electroporation하여 병아리 배아 척수에서 차동 유전자 발현의 RNA-SEQ 분석

요약

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

초록

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

서문

OVO 전기에 DNA ^1-5을 구성하여 부분적으로 생체 내에서 배아 구조에 감염 될 수있는 빠르고 저렴한 방법을 나타 내기 때문에 살아있는 유기체에 유전 연구는 자주 모델로 닭 배아를 사용합니다. 이러한 pCIG ⁶ pMES ^7과 같은 목적 유전자와 함께 형광 리포터를 함유 한 증명서를 인코딩 시스 트론 발현 벡터, 하류 분석 배아를 처리하기 전에 실체 현미경을 이용하여 원하는 영역에 형질 전환 품질의 빠른 확인을 허용한다.

DNA 시퀀싱 최근 발전으로, 그것은 RNA-SEQ ^8,9을 사용하여 RNA 샘플들로부터 디지털 전 사체 발현 프로파일을 획득하는 것이 가능하다. 따라서, 대신 그러한 계내 혼성화, 면역 조직 화학 및 qPCR에,의 cDNA 라이브러리의 제조에서와 같이 병렬로 몇 유전자 산물의 분석을 가능하게 시간이 걸리는 방법높은 처리량 시퀀싱 전 사체의 정보를 제공 할 수있다. 모든 단일 유전자의 발현 수준에 대한 효과 실험 관찰 차례로 사용 구조체에 의해 변경 경로에 강력한 통찰력을 제공 할 수있다. 이 사용 유기체의 게놈 어셈블리를 사용할 수있는 경우 특히 쉽고, 따라서 병아리 배아는 다시 적당한 모델이다.

사용자가 신뢰할 수있는 게놈 시퀀싱 센터에 액세스하는 경우, 주요 문제는 고품질의 RNA 샘플을 획득한다. 본 연구는 생성 된 데이터 세트의 실리코 분석을 위해 RNA-SEQ 적합한 형질 신경 튜브뿐만 아니라 하류 단계로부터 RNA 샘플을 얻는 방법을 설명한다. 48 시간 배양 한 다음 HH12-13에 전기 한 후, 형질 전환 된 트렁크 척수 절반은, 리보 뉴 클레아가없는 상태에서 해부 즉시 용해 및 추가 RNA 정화 및 라이브러리는 준비 될 때까지 매우 낮은 동결에 의해 분해로부터 보호했다이온.

갤럭시 공공 서버 ^(10)는 높은 처리량 시퀀싱 데이터 분석을위한 무료 자원에 대한 액세스를 제공합니다. 등록 된 사용자를 위해 제공되는 공간의 크기는 국부적 계산 된 기반 구조에 대한 필요성을 제거, 소형 실험에 충분하다. RNA-SEQ 데이터 분석 필터링, 정렬 및 유전자 발현의 정량 / 비교를 포함한다. RNA-SEQ 데이터 분석에 대한 일반적인 가이드 라인이 있지만, 필터링 파라미터 시퀀싱의 품질에 크게 의존 할 것으로 예상되며, 원 데이터의 품질 관리 분석을 통해 결정되어야한다.

이 프로토콜은 획득 및 생체 내에서 형질 전환 닭의 배아 척수에서 RNA-SEQ 프로파일을 비교하는 단계에 대해 설명합니다. 대표적인 결과, 빈 벡터로 형질 개의 독립 제어 샘플들로부터 얻어진 데이터 세트의 비교 방법은 재현성 및 차등 EXPRES의 식별을 허용한다는 것을 보여 주었다실험 샘플에 나오지도 성적 증명서. 따라서, 이러한 방법의 응용이 크게 하나의 실험 후에 발견의 수를 증가하고, 따라서 후속 조사를 위해 큰 데이터 세트를 제공하는 잠재력을 가지고있다.

프로토콜

1. Electroporate HH12-13 닭 배아의 신경 튜브 OVO의 관심의 구조물

형질 전환의 만족 수준이 개인의 빠른 식별을 가능하게하기 위해, 바람직하게는 시스 트론 성적 증명서, 형광 기자를 사용하거나 인터 바이러스 2A 펩타이드 ^(11)와 함께 관심의 단백질에 융합. 참고 :이 단계에 대한 일반적인 배양 시간은 37.8 ° C에서 약 48 시간이다.

1. 18 G X 1 1/2 바늘에 연결된 주사기와 알부민의 3 ㎖를 제거한 후 계란에있는 작은 창을 엽니 다. 배아 시각화를 향상시키기 위해, 배아 ^1-4 아래 멸균 링거액에서 1:50 희석 인도 소량의 잉크를 분사.
2. 멸균 링거액과 배아를 커버 한 후, 2.5 μg의이 신경관의 후방 말까지 DNA가 채우기 / 때까지 μL를 포함하는 10 mM 트리스 - 염산, pH를 8.2 및 0.1 % 식품 염료 (F, D & C) 솔루션을 주입후뇌 지역까지. 상기 측면 영역을 따라 4mm ^(1)에 의해 분리 된 위치 백금 전극 (직경 0.5 mm)를 electroporate하고 ⁽⁴⁾ 사이의 100 밀리 초 간격으로 5 내지 50 밀리 초 펄스 및 20 V를 제공한다.
3. 전기 후, 그들은 무대 HH23에 도달 할 때까지 더 48 시간 동안 조작 배아를 배양시키고, 형광 실체 현미경을 이용하여 측면 지역에서 형질의 높은 수준을 제시 개인을 식별 할 수 있습니다.
   NOTE : 일렉트로 후 배양 기간은 실험의 목적에 의존한다. 일렉트로 플라스미드는 2 ^시간이 후에 상당한 발현 수준을 생성 할 수있다. 관심 조발성 유전자에 놓여 있다면 따라서, 이후 일렉트로 잠복기가 감소 될 수있다.

2. 수확 성공적으로 배아 형질과 일렉트릭 척수 반쪽을 해부하다

참고 :이 절차는 각 10 배아 및 수익률 1 ~ 3 시간까지 지속-2 배아 당 μg의 총 RNA. 신경 튜브의 해부는 좋은 움직임을 필요로하고 연습 세션은 실험 시료에 적용하기 전에해야 할 수 있습니다.

1. 의 RNase의 오염 제거 용액 또는 4 시간 ¹² 150 ℃에서 소성하여 금속 해부 도구의 오염을 제거하고 DEPC 처리 된 PBS를 준비합니다. 만 새로운 인증의 RNase없는 plasticware에 사용합니다.
   NOTE : 수확 후에는 박리시의 RNase 오염을 방지하기 위해 표준 치료를 수행하는 것이 중요하다.
2. 미세 해부 가위와 정립 수집 숟가락을 사용하여 배아를 수확. 100mm 페트리 접시에 차가운 DEPC 처리 된 PBS에서 배아를 보관하십시오.
3. 미세 핀셋으로 (전방 사지 꽃 봉 오리와 후방 사지 새싹의 전방 한계의 후방 한계 사이의) 전체 측면 영역을 잘라 차가운 DEPC 처리 된 PBS를 포함하는 새로운 요리에이 부분을 전송할 수 있습니다.
4. 세 가지를 관통하는 두 개의 미세 유리 바늘을 사용하여신경 튜브와 근축 중배엽 사이의 배아 각각의 배 외측면에 가리 킵니다.
5. 중앙 구멍에 두 개의 유리 바늘을 소개하고 천천히 신경관 전후방 축을 따라 그 중 하나를 멀리 이동합니다. 첫 번째 움직임에 의해 도달되지 않은 구멍에 대해이 단계를 반복합니다. 미세 핀셋으로 분리 된 근축 중배엽를 제거합니다.
6. 옆으로 배아를 돌려 신경관과 척색 사이의 핀셋의 끝을 삽입하고 두 개의 구조를 분리하는 전후방 축 방향의 반대 방향으로 그들을 밀어 넣습니다.
   참고 :이 또한 중배엽의 대부분은 여전히​​ 신경 튜브에 부착 제거해야합니다.
7. 필요한 경우 가볍게 핀셋의 또 다른 쌍의 신경 튜브를 잡고 핀셋으로 잡아 당겨 부착 된 상태로 유지 mesodermic 조직의 더 큰 조각을 제거합니다. 완료되면, 부드럽게를 사용하여 추운 DEPC 처리 된 PBS를 포함하는 다른 요리에 신경 튜브를 전송의 RNase없는 유리 파스퇴르 피펫은 수동 피펫 펌프에 연결된 모든 튜브 해부 될 때까지 얼음에 보관하십시오.
8. 두 부분으로 신경 튜브를 나눈다. 이를 위해, 루멘에 핀셋의 폐쇄 된 한 쌍의 날카로운 끝을 삽입하고 그것을 통해 핀셋을 이동하여 지붕 판을 엽니 다. 그 후, 핀셋 팁 바닥 판을 절단하여 절반을 분리.
9. 정렬 얼음처럼 차가운 DEPC 처리 된 PBS로 가득 1.5 ML 튜브에 형광 해부 범위 및 전송에서 비 일렉트로 반쪽에서 일렉트로. 필요한 경우, 플라스틱 벽에 부착 된 조직을 분리하고 튜브의 침전을 촉진하기 위해 부드럽게 마이크로 튜브를 가볍게.
10. 3 초 동안 100 XG에 스핀과 1 ml의 마이크로 피펫으로 가능한 한 PBS로 매우 천천히 제거합니다. 어떤 배아 물질이 피펫 팁에 흡입되어있는 경우 모니터하기 위해 마이크로 튜브를 통해 빛난다 광원을보고하는 동안이 작업을 수행; 이 경우, 천천히 방전 centrifuga를 반복기.
11. 신경관 절반 당 RNA 추출을위한 분해 용액 70 μl를 추가하고 내용을 혼합 튜브를 가볍게. 격렬하게 5 분와 소용돌이 실온에서 인큐베이션. 5 분 배양과 와동 두 번 더 반복합니다. -80 ° C에서 보관하십시오.
12. 다음 단계에 대한 충분한 수율을 보장하기 위해 샘플 당 최소 8 신경관 반쪽를 수집합니다. 여러 전기 / 해부 세션이 신경 튜브의 충분한 수를 축적해야하는 경우 작은 샘플을 풀. 각 조건에 대한 중복 또는 삼중 충분한 샘플을 보관합니다.

3. Purify는 RNA와 Illumina의 시퀀싱 라이브러리를 준비

1. -80 ° C 저장에서 샘플을 제거하고 15 ~ 30 분 동안 얼음에 배치합니다. 완료 될 때까지 실온에서 해동을 다시 시작합니다.
2. 와동 잘 5 분 동안 실온에서 떠난다. 1 분 15,000 XG에 다시 소용돌이 원심 분리기는 불용성 물질을 펠렛.
3. 새로운 튜브에 뜨는을 전송및 총 RNA 분리 키트 설명서 지침에 따라 RNA 추출을 진행합니다. 농도를 증가시키기 위해 최소의 부피로 용출시켰다.
   NOTE : 청소 후 DNase를 처리 RNA-SEQ 셋 게놈 DNA 서열의 오염 가능성을 피하기 위해 권장된다.
4. 내용물을 혼합하고 품질 관리 분석을위한 5 μl를 제거하는 튜브 톡. 라이브러리 준비까지 C ° -80에서 나머지 샘플을 보관; 이들 샘플은 RNA의 분해를 방지하기 위해 단 한번만 해동되어야한다.
5. RNA 6000 나노 키트를 사용하여 Bioanalyzer 상품에 정제 된 RNA를 실행; RIN 값은 최소 7 위의 진행을해야합니다.
6. 일루미나 호환 RNA-SEQ 라이브러리 준비 키트를 사용하여 라이브러리를 생성하고 하나의 읽기 (100) BP를 생성하기 위해 설정 HiSeq 악기의 한 차선에서 4 라이브러리에 멀티 플렉스. 가능하면, 잠재적 인 기술 유물을 최소화하기 위해 같은 실행의 모든​​ 샘플을 포함한다.
   참고 :이 5000 만 R까지 양보해야대부분의 유전자 ^(13)에 대한 커버리지를 얻을 수있을만큼보다 더 샘플, 당 EADS.

4. 갤럭시 공용 서버 ^(10)에 RNA-SEQ 데이터 집합을 비교.

참고 : 서버 저장 공간이 제한되며 많은 샘플을 비교 실험 필터링 단계에서 생성 된 중간 파일의 삭제를 요구할 수있다.

1. (갤럭시 공개 서버에 사용자 계정을 만듭니다 https://usegalaxy.org ) 및 FTP는 fastq 형식으로 Illumina의 데이터 세트를 업로드 할 수 있습니다.
2. NGS에서 FastqGroomer ⁽¹⁴⁾ 도구를 사용하여 업로드 된 파일 준비 : 품질 관리 및 조작 메뉴를; 품질 평가 점수가 이미 Phred + 33 (생거)으로 인코딩 된 경우, 단순히 각각의 데이터 세트에 대한 속성에서 fastqsanger하는 파일 형식을 변경하여이 단계를 건너 뜁니다.
3. QC 및 조작 나를 : 일반 NGS에서 FastQC 도구를 사용하여 각 데이터 세트의 품질 분석뉴.
   참고 :이 읽기의 끝을 트리밍에 사용되는 매개 변수에 대한 추정치를 제공하므로 특별한주의가 염기 서열의 품질 별, 염기 서열의 콘텐츠에 대한 결과 그래픽 고려되어야한다.
4. 트림 3 '폐기 읽는 도구 NGS에서 FASTQ 품질 트리머 ⁽¹⁴⁾ 사용하여 낮은 품질의 데이터로 끝나는 : 품질 관리 및 조작 메뉴를 표시합니다. 만 3 '가 20 아래 품질 평가 점수에 대한 종료 처리하기 위해 도구를 설정합니다.
5. 클립 도구 (사용하여 읽기에서 어댑터 시퀀스를 제거 http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ QC 및 조작 메뉴 : NGS 아래 참조). 왼쪽보다 45 bp의 입력에 사용되는 어댑터의 순서로 읽어 버리고 모두 클리핑 및 비 클리핑 된 시퀀스를 포함하는 출력을 선택할 수있는 도구를 설정합니다. 또한, 가장 낮은 품질의 기지가 이미 마지막 단계에서 제거 된 이후 알 수없는 기지와 시퀀스를 폐기하지 않는 선택.
6. 도구 트림 시퀀스 (사용 http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ NGS 아래)가 FastQC에 의해 검출 된 5 '시퀀스 바이어스 (일반적으로 10)를 제거하기 위해 읽기의 ​​품질 관리 및 조작 메뉴를 첫 번째 기지 트림.
   참고 :이 시점에서, 다시 FastQC을 실행하고 데이터 세트의 품질이 향상되었는지 확인하기 위해 이전의 분석과 비교하는 것이 좋습니다.
7. 다운로드 일루미나 iGenomes에서 UCSC 게놈 브라우저의 최신 닭 게놈 어셈블리를 풀고 ( http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn ) 전체 게놈 FASTA 형식 파일 및 유전자 주석 GTF 형식의 파일을 업로드 데이터 가져 오기 메뉴에서 도구 파일 업로드를 사용하여 갤럭시 역사.
8. 지도하에 얼 라이너 ^(15)를 사용 TopHat2 닭 게놈에 각 샘플에 대해 읽NGS : RNA 분석 메뉴. 역사에서 게놈을 사용하기로 선택한다 (단계 4.7에서 업로드 FASTA 파일을 선택합니다).
9. RNA 분석 메뉴 : NGS에서 커프스 ¹⁶ 사용하여 각 샘플에 대한 예측 사체를 구축 할 수 있습니다. 가이드로 참조 주석을 사용한다 (단계 4.7에서 업로드 GTF 파일을 선택)하고 옵션을 켭니다 (역사, 단계 4.7에서 FASTA 파일에서) 바이어스 보정을 수행하고 다 읽어 올바른 사용하도록 선택합니다.
10. RNA 분석 메뉴 : NGS에서 Cuffmerge ^(16)를 사용하여 모든 샘플에 대한 예측 transcriptomes를 병합합니다. (역사, 단계 4.7에서 FASTA 파일) 및 시퀀스 데이터 (단계 4.7에서 GTF 파일) 참조 주석을 사용하여 선택합니다.
11. RNA 분석 메뉴 : NGS에서 Cuffdiff ¹⁶ 사용하여 각 샘플에 대한 TopHat2에 의해 생성 된 BAM 파일을 비교. 필드 성적 증명서에서 나를 선택rged 사체는 Cuffmerge에 의해 생성 옵션 (역사, 단계 4.7에서 FASTA 파일에서) 바이어스 보정을 수행 켜고 다 읽어 올바른 사용합니다.
12. 정렬 차동 표현은 필터에서 도구 정렬을 사용하여 숫자 열 (13) (Q 값)의 상승 테이블을 테스트하고 메뉴를 정렬합니다.
    참고 : 유전자 / 가장 낮은 Q 값을 제시한다 실험 조건 사이에 상당한 차이 식을 보여주는 성적 증명서.
13. 범위 그래프를 시각적으로 결과를 확인하려면 먼저 도구가 BEDTools 메뉴에서 게놈 범위 ^(17)의 BedGraph를 작성하여 bedGraph 형식으로 BAM 파일을 변환합니다. 보험이없는 지역의보고를 사용하지 않도록 설정, 별개의 간격으로 접합 항목을 처리하고 모든 데이터 세트가 비교되는 염기 서열 깊이를 정규화 계수로 적용 범위를 확장하기 위해 선택합니다.
14. 을 사용하여 중요 인물 형식 얻어진 bedGraph 파일 변환도구 가발 / BedGraph - 투 - 중요 인물 ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) 변환 형식 메뉴에서. UCSC 게놈 브라우저 (사용자 지정 트랙으로 중요 인물 파일을 업로드 http://www.genome.ucsc.edu/ galGal4 어셈블리)와 데이터 세트의 범위를 시각적으로 관심의 유전자를 검색 할 수 있습니다.

결과

설명 된 방법을 검증하기 위해, 두 개의 제어 샘플은 빈 벡터 pMES ⁷ 삽입 닭 SCRT2 ^(18)의 아연 손가락 도메인을 인코딩 SCRT2-ZNF를, 구성이 포함 된 동일한 벡터로 형질 전환 된 배아에서 하나의 샘플에 electroporation하여 배아에서 발생했다. 각 11-22 μg의 총 RNA를 산출 샘플은 8 ~ 12 배아의 풀에서 얻었다. 모든 3 개의 시료 고품질 RNA이 프로토콜로 얻을 수있는 것을 보여주는 Bioanalyzer 기기 ...

토론

여기에서 우리는 닭 척수의 전기 후 효과 분석을위한 지침을 제공합니다. DNA 벡터의 전기가 더 자주 관심의 유전자를 과발현하는 데 사용되지만, 하나는 또한 유전자 기능 녹다운 조건 ^19-21를 생성하는 siRNA를 위해 우성 네거티브 quimeric 또는 전구체 단백질을 코딩하는 구조를 이용할 수있다. 실제로, 이득 - 및 기능 상실 분석 모두에 기인 사체 프로파일의 비교는 차별적 따라서 전위가 더 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Indian ink	Any supplier
18G x 1 1/2 needle	BD	305196
3 ml syringe	BD	309657
Tris	MP Biomedicals	819620
F D & C Blue 1	Spectra Colors Corporation	5.FC.0010P0	Food Dye used to visualize DNA injection
Ringer's solution (1 L)
- 7.2 g NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
- 0.37 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
- 0.225 g CaCl2•2H2O	Fisher Scientific	10043-52-4
- 0.217 g Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0.02 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
- ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4
- ddH2O to 1 L
- Filter and autoclave
PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L)
- 8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
- 0.2 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
- 1.15 g Na2HPO4•7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0.2 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
- ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2
- ddH2O to 1 L and filter
- 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate)	Sigma-Aldrich	D-5758
- Shake vigorously and let stand overnight at room temperature
- Autoclave
Sieved spoon	Any supplier
Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes	Corning Life Sciences	351007
RNaseZap RNase decontamination solution	Life Technologies	AM9780
Fine point surgical scissors	Any supplier
Straight fine point tweezers	Any supplier
Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes	Kimble Chase	40A502
9'' glass Pasteur pipette	Any supplier
Manual pipette pump	Any supplier
Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes	Corning Life Sciences	MCT-150-C
Microcentrifuge	Any supplier
RNAlater solution for RNA stabilization	Life Technologies	AM7020
RNAqueous total RNA isolation kit	Life Technologies	AM1912
Molecular Biology Grade Ethanol	Any supplier
RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies	5067-1511
2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies	G2939AA
Truseq RNA Sample Preparation Kit v2	Illumina	RS-122-2001/RS-122-2002