualité. Conserver l'échantillon restant à -80 ° C jusqu'à ce que la préparation bibliothèque; Ces échantillons doivent être décongelés que une fois pour éviter la dégradation de l'ARN.
5. Exécutez ARN purifié dans un instrument Bioanalyzer utilisant le kit RNA 6000 Nano; Valeur RIN doit être au moins au-dessus de 7 pour continuer.
6. Générer des bibliothèques en utilisant un kit de préparation de bibliothèque Illumina compatible ARN-Seq et multiplexer jusqu'à 4 bibliothèques dans une voie d'un instrument de HiSeq mis à produire 100 pb seul lit. Si possible, inclure tous les échantillons dans la même série de minimiser les artefacts techniques potentiels.
   NOTE: Ce devrait produire jusqu'à 50 millions de rEADS par exemple, qui est plus que suffisant pour obtenir une couverture pour la plupart des gènes ^13.

4. Comparer les ensembles de données d'ARN-Seq dans le serveur Galaxy publique ^10.

REMARQUE: l'espace de stockage du serveur est limité et expériences comparant de nombreux échantillons peut exiger la suppression des fichiers intermédiaires générés dans les étapes de filtrage.

1. Créez un compte d'utilisateur dans le serveur public Galaxy ( https://usegalaxy.org ) et FTP télécharger les jeux de données Illumina au format fastq.
2. Préparer les fichiers téléchargés avec l'outil FastqGroomer ¹⁴ sous la NGS: Menu QC et la manipulation; si les scores de qualité sont déjà codés dans Phred + 33 (Sanger), ignorez cette étape en changeant simplement le type de fichier à fastqsanger sous les attributs de chaque ensemble de données.
3. Analyser la qualité générale de chaque ensemble de données en utilisant l'outil FastQC sous la NGS: QC et manipulation moinu.
   REMARQUE: Une attention particulière doit être accordée aux graphiques qui en résultent pour le contenu de la séquence par la qualité de la séquence de base et par la base, car ceux-ci de fournir des estimations pour les paramètres utilisés pour tailler les extrémités du lit.
4. Garniture lit à jeter des extrémités 3 'des données de faible qualité à l'aide de l'outil FASTQ qualité Trimmer ¹⁴ sous la NGS: Menu QC et manipulation. Régler l'outil de ne traiter que des extrémités 3 'pour le niveau de qualité en dessous de 20.
5. Retirer séquences d'adaptation de lit à l'aide de l'outil Clip ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) sous la NGS: Menu QC et manipulation. Régler l'outil à jeter lit à moins de 45 pb à gauche, saisir la séquence de l'adaptateur utilisé et choisir la sortie d'inclure les deux séquences coupées et non tronquée. En outre, choisir de ne pas jeter des séquences avec des bases inconnues puisque la plupart des bases de faible qualité ont déjà été supprimés dans la dernière étape.
6. Utilisation de l'outil séquences TRIM ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) sous la NGS: QC et le menu de manipulation, couper les premières bases de la lecture de se retirer 5 partialité »de séquence détectée par FastQC (généralement 10).
   NOTE: A ce stade, il est une bonne idée de lancer FastQC nouveau et comparer avec l'analyse précédente pour déterminer si la qualité de l'ensemble de données a été améliorée.
7. Téléchargez et décompressez la dernière assemblée du génome du poulet pour le navigateur de génome UCSC d'Illumina iGenomes ( http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn ) et télécharger l'ensemble du fichier de format fasta génome et le fichier d'annotation des gènes de format gtf à l'histoire Galaxy utilisant le fichier de téléchargement de l'outil dans le menu Get Data.
8. Carte lit pour chaque échantillon pour le génome du poulet à l'aide du dispositif d'alignement ¹⁵ sous TopHat2les NGS: Menu Analyse ARN. Choisissez d'utiliser un génome de l'Histoire (sélectionnez le fichier fasta téléchargé à l'étape 4.7).
9. Construire un transcriptome prédite pour chaque échantillon à l'aide de manchette ¹⁶ sous les NGS: Menu Analyse ARN. Choisissez d'utiliser l'annotation de référence comme guide (sélectionnez le fichier téléchargé à l'étape gtf 4.7) et tourner sur les options Effectuer correction du biais (de l'Histoire, fichier fasta de l'étape 4.7) et multi-usage lire correct.
10. Fusionner transcriptomes prévues pour tous les échantillons à l'aide Cuffmerge ¹⁶ sous la NGS: Menu ARN analyse. Choisissez d'utiliser l'annotation de référence (fichier gtf de l'étape 4.7) et les données de séquence (de l'Histoire, fichier fasta de l'étape 4.7).
11. Comparer les fichiers générés par BAM TopHat2 pour chaque échantillon en utilisant Cuffdiff ¹⁶ sous la NGS: Menu ARN analyse. Dans les transcriptions de terrain sélectionner le moitranscriptome rged généré par Cuffmerge et activer les options Effectuer correction du biais (de l'Histoire, fichier fasta de l'étape 4.7) et multi-usage lire correct.
12. Trier expression différentielle tester tables numérique croissant dans la colonne 13 (valeur de q) à l'aide de l'outil Trier sous le filtre et le menu Trier.
    NOTE: Les gènes / transcriptions montrant une expression différentielle significative entre les conditions expérimentales présentera les valeurs de q plus bas.
13. Pour vérifier les résultats visuellement avec des graphiques de couverture, d'abord convertir les fichiers au format BAM bedGraph utilisant l'outil Créer une BedGraph de couverture du génome ¹⁷ sous le menu bedtools. Désactiver le rapport de régions sans couverture, choisir de traiter les entrées d'épissage que des intervalles distincts et l'échelle de la couverture par un facteur qui normalise profondeur de séquençage pour tous les ensembles de données comparées.
14. Convertir le fichier résultant au format bedGraph Bigwig l'aide de laoutil perruque / BedGraph à gros bonnet ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) dans le menu des formats de convertir. Téléchargez les fichiers gros bonnets comme des pistes coutume dans le navigateur de génome UCSC ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) pour l'assemblage galGal4 et rechercher un gène d'intérêt à visualiser la couverture dans les ensembles de données.

Résultats

Pour valider la méthode décrite, deux échantillons de contrôle ont été générés à partir d'embryons électroporées avec le vecteur PMES vide ⁷ et un échantillon à partir d'embryons transfectées avec le même vecteur contenant l'insert construire SCRT2-ZNF, qui code pour les domaines en doigt de zinc de poulet SCRT2 ^18. Les échantillons donnant des 11 à 22 pg d'ARN total ont été obtenus chacun à partir de pools de 8 à 12 embryons. Les trois échantillons ont obtenu...

Discussion

Ici nous fournissons des lignes directrices pour l'analyse des effets après l'électroporation de la poule de la moelle épinière. Bien que l'électroporation de vecteurs d'ADN est plus fréquemment utilisé pour surexprimer un gène d'intérêt, on peut aussi utiliser des constructions codant des dominants négatifs, protéines quimeric ou précurseurs de siRNA pour créer les conditions fonction des gènes knock-down ^19-21. En effet, la comparaison des profils de transcriptome résulta...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Indian ink	Any supplier
18G x 1 1/2 needle	BD	305196
3 ml syringe	BD	309657
Tris	MP Biomedicals	819620
F D & C Blue 1	Spectra Colors Corporation	5.FC.0010P0	Food Dye used to visualize DNA injection
Ringer's solution (1 L)
- 7.2 g NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
- 0.37 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
- 0.225 g CaCl2•2H2O	Fisher Scientific	10043-52-4
- 0.217 g Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0.02 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
- ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4
- ddH2O to 1 L
- Filter and autoclave
PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L)
- 8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
- 0.2 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
- 1.15 g Na2HPO4•7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0.2 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
- ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2
- ddH2O to 1 L and filter
- 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate)	Sigma-Aldrich	D-5758
- Shake vigorously and let stand overnight at room temperature
- Autoclave
Sieved spoon	Any supplier
Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes	Corning Life Sciences	351007
RNaseZap RNase decontamination solution	Life Technologies	AM9780
Fine point surgical scissors	Any supplier
Straight fine point tweezers	Any supplier
Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes	Kimble Chase	40A502
9'' glass Pasteur pipette	Any supplier
Manual pipette pump	Any supplier
Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes	Corning Life Sciences	MCT-150-C
Microcentrifuge	Any supplier
RNAlater solution for RNA stabilization	Life Technologies	AM7020
RNAqueous total RNA isolation kit	Life Technologies	AM1912
Molecular Biology Grade Ethanol	Any supplier
RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies	5067-1511
2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies	G2939AA
Truseq RNA Sample Preparation Kit v2	Illumina	RS-122-2001/RS-122-2002