RNA-Seq Analyse der differentiellen Genexpression in elektroporiertem Küken Embryonale Spinal Cord

Zusammenfassung

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

Zusammenfassung

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

Einleitung

Genetische Untersuchungen an lebenden Organismen verwenden häufig den Hühnerembryo als Modell, weil in ovo Elektroporation stellt eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit, um embryonale Strukturen teilweise Transfektion in vivo mit DNA-Konstrukte ^1-5. Bicistronische Expressionsvektoren, die ein Transkript, das ein fluoreszierendes Reporter zusammen mit dem Gen von Interesse, wie pCIG ⁶ oder Pmes ⁷ kodieren, ermöglichen eine schnelle Überprüfung der Transfektion Qualität in der gewünschten Region unter einem Stereomikroskop vor der Verarbeitung Embryonen für Downstream-Analyse.

Mit den jüngsten Fortschritten in der DNA-Sequenzierung ist es nun möglich, digitale gesamte Transkriptom Expressionsprofile von RNA-Proben unter Verwendung von RNA-Seq ^8,9 erhalten. Statt also zeitaufwendige Verfahren, die Analyse von nur wenigen Genprodukte parallel ermöglichen, wie in situ Hybridisierung, Immunhistochemie und qPCR, Herstellung von cDNA-Bibliotheken fürHochdurchsatz-Sequenzierung kann Informationen des gesamten Transkriptoms. Beobachtung der experimentellen Effekte auf die Expression von jedem einzelnen Gens kann wiederum bieten leistungsstarke Einblicke in die Wege, durch das Konstrukt verwendet verändert. Dies ist besonders einfach, wenn eine genomische Anordnung für den verwendeten Organismus ist, wiederum ist damit der Hühnerembryo ein geeignetes Modell.

Wenn der Benutzer Zugang zu einer zuverlässigen Genomsequenzierung Zentrum hat, ist das Hauptproblem hoher Qualität zu erhalten RNA-Proben. Diese Arbeit zeigt, ein Verfahren zur Gewinnung von RNA Proben transfiziert Neuralrohren für RNA-Seq sowie den nachgeschalteten Schritten zur in silico Analyse der resultierenden Datensätze. Nach Elektroporation bei HH12-13 gefolgt von 48 h Inkubation wurden die transfizierten Stamm Rückenmarkshälften in Ribonuklease freien Bedingungen seziert sofort lysiert und weiteren Abbau durch ultra-niedrigem Gefrierpunkt geschützt, bis RNA-Reinigung und Bibliotheks preparatIonen.

Das Galaxy öffentlichen Server ¹⁰ bietet Zugriff auf kostenlose Ressourcen für die Analyse von Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten. Die Menge an Speicherplatz für registrierte Benutzer angeboten wird, genug für kleine Versuchs wodurch die Notwendigkeit für die lokalen Computerinfrastruktur. RNA-Seq Datenanalyse umfasst Filterung, Ausrichtung und Quantifizierung / Vergleich der Genexpression. Obwohl es allgemeine Richtlinien für die RNA-Seq Datenanalyse, werden Filterparameter hängen weitgehend von der Qualität der Sequenzierungs und sollte nach Qualitätskontrollanalyse der Ausgangsdaten bestimmt werden.

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, um zu erhalten und vergleichen RNA-Seq Profile embryonalen Hühnerrückenmark in vivo transfiziert. Als repräsentative Ergebnis Vergleich der Datensätze von zwei unabhängigen Kontrollproben mit einem leeren Vektor transfiziert zeigte, daß das Verfahren ist reproduzierbar und sollten Identifizierung differentiell Expres ermöglichensed-Transkripte in experimentellen Proben. Daher Anwendung dieser Methode hat das Potential, die Anzahl von Entdeckungen nach einem einzigen Versuch stark erhöhen und somit eine große Menge von Daten für nachfolgende Untersuchungen.

Protokoll

1. elektroporieren das Konstrukt von Interesse in der Neural Tuben HH12-13 Hühnerembryonen in ovo

Verwenden Sie einen fluoreszierenden Reporter, vorzugsweise in einem bicistronischen Transkript oder mit einem interkalierenden viralen 2a Peptid ¹¹ an das Protein von Interesse fusioniert, um eine schnelle Identifizierung von Personen mit zufriedenstellenden Niveaus der Transfektion zu ermöglichen. Anmerkung: Typische Inkubationszeit für diese Stufe ist etwa 48 Stunden bei 37,8 ° C.

1. Öffnet sich ein kleines Fenster in der Eier nach dem Entfernen 3 ml Albumin mit einem zu einer 18 G x 1 1/2 Nadelspritze verbunden. Embryo Darstellung zu verbessern, zu injizieren eine kleine Menge Tusche 1:50 in steriler Ringerlösung unterhalb des Embryos ^1-4.
2. Nach Abdecken der Embryo mit steriler Ringerlösung injizieren einen 10 mM Tris-HCl, pH 8,2, und 0,1% Lebensmittelfarbstoff (F, D & C) Lösung, die 2,5 ug / ul DNA durch das hintere Ende des Neuralrohrs, bis es fülltbis zu dem Hinterhirn Region. Zu elektroporieren, die Position von Platinelektroden (0,5 mm Durchmesser) von 4 mm ¹ getrennt entlang der Flankenbereich und liefern 5 Impulsen von 50 ms und 20 V mit einem Intervall von 100 msec zwischen ihnen ^4.
3. Nach der Elektroporation inkubieren manipulierten Embryonen für 48 Stunden mehr, bis sie Stufe HH23 erreichen und identifizieren Personen präsentiert hohe Transfektion im Flankenbereich unter einem Fluoreszenzstereomikroskop.
   HINWEIS: Die Dauer der Inkubation nach der Elektroporation hängt vom Ziel des Versuchs. Die elektroporierten Plasmide können signifikante Expressionsniveaus nach 2 h ² zu erzeugen. Wenn daher das Interesse liegt in frühen Beginn der Gene nach der Elektroporation Inkubationszeit kann reduziert werden.

2. Ernte erfolgreich transfizierter Embryonen und sezieren die elektroporiertem Spinal Cord Halbiert

HINWEIS: Dieser Vorgang dauert 2-3 Stunden für jeweils 10 Embryonen und Erträge 1-2 Ug Gesamt-RNA pro Embryo. Die Präparation der Neuralrohren erfordert feinen Bewegungen und einige Trainingseinheiten können, bevor sie auf experimentellen Proben notwendig sein.

1. Dekontamination von metallischen Dissektionswerkzeuge mit RNase Dekontaminationslösung oder durch Einbrennen bei 150 ° C für 4 h ¹² und bereiten DEPC behandeltem PBS. Verwenden Sie nur neue zertifizierte RNase-freie Kunststoffgeschirr.
   HINWEIS: Nach der Ernte ist es wichtig, eine Standardbehandlung folgen, um RNase Kontamination während Dissektion zu verhindern.
2. Ernten Sie die Embryonen mit einem Paar feine Präparierscheren und gesiebt Sammlung Löffel. Halten Sie die Embryonen in kaltem DEPC-behandeltem PBS in einer 100 mm Petrischale.
3. Mit einer feinen Pinzette, schneiden Sie die gesamte Flankenbereich (zwischen der hinteren Grenze des vorderen Extremitätenknospe und die vordere Grenze des hinteren Gliedmaßenknospe) und übertragen Sie diesen Abschnitt, um eine neue Schale mit kaltem DEPC-behandeltem PBS.
4. Verwenden Sie zwei feinen Glasnadeln an drei verschiedenen perforierenPunkte auf jeder dorsolateralen Seite des Embryos zwischen dem Neuralrohr und paraxiale Mesoderm.
5. Führen Sie die beiden Glas Nadeln in der zentralen Perforation und langsam bewegen einer von ihnen weg entlang der Neuralrohr anterior-posterioren Achse. Wiederholen Sie dies für die Perforationen, die nicht von den ersten Sätzen erreicht wurden. Entfernen Sie das freistehende paraxialen Mesoderm mit einer feinen Pinzette.
6. Drehen Sie den Embryo seitwärts, legen die Spitzen der Pinzette zwischen dem Neuralrohr und der Chorda und schieben Sie sie in entgegengesetzte Richtungen entlang der anterior-posterioren Achse, die beiden Strukturen zu trennen.
   HINWEIS: Dies sollte auch die Abschaffung der meisten der Mesoderm noch mit dem Neuralrohr angebracht.
7. Entfernen Sie gegebenenfalls gröberen mesodermic Gewebe, das durch Ziehen mit einer Pinzette unter leichtem Halten des Neuralrohr mit einer anderen Pinzette befestigt bleiben. Wenn Sie fertig sind, übertragen Sie leicht das Neuralrohr an eine andere Schale mit kaltem DEPC-behandeltem PBS mit einemRNase-freie Glaspasteurpipette zu einer manuellen Pipette Pumpe gekoppelt und halten Sie auf Eis, bis alle Rohre werden seziert.
8. Teilen Sie die Neuralrohren in zwei Hälften. Dazu legen Sie die scharfe Spitze eines geschlossenen Pinzette in das Lumen und öffnen Sie die Dachplatte, indem Sie die Pinzette heraus durch sie. Danach trennen Sie die Hälften durch Schneiden der Bodenplatte mit der Pinzette Tipps.
9. Art, die aus nicht-elektroporiert Hälften unter einem Fluoreszenz Binokular und in ein 1,5-ml-Röhrchen mit eiskaltem DEPC-behandeltem PBS gefüllt elektroporiert. Falls nötig, schlagen Sie das Mikroröhrchen vorsichtig, um jedes Gewebe an den Kunststoffwänden befestigt zu lösen und Sedimentation der Rohre zu fördern.
10. Spin bei 100 × g für 3 sec und sehr langsam zu entfernen, so viel wie möglich PBS mit einer 1 ml Pipette. Tun Sie dies, während man eine Lichtquelle, die durch den Mikroröhrchen glänzt zu überwachen, wenn eine embryonale Material auf die Pipettenspitze gesaugt; Wenn dies geschieht, langsam entladen und wiederholen Sie den centrifugation.
11. In 70 ul Lyse-Lösung für die RNA-Extraktion pro Neuralrohr Hälfte und Flick das Rohr, um den Inhalt zu mischen. Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min und kräftig vortexen. Wiederholen Sie den 5 min Inkubation und Vortexen zwei weitere Male. Bei -80 ° C.
12. Sammeln mindestens acht Neuralrohr Hälften pro Probe, um eine ausreichende Ausbeute für den nächsten Schritt zu gewährleisten. Pool kleinere Proben, wenn mehrere Elektroporation / Dissektion Sitzungen sind erforderlich, um eine ausreichende Anzahl von neuronalen Rohre anzuhäufen. Bewahren ausreichende Proben für Duplikate oder dreifach für jede Bedingung.

3. Entschlacken RNA und Planen Bibliotheken für Illumina Sequenzierung

1. Proben von -80 ° C Lagerung entfernen und auf Eis für 15-30 min. Wieder Auftauen bei Raumtemperatur bis zur Beendigung.
2. Vortex gut und bei Raumtemperatur lassen Sie für 5 min. Vortex wieder und Zentrifuge bei 15.000 g für 1 min, um unlösliches Material zu pelletieren.
3. Den Überstand in ein neues Röhrchenund RNA-Extraktion gehen nach der Gesamt-RNA Isolation Kit manuelle Anweisungen. Eluieren in der empfohlenen Mindestvolumen, um die Konzentration zu erhöhen.
   HINWEIS: DNase-Behandlung nach clean-up ist, um eine mögliche Kontamination von genomischer DNA-Sequenzen in RNA-Seq Datensätze zu vermeiden empfohlen.
4. Flick das Rohr, um den Inhalt zu mischen und zu entfernen 5 ul für die Qualitätskontrolle-Analyse. Bewahren Sie die restliche Probe bei -80 ° C bis Bibliothek Vorbereitung; Diese Proben sollten nur einmal aufgetaut werden, um RNA-Abbau zu vermeiden.
5. Führen gereinigte RNA in einem Bioanalyzer Instrument mit dem RNA 6000 Nano Kit; RIN-Wert muss mindestens über 7, um fortzufahren.
6. Generieren Sie Bibliotheken mit einem Illumina kompatiblen RNA-Seq-Bibliothek Vorbereitung Kit und multiplexen bis zu 4-Bibliotheken in einer Spur eines HiSeq Instrument auf 100 bp Einzel liest erzeugen. Wenn möglich, schließen Sie alle Proben im gleichen Lauf um mögliche technische Artefakte zu minimieren.
   HINWEIS: Diese sollte auf 50 Mio. r ergeben sichEADS pro Probe, die mehr als genug, um die Abdeckung für die meisten Gene ¹³ zu erhalten.

4. Vergleichen RNA-Seq Datasets in der Galaxy Public Server ^10.

ANMERKUNG: Server Speicherplatz ist begrenzt und Experimente zu vergleichen viele Proben eine vollständige Löschung des Zwischendateien in den Filterschritte generiert erfordern.

1. Erstellen Sie ein Benutzerkonto in der Galaxy öffentlichen Server ( https://usegalaxy.org ) und FTP-Upload der Illumina-Datasets in fastq Format.
2. Bereiten Sie hochgeladene Dateien mit dem FastqGroomer ¹⁴ Tool unter der NGS: QC und Manipulation Menü; wenn die Qualitätswerte sind bereits in Phred + 33 (Sanger) codiert, überspringen Sie diesen Schritt durch einfache Änderung der Dateityp unter den Attributen für jeden Datensatz fastqsanger.
3. Analysieren Sie die allgemeine Qualität der jeden Datensatz mit der FastQC Tool unter der NGS: QC und Manipulation michnu.
   HINWEIS: Besondere Aufmerksamkeit sollte der resultierenden Grafik für pro Basensequenz Qualität und pro Basensequenz Inhalt gegeben werden, da diese Schätzungen für die zum Beschneiden der Enden der liest verwendeten Parameter bereitzustellen.
4. Trim liest verwerfen 3'-Enden mit Qualitätsdaten günstig mit der fastq Qualität Trimmer ¹⁴ unter der NGS: QC und Manipulation Menü. Stellen Sie das Werkzeug, um nur bearbeiten, 3'-Enden für den Qualitätsfaktor unter 20.
5. Entfernen Adaptersequenzen aus liest mit Hilfe des Tools Clip ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) unter der NGS: QC und Manipulation Menü. Stellen Sie das Werkzeug, um zu verwerfen liest mit weniger als 45 bp nach links, geben Sie die Sequenz der verwendeten Adapter und wählen Sie den Ausgang, beide abgeschnitten und nicht-begrenzten Sequenzen umfassen. Außerdem entscheiden nicht auf Sequenzen mit unbekannten Basen zu verwerfen, da die meisten geringer Qualität Basen wurden bereits im letzten Schritt entfernt.
6. Verwenden der Werkzeug Trim-Sequenzen ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) unter der NGS: QC und Manipulation Menü schneiden Sie die ersten Grundlagen der liest bis 5 'von FastQC detektierten Sequenz Bias (typischerweise 10) zu entfernen.
   HINWEIS: An dieser Stelle ist es eine gute Idee, FastQC erneut ausführen und Vergleichen mit der vorherigen Analyse zu bestimmen, ob die Datenmenge Qualität wurde verbessert.
7. Laden und entpacken Sie die neuesten Hühnergenom Anordnung für die UCSC Genom-Browser von Illumina iGenomes ( http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn ) und laden Sie das gesamte Genom fasta Formatdatei und die Gene Annotation GTF Formatdatei durch die Galaxis Geschichte mit der Upload File unter dem Get Data-Menü.
8. Karte liest für jede Probe, um das Huhn-Genom mit Hilfe der Ausrichter TopHat2 ¹⁵ unterdie NGS: RNA-Analyse-Menü. Wählen Sie, um ein Genom aus der Geschichte zu verwenden (wählen Sie die fasta Datei in Schritt 4.7 hochgeladen).
9. Baue eine vorhergesagte Transkriptom für jede Probe mit Manschettenknöpfe ¹⁶ unter den NGS: RNA-Analyse-Menü. Wählen Sie den Bezugsanmerkung als Richtlinie verwenden (wählen Sie die GTF-Datei in Schritt 4.7 hochgeladen) und schalten Sie die Optionen Führen Bias-Korrektur (aus der Geschichte, fasta Datei aus Schritt 4.7) und Verwenden Mehr lesen richtig.
10. Merge prognostiziert Transkriptomen für alle Proben mit Cuffmerge ¹⁶ unter der NGS: RNA-Analyse-Menü. Wählen Sie den Bezugsanmerkung (GTF-Datei aus Schritt 4.7) und die Sequenzdaten (aus der Geschichte, fasta Datei aus Schritt 4.7) zu verwenden.
11. Vergleichen BAM Dateien TopHat2 für jede Probe mit Cuffdiff ¹⁶ unter der NGS generiert: RNA-Analyse-Menü. Bei den Feld Transcripts wählen michrged Transkriptom von Cuffmerge generiert und schalten Sie die Optionen Führen Bias-Korrektur (aus der Geschichte, fasta Datei aus Schritt 4.7) und Verwenden Mehr lesen richtig.
12. Sortieren differentielle Expression Testen Tabellen numerisch aufsteigend in Spalte 13 (Q-Wert) mit dem Werkzeug Sortieren unter dem Filter und Menü sortieren.
    HINWEIS: Gene / Transkripte, die signifikante differentielle Expression zwischen experimentellen Bedingungen werden die niedrigsten q-Werte zu präsentieren.
13. Um die Ergebnisse visuell mit Abdeckung Graphen zu überprüfen, zuerst konvertieren BAM Dateien bedGraph Format mit dem Werkzeug erstellen BedGraph der Genomabdeckung ¹⁷ unter dem Menü bedtools. Deaktivieren Meldung von Regionen ohne Abdeckung, wählen zu verbindenden Einträge im Unterschied Abständen zu behandeln und zu skalieren die Deckung durch einen Faktor, der Sequenzierung Tiefe für alle Datensätze, die verglichen werden normalisiert.
14. Konvertieren Sie die resultierende bedGraph Datei an bigwig Format unter Verwendung derWerkzeug Perücke / BedGraph-to-Bonzen ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) unter dem Menü Formate konvertieren. Laden Sie die Dateien als individuelle bigwig Spuren im UCSC Genom-Browser ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) für die galGal4 Montage und suchen ein Gen von Interesse, um die Abdeckung in den Datensätzen zu visualisieren.

Ergebnisse

Um die beschriebene Methode zu validieren, wurden zwei Kontrollproben aus Embryonen mit dem leeren Vektor Pmes ⁷ und eine Probe von Embryonen mit dem gleichen Vektor, der die Einlage zu konstruieren SCRT2-ZNF, die die Zinkfinger-Domänen von Hühner SCRT2 ¹⁸ kodiert, transfiziert elektroporiert erzeugt. Proben ergab 11-22 ug Gesamt-RNA wurden jeweils aus Pools von 8 bis 12 Embryonen. Alle drei Proben erzielt eine optimale RIN-Wert von 10 in einer Qualitätsprüfung mit dem Bioanalyzer Gerät an

Diskussion

Hier bieten wir Richtlinien zur Analyse Wirkungen nach der Elektroporation des Huhns Rückenmark. Obwohl Elektroporation von DNA-Vektoren wird häufiger verwendet, um ein Gen von Interesse überexprimieren, kann man auch Konstrukte dominant Negativen quimeric Proteine ​​oder Vorstufen Codierung verwenden für siRNAs zur Genfunktion knock-down Bedingungen ^19-21 erzeugen. In der Tat kann den Vergleich der Transkriptom Profile sowohl Verstärkungs- und Verlust der Funktionsanalyse resultierenden darauf hin G...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Indian ink	Any supplier
18G x 1 1/2 needle	BD	305196
3 ml syringe	BD	309657
Tris	MP Biomedicals	819620
F D & C Blue 1	Spectra Colors Corporation	5.FC.0010P0	Food Dye used to visualize DNA injection
Ringer's solution (1 L)
- 7.2 g NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
- 0.37 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
- 0.225 g CaCl2•2H2O	Fisher Scientific	10043-52-4
- 0.217 g Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0.02 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
- ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4
- ddH2O to 1 L
- Filter and autoclave
PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L)
- 8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
- 0.2 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
- 1.15 g Na2HPO4•7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0.2 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
- ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2
- ddH2O to 1 L and filter
- 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate)	Sigma-Aldrich	D-5758
- Shake vigorously and let stand overnight at room temperature
- Autoclave
Sieved spoon	Any supplier
Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes	Corning Life Sciences	351007
RNaseZap RNase decontamination solution	Life Technologies	AM9780
Fine point surgical scissors	Any supplier
Straight fine point tweezers	Any supplier
Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes	Kimble Chase	40A502
9'' glass Pasteur pipette	Any supplier
Manual pipette pump	Any supplier
Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes	Corning Life Sciences	MCT-150-C
Microcentrifuge	Any supplier
RNAlater solution for RNA stabilization	Life Technologies	AM7020
RNAqueous total RNA isolation kit	Life Technologies	AM1912
Molecular Biology Grade Ethanol	Any supplier
RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies	5067-1511
2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies	G2939AA
Truseq RNA Sample Preparation Kit v2	Illumina	RS-122-2001/RS-122-2002