エレクトロポひよこ胚脊髄における遺伝子発現差のRNA-配列解析

要約

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

要約

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

概要

OVOエレクトロポレーションで部分的にDNAが^1-5を構築して、in vivoでの胚の構造をトランスフェクトするための迅速かつ安価な方法を表しているので、ライブ生物に関する遺伝学的研究は、頻繁にモデルとしてニワトリ胚を使用しています。このようpCIG ⁶または⁷のPMEとして目的の遺伝子と一緒に蛍光レポーターを含むもの転写物をコードするシストロン性発現ベクターは、下流の分析のための胚を処理する前に、立体顕微鏡下で所望の領域でのトランスフェクションの質の迅速な検証を可能にする。

DNA配列決定における最近の進歩により、これは、RNA配列^8,9を用いて、RNAサンプルからデジタル全トランスクリプトーム発現プロファイルを得ることが可能である。したがって、代わりにそのようなin situハイブリダイゼーション 、免疫組織化学および定量PCR、cDNAライブラリーの調製のためのように並列に少数の遺伝子産物の解析を可能にする時間のかかる方法のハイスループットシークエンシングは、全トランスクリプトームの情報を提供することができる。一つ一つの遺伝子の発現レベルに対する影響の実験的観察は、次に使用される構築物によって改変経路に対する強力な洞察を提供してもよい。使用される生物ゲノムアセンブリが​​利用可能である場合、これは、このように、ニワトリ胚を再度適切なモデルであり、特に容易である。

ユーザが信頼できるゲノム配列決定センターへのアクセス権がある場合、主な問題は、高品質のRNAサンプルを得ることである。この研究は、RNA-配列に適したトランスフェクトされた神経管、ならびに得られたデータセットのインシリコ分析における下流の工程からのRNAサンプルを得るための方法を示す。 48時間のインキュベーションに続いてHH12-13でエレクトロポレーション後、トランスフェトランク脊髄の半分は、リボヌクレアーゼを含まない条件下で解剖直後に溶解し、さらにRNA精製およびライブラリpreparatまで超低凍結による分解から保護されていたイオン。

ギャラクシー公開サーバ^10は、ハイスループット配列決定データを分析するための空きリソースへのアクセスを提供する。登録ユーザーのために提供スペースの量は、このようにローカルな計算インフラの必要性を排除し、小規模な実験のために十分である。 RNA-配列データ解析、フィルタリング、整列および遺伝子発現の定量/比較を含む。 RNA-配列データ解析のための一般的なガイドラインがあるが、フィルタリングパラメータは、配列決定の品質に大きく依存し、生データの品質管理分析の後に決定されるべきである。

このプロトコルは、入手して、in vivoでトランスフェクトしたニワトリ胚性脊髄からRNA-配列プロファイルを比較する手順について説明します。代表的な結果として、空のベクターでトランスフェクトした二つの独立した対照試料から得られたデータセットの比較は、方法は、再現性があり、示差的EXPRESの同定を可能にするはずであることを示した実験試料におけるSEDの転写産物。従って、この方法の適用は大きく一つの実験後の発見の数を増加させ、したがって、その後の調査のために、大量のデータセットを提供する可能性を有する。

プロトコル

1.エレクトロポ卵内 HH12-13鶏胚の神経管への関心のコンストラクト

トランスフェクションの満足できるレベルを有する個体の迅速な同定を可能にするために、好ましくはシストロン性転写物に、蛍光レポーターを使用するか、またはインターカレーウイルス2Aペプチド¹¹で目的のタンパク質に融合した。注：この段階のための典型的なインキュベーション時間は37.8℃で、周りの48時間である。

1. ×1 1/2針18のGに結合された注射器でアルブミンの3ミリリットルを取り除いた後、卵に小さなウィンドウを開きます。胚の可視化を強化するために、胚^1-4の下の滅菌リンゲル液中で1:50に希釈インド少量のインクを噴射する。
2. 無菌のリンゲル液で胚をカバーした後、それが満杯になるまで神経管の後端を通しての2.5μg/μlのDNAを含む10mMのTris-HCl、pHが8.2と0.1％の食品色素（F、D＆C）溶液を注入後脳領域まで。 、腹部に沿って4ミリメートル¹離れた位置の白金電極（直径0.5mm）をエレクトロポレーションし、それら⁴の間に100ミリ秒の間隔で5〜50ミリ秒のパルス及び20 Vを送達する。
3. エレクトロポレーション後、彼らはステージHH23に達するまでより48時間操作された胚をインキュベートし、蛍光実体顕微鏡下に横腹領域において、トランスフェクションの高いレベルを提示する個人を識別する。
   注：エレクトロポレーション後のインキュベーションの持続時間は、実験の目的に依存します。電気穿孔プラスミドは2時間²の後に有意な発現レベルを生成することができる。関心が早期発症遺伝子である場合にはこのように、電気穿孔後の潜伏期間を短縮することができる。

2.収穫が正常胚をトランスフェクトし、エレクトロポ脊髄の半分を解剖

注：この手順は、それぞれ10胚および利回りのために2〜3時間から続く1胚あたり-2μgの全RNA。神経管の解剖は、微細な動きを必要とし、いくつかの練習セッションは、実験試料に適用する前に必要になることがあります。

1. のRNase汚染除去溶液で、または4時間¹² 150℃で焼成することにより、金属解剖ツールを除染し、DEPC処理PBSを準備します。唯一の新しい認定RNaseフリープラスチック製品を使用してください。
   NOTE：収穫した後、それは切開中のRNaseの混入を防ぐために、標準治療に従うことが重要である。
2. 細かい解剖ハサミと篩い分けコレクションスプーンを使って胚を収穫。 100ミリメートルペトリ皿に冷たいDEPC処理PBSに胚を保つ。
3. 細かいピンセットで、（前部肢芽と後肢芽の前方限界の後方限界の間）全体腹部を切り出し、冷たいDEPC処理PBSを含む新しい皿にこのセクションを転送します。
4. 異なる3で穿孔する2本の細いガラス針を使用して、神経管と近軸中胚葉の間の胚の各背外側側に指摘している。
5. 中央穿孔2枚のガラス針を導入し、ゆっくりと神経管前後軸に沿ってそれらのいずれかを離れて移動。最初の動きが到達していなかった穿孔のためにこれを繰り返します。細かいピンセットで取り外した近軸中胚葉を削除します。
6. 、横向きに胚を回し神経管と脊索の間ピンセットの先端を挿入し、二つの構造を分離する前後軸に沿って反対方向でそれらをスライドさせます。
   注：これは、まだ神経管に取り付けられた中胚葉のほとんどを除去する必要があります。
7. 必要であれば、軽くピンセットの別のペアで神経管を保持しながら、ピンセットで引っ張ることにより、付着したままで中胚葉組織のいずれかの大きな部分を削除します。終了したら、そっと用いた冷DEPC処理PBSを含む別の皿に神経管を転送RNaseフリーのガラスパスツールピペット手動ピペットポンプに結合され、すべての管を解剖するまで氷上に保つ。
8. 2半分に神経管を分割。このために、内腔にピンセットの閉じたペアの鋭い先端を挿入し、それを介してピンセットを移動することにより、屋根板を開く。この後、ピンセットの先端で床板を切断して半分を分ける。
9. 替えの氷冷DEPC処理PBSで満たし1.5mlチューブに蛍光解剖スコープと転送の下で非エレクトロポ半分からエレクトロポレーション。必要であれば、プラスチック壁に取り付けられた任意の組織を解放するために、チューブの沈降を促進するために穏やかにマイクロチューブをフリック。
10. 3秒間100×gでスピンし、1mlのマイクロピペットで非常にゆっくりと、できるだけ多くのPBSを取り除く。どんな胚性物質がピペットチップに吸引されるかどうかを監視するためにマイクロチューブを通して輝く光源を見ながら、これを行う。これが発生した場合には、ゆっくりと放電しcentrifugaを繰り返する。
11. 神経管の半分あたりのRNA抽出のための溶解液70μlのを追加し、内容物を混合するチューブをフリック。 5分間激しくボルテックス、室温でインキュベートする。 5分のインキュベーションを繰り返し、さらに2回ボルテックスする。 -80℃で保存してください。
12. 次のステップのための十分な収量を確保するために、サンプルごとに少なくとも8神経管の半分を収集します。いくつかのエレクトロポレーション/切開セッションは神経管の十分な数を蓄積する必要がある場合に小さいサンプルをプールする。各条件について、重複や三連のために十分なサンプルを格納。

3. R​​NAを精製し、イルミナシーケンシング用のライブラリを準備

1. -80℃の貯蔵からのサンプルを取り出し、15〜30分間氷上に置きます。完了するまで室温で解凍を再開します。
2. 渦ウェルと5分間室温で残す。 1分間15000×gで再びボルテックスと遠心機は、不溶性物質をペレット化する。
3. 上清を新しいチューブに移し、総RNA単離キット取扱説明書に従ってRNA抽出に進む。濃度を高めるために推奨される最小ボリュームで溶出する。
   注：クリーンアップ後のDNase処理はRNA-配列のデータセット中のゲノムDNA配列の潜在的な汚染を回避するために推奨される。
4. 内容物を混合し、品質管理分析のための5μlを除去するためにチューブをフリック。ライブラリの準備まで-80℃で残ったサンプルを保存する。これらの試料は、RNAの分解を避けるために一回だけ解凍されるべきである。
5. RNA 6000ナノキットを使用して、バイオアナライザー機器で精製RNAを実行する。 RIN値は続行するには、少なくとも7以上でなければならない。
6. イルミナ互換性RNA-のSeqライブラリ調製キットを使用してライブラリを生成し、単一の読み取りは100bpを生成するように設定HiSeq器具の1レーンに4図書館まで多重化する。可能な場合は、潜在的な技術的なアーティファクトを最小化するために、同じランですべてのサンプルが含まれています。
   注：これは、最大5000万Rが得られるはずですほとんどの遺伝子¹³のカバレッジを得るために十分以上のものですサンプルあたりEADS、。

4.ギャラクシー公開サーバ¹⁰においてRNA-配列データセットを比較してください。

NOTE：Serverストレージスペースが限られており、多数の試料を比較する実験では、フィルタリングステップで生成された中間ファイルの削除を要求することができる。

1. （ギャラクシー公開サーバにユーザーアカウントを作成しhttps://usegalaxy.org ）とFTPはFASTQ形式でイルミナデータセットをアップロードします。
2. NGS下FastqGroomer ¹⁴ツールでアップロードされたファイルを準備します。QCと操作メニュー 。品質スコアが既にのPhred + 33（サンガー）でエンコードされている場合、単純に各データセットの属性の下fastqsangerにファイルの種類を変更することで、このステップをスキップします。
3. NGSの下FastQCツールを使用して各データセットの一般的な品質を分析：QCと操作私をNU。
   注：これらの読み取りの端部をトリミングするために使用されるパラメータの推定値を提供するように特別な注意が、塩基配列の質ごとおよび塩基配列の含有量の結果のグラフィックスに与えられるべきである。
4. QCと操作メニュー：トリムがNGSの下にツールFASTQ品質トリマー ^14を用いて低品質データで終わる3 'を破棄するように読み取ります。唯一の3 'が20以下の品質スコアのために終了処理するためのツールを設定します。
5. クリップツール（使用して読み取ってから、アダプター配列を除去http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/を QCと操作メニュー：NGSの下）。左未満45 bpの、入力に使用されるアダプタのシーケンスで読み込んで破棄し、両方のクリッピングおよび非クリッピング配列を含むよう出力を選択するためのツールを設定してください。さらに、ほとんどの低品質の塩基は既に最後の工程で除去されたため、未知の塩基とのシーケンスを破棄しないように選ぶ。
6. ツールトリム配列 （使用してhttp://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ NGS下）：FastQCによって検出された5 '配列バイアス（通常は10）を除去するために読み込んでのQCと操作メニューを、最初の拠点をトリミング。
   注：この時点で、それは再びFastQCを実行し、データセットの品質が向上したかどうかを判断するために以前の分析と比較することをお勧めします。
7. ダウンロードして、イルミナiGenomesからUCSCゲノムブラウザの最新のニワトリゲノムアセンブリをアンパック（ http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn ）および全ゲノムFASTA形式ファイルと遺伝子注釈GTF形式のファイルをアップロードする銀河の歴史にGETデータ]メニューの下にツールのアップロードファイルを使用して。
8. マップはTopHat2 ^15歳未満のアライナーを使用したニワトリゲノムに各サンプルについて読み取っNGS：RNA分析メニュー 。履歴からゲノムを使用することを選択し（ ステップ4.7でアップロードFASTAファイルを選択します）。
9. RNA分析メニュー：NGSの下カフス ^16を使用して、各サンプルの予測トランスクリプトームを構築します。 （歴史、 ステップ4.7からFASTAファイルから） バイアス補正を実行し、 正しいマルチリードを使用して、ガイドとして参照アノテーションを使用するかを選択します（ ステップ4.7でアップロードGTFファイルを選択します）とオプションをオンにしてください。
10. RNA分析メニュー：NGSの下Cuffmerge ^16を使用して、すべてのサンプルの予測トランスクリプトームをマージします。 （歴史、ステップ4.7からFASTAファイルから）とシーケンスデータ（ ステップ4.7からGTFファイル）参照アノテーションを使用するかを選択します。
11. RNA分析メニュー：NGSの下Cuffdiff ^16を用いて、各サンプルについてTopHat2によって生成されたBAMファイルを比較。分野では転写物は私を選択Cuffmergeによって生成されたトランスクリプトームをrgedと（歴史、 ステップ4.7からFASTAファイルから） バイアス補正を実行し、 正しいマルチリードを使用して、オプションをオンにします。
12. ソート差動式はフィルターの下のツールを使って数値的にソート列13（q値）で昇順のテーブルをテストして、メニューをソートします 。
    注：実験条件の間に有意な差発現を示す遺伝子/転写物は最も低いQ値を紹介します。
13. カバレッジグラフで視覚的に結果を確認するには、最初のツールはBEDToolsメニューの下ゲノムカバレッジ ¹⁷ のBedGraphを作成し使用してbedGraph形式にBAMファイルを変換する。報道せずに地域の報告を無効にするには、明確な区間としてスプライスされたエントリを治療し、比較されているすべてのデータセットのためのシーケンシングの深さを正規化係数によってカバレッジを拡大することを選択した。
14. 使用して大物形式に結果のbedGraphファイルを変換するツールウィッグ/ BedGraph·ツー·大物 （ http://www.genome.ucsc.edu/ ） 変換フォーマットメニューの下。 UCSCゲノムブラウザ（でカスタムトラックとして大物ファイルをアップロードhttp://www.genome.ucsc.edu/ galGal4アセンブリ用）とデータセット内のカバレッジを可視化するために目的の遺伝子を検索します。

結果

記載された方法を検証するために、2つの対照サンプルは、空のベクターのPME ⁷とインサートニワトリSCRT2 ¹⁸のジンクフィンガードメインをコードSCRT2-ZNFの構築を含む同じベクターでトランスフェクトされた胚から1つのサンプルを用いてエレクトロポレーション胚から生成した。各11-22μgのトータルRNAを得た試料は、8〜12の胚のプールから得た。すべての3つのサンプルは、高品...

ディスカッション

ここでは、鶏脊髄のエレクトロポレーション後の効果を分析するためのガイドラインを提供する。 DNAベクターのエレクトロポレーションは、より頻繁に目的の遺伝子を過剰発現するために使用されるが、一方はまた、遺伝子機能のノックダウン条件^19-21を生成するために、siRNAのためのドミナントネガティブ、quimericタンパク質または前駆体をコードする構築物を使用することができ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Indian ink	Any supplier
18G x 1 1/2 needle	BD	305196
3 ml syringe	BD	309657
Tris	MP Biomedicals	819620
F D & C Blue 1	Spectra Colors Corporation	5.FC.0010P0	Food Dye used to visualize DNA injection
Ringer's solution (1 L)
- 7.2 g NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
- 0.37 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
- 0.225 g CaCl2•2H2O	Fisher Scientific	10043-52-4
- 0.217 g Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0.02 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
- ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4
- ddH2O to 1 L
- Filter and autoclave
PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L)
- 8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
- 0.2 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
- 1.15 g Na2HPO4•7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0.2 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
- ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2
- ddH2O to 1 L and filter
- 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate)	Sigma-Aldrich	D-5758
- Shake vigorously and let stand overnight at room temperature
- Autoclave
Sieved spoon	Any supplier
Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes	Corning Life Sciences	351007
RNaseZap RNase decontamination solution	Life Technologies	AM9780
Fine point surgical scissors	Any supplier
Straight fine point tweezers	Any supplier
Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes	Kimble Chase	40A502
9'' glass Pasteur pipette	Any supplier
Manual pipette pump	Any supplier
Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes	Corning Life Sciences	MCT-150-C
Microcentrifuge	Any supplier
RNAlater solution for RNA stabilization	Life Technologies	AM7020
RNAqueous total RNA isolation kit	Life Technologies	AM1912
Molecular Biology Grade Ethanol	Any supplier
RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies	5067-1511
2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies	G2939AA
Truseq RNA Sample Preparation Kit v2	Illumina	RS-122-2001/RS-122-2002