RNA-Seq ניתוח של ביטוי הגנים בדיפרנציאל חוט השדרה Electroporated אפרוח עוברי

Summary

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

Abstract

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

Introduction

מחקרים גנטיים באורגניזמים חיים משתמשים לעתים קרובות עובר העוף כמודל כי בelectroporation אובו מייצג דרך מהירה וזולה לtransfect מבנים עובריים באופן חלקי in vivo עם הבונה DNA ^1-5. וקטורי ביטוי bicistronic שמקודדים תמליל אחד המכיל כתב ניאון יחד עם הגן של עניין, כגון pCIG ⁶ או ⁷ pMES, לאפשר אימות מהירה של איכות transfection באזור שתחת סטראו לפני העיבוד עובר לניתוח במורד הזרם.

עם התקדמות ברצף ה- DNA, ניתן כיום להשיג פרופילי ביטוי transcriptome כל דיגיטליים מדגימות RNA באמצעות RNA-Seq ^8,9. לכן, במקום בשיטות זמן רב המאפשרות ניתוח של רק כמה מוצרי גן במקביל, כגון הכלאה באתר, אימונוהיסטוכימיה וqPCR, הכנה של ספריות cDNA לרצף תפוקה גבוהה יכול לספק מידע של כל transcriptome. תצפית של תופעות הניסיוניות ברמות הביטוי של כל גן עשויה בתורו לספק תובנות רבות עוצמה על המסלולים שונים על ידי המבנה המשמש. זה קל במיוחד אם הרכבה הגנומי לאורגניזם המשמש נגיש, ובכך עובר האפרוח שוב הוא מודל מתאים.

אם למשתמש יש גישה למרכז רצף הגנום אמין, הבעיה העיקרית היא קבלת דגימות RNA באיכות גבוהה. עבודה זו מדגימה שיטה לקבלת דגימות RNA מצינורות transfected עצביים מתאימים לרנ"א-Seq, כמו גם הצעדים במורד הזרם בניתוח סיליקון ושל מערכי נתונים וכתוצאה מכך. לאחר electroporation בHH12-13 אחרי 48 דגירה שעה, חצאים חוט השדרה גזע transfected נותחו בללא תנאי ribonuclease, lysed באופן מיידי ועוד מוגן מפני השפלה ידי הקפאה נמוכה במיוחד עד לטיהור RNA וpreparat הספרייהיון.

השרת הציבורי גלקסי ¹⁰ מספק גישה למשאבים פנויים לניתוח נתונים רצף תפוקה גבוהה. כמות השטח המוצעת למשתמשים רשומים מספיק לניסויים קטנים, ובכך מבטלת את הצורך בתשתית החישובית מקומית. ניתוח נתוני RNA-Seq כולל סינון, יישור וכימות / השוואה של ביטוי גנים. למרות שיש הנחיות כלליות לניתוח נתונים RNA-Seq, פרמטרים לסינון יהיו תלויים במידה רבה באיכות של רצף וצריכים להיקבע לאחר ניתוח בקרת האיכות של הנתונים הגולמיים.

פרוטוקול זה מתאר את השלבים להשגה ולהשוות פרופילי RNA-Seq מחוט שדרת עוף עוברי transfected in vivo. כתוצאה מכך נציג, השוואה של מערכי נתונים שהתקבלו משתי דגימות שליטה עצמאיות transfected עם וקטור ריק הראתה כי השיטה ניתנת לשחזור וצריכה לאפשר זיהוי של Expres באופן דיפרנציאליתמלילי SED בדגימות ניסוי. לכן, יישום של שיטה זו יש הפוטנציאל להגדיל באופן משמעותי את מספר התגליות לאחר ניסוי אחד בודד ובכך לספק קבוצה גדולה של נתונים לחקירה שלאחר מכן.

Protocol

1. Electroporate Construct עניינים בצינורות העצבי של HH12-13 עוף עוברים באוב

השתמש בכתב ניאון, רצוי בתמליל bicistronic או התמזג החלבון של עניין עם פפטיד 2a הנגיפי intercalating ^11, כדי לאפשר זיהוי מהיר של אנשים עם רמות מספקות של transfection. הערה: זמן דגירה אופייני בשלב זה הוא כ 48 שעות ב37.8 מעלות צלזיוס.

1. פתח חלון קטן בביצים לאחר הסרת 3 מיליליטר של אלבומין עם מזרק מצמידים x 1 1/2 מחט 18 G. כדי לשפר את ההדמיה עובר, להזריק כמות קטנה של הדיו ההודי מדולל 01:50 בפתרון של רינגר סטרילית מתחת לעובר ^1-4.
2. לאחר שכיסה את העובר עם הפתרון של רינגר סטרילית, להזריק פתרון 10 מ"מ טריס HCl, pH 8.2 ו 0.1% מזון צבע (F, D & C) המכיל 2.5 מיקרוגרם / μl DNA באמצעות הקצה האחורי של הצינור העצבי עד שהיא ממלאתעד לאזור המוח האחורי. לelectroporate, אלקטרודות עמדת פלטינה (0.5 מ"מ קוטר) מופרדות על ידי 4 מ"מ ¹ לאורך אזור האגף ולספק 5 פולסים של 50 מילים-שני ו -20 V עם מרווח של ביניהם ⁴ 100 אלפיות שניים.
3. לאחר electroporation, דגירה עוברי מניפולציות במשך 48 שעות יותר עד שהם מגיעים HH23 במה ולזהות אנשים המציגים רמה גבוהה של transfection באזור האגף תחת סטראו ניאון.
   הערה: משך הדגירה לאחר electroporation תלויה במטרת הניסוי. פלסמידים electroporated יכולים להפיק רמות ביטוי משמעותיות לאחר שעה 2 ^2. לכן, אם העניין הוא בגנים בגיל מוקדם יכולה להיות מופחתת תקופת הדגירה לאחר electroporation.

2. קציר transfected בהצלחה עוברים ולנתח את החצאים כבל Electroporated השדרה

הערה: הליך זה נמשך 2-3 שעות לכל 10 עוברים ותשואות 1-2 רנ"א הכל מיקרוגרם לכל עובר. הנתיחה של צינורות עצביים דורשת תנועות עדינות וחלק אימונים עשויים להיות נחוצים לפני החלת את דגימות ניסוי.

1. לטהר כלים לנתיחה מתכתיים עם פתרון טיהור RNase או על ידי אפייה ב -150 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות ¹² ולהכין PBS DEPC שטופל. השתמש plasticware RNase ללא בלבד החדש המאושר.
   הערה: לאחר קציר, זה חשוב לעקוב אחר טיפול סטנדרטי למניעת זיהום RNase במהלך נתיחה.
2. קציר עובר באמצעות מספריים לנתח קנס וכפית אוסף הסתננה. שמור את העוברים בPBS DEPC שטופל קר בצלחת פטרי 100 מ"מ.
3. עם פינצטה בסדר, לחתוך את אזור כולו האגף (בין הגבול האחורי של ניצן הגפה הקדמי והגבול הקדמי של ניצן הגפה האחורית) ולהעביר סעיף זה לצלחת חדשה המכילה PBS DEPC שטופל קר.
4. השתמש בשתי מחטי זכוכית עדינות ללנקב בשלוש שונהמצביע בכל צד דורסולטרלי של העובר בין הצינור העצבי והמזודרם הפרקסיאלית.
5. להציג את שתי מחטי הזכוכית בניקוב המרכזי ולנוע באיטיות אחד מהם משם לאורך הציר הקדמי-אחורית בצינור העצבי. חזור על פעולה זו לנקבים שלא הגיעו על ידי התנועות הראשונות. הסר את המזודרם הפרקסיאלית המנותק עם פינצטה בסדר.
6. הפעל את העובר לצדדים, להכניס את הטיפים של פינצטה בין הצינור העצבי וnotochord ולהחליק אותם בכיוונים מנוגדים לאורך הציר הקדמי-אחורי כדי להפריד בין שני המבנים.
   הערה: זה אמור גם להסיר את רוב המזודרם עדיין מחוברים לצינור העצבי.
7. אם יש צורך, להסיר כל חתיכות גדולות יותר של רקמת mesodermic שנותרו מחוברים על ידי משיכת עם פינצטה תוך החזקה קלה בצינור העצבי עם זוג נוסף של פינצטה. בסיום, בעדינות להעביר את הצינור העצבי למנה נוספת המכיל PBS DEPC שטופל קר באמצעותפיפטה פסטר זכוכית RNase ללא מצמידים את משאבת פיפטה ידנית ולשמור על קרח עד שכל הצינורות הם גזורים.
8. מחלקים את הצינורות העצביים לשני חצאים. לשם כך, הכנס את הקצה החד של זוג סגור של פינצטה בלום ולפתוח את גג הצלחת על ידי הזזת את פינצטה דרכו. אחרי זה, להפריד את החצאים על ידי חיתוך צלחת הרצפה עם הטיפים פינצטה.
9. electroporated מיין מחצאים-electroporated שאינם תחת בהיקף ניאון לנתח ולהעביר צינור 1.5 מיליליטר מלא PBS DEPC שטופל קר כקרח. במידת צורך, קפיצי microtubes בעדינות כדי לשחרר את כל רקמה הצמודה לקירות הפלסטיק ולקדם שקיעה של הצינורות.
10. ספין בבמשך 3 שניות 100 XG ולהסיר לאט לאט ככל PBS ככל האפשר עם micropipette 1 מיליליטר. עושה זאת תוך מסתכל על מקור אור שזורח דרך microtube כדי לפקח אם כל חומר עוברי נשאב לקצה פיפטה; אם זה קורה, לפרוק לאט ולחזור על centrifugation.
11. להוסיף 70 μl של פתרון תמוגה להפקת RNA לכל חצי צינור עצבי והזיז את הצינור לערבב תוכן. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות ומערבולת במרץ. חזור על הדגירה 5 דקות וvortexing עוד פעמיים. חנות ב -80 מעלות צלזיוס.
12. לאסוף לפחות שמונה חצאים צינור עצביים לדגימה כדי להבטיח תשואה נאותה לשלב הבא. בריכת מדגמים קטנים יותר אם מספר מפגשי electroporation / נתיחה נדרשים לצבור מספר מספיק של צינורות עצביים. אחסן דגימות מספיקות לכפילויות או triplicates עבור כל תנאי.

3. לטהר RNA והכן ספריות לרצף Illumina

1. הסר דגימות מאחסון -80 ° C ומניח על קרח במשך 15-30 דקות. קורות חיים הפשרה בטמפרטורת חדר עד להשלמה.
2. מערבולת היטב ומשאירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. מערבולת שוב וצנטריפוגות ב XG 15,000 עבור 1 דקות כדי גלולה חומר מסיס.
3. מעביר את supernatant לצינור חדשולהמשיך למיצוי RNA לפי כוללת הוראות שימוש ערכת בידוד RNA. Elute בהיקף המינימאלי המומלץ להגדיל את הריכוז.
   הערה: טיפול DNase לאחר הניקוי מומלץ על מנת למנוע אפשרות של זיהום רצפי הדנ"א הגנומי במערכי נתוני RNA-Seq.
4. גרור את הצינור לערבב תוכן ולהסיר 5 μl לניתוח בקרת איכות. חנות המדגם שנותר ב -80 ° C עד הכנת ספרייה; דגימות אלה צריכים להיות מופשרים רק פעם אחת, כדי למנוע השפלה RNA.
5. הפעל RNA המטוהר במכשיר Bioanalyzer באמצעות ערכת Nano RNA 6000; ערך רין חייב להיות לפחות מעל 7 כדי להמשיך.
6. צור ספריות באמצעות ערכת RNA-Seq תואמת Illumina הכנת ספרייה וזמנית עד 4 ספריות בנתיב אחד של מכשיר HiSeq להגדיר לייצר 100 נ"ב אחד קורא. במידת האפשר, כולל את כל הדגימות באותו הטווח למזער חפצים טכניים פוטנציאליים.
   הערה: זה אמור להניב עד 50 מיליון rEADS לדגימה, וזה יותר ממספיק כדי להשיג כיסוי עבור רוב הגנים ^13.

4. שקלו את מערכי נתוני RNA-Seq בשרת Galaxy הציבורי ^10.

הערה: שטח אחסון שרת מוגבל וניסויים השוואת דגימות רבות עשויים לדרוש מחיקה של קבצי ביניים שנוצרו בשלבי הסינון.

1. צור חשבון משתמש בשרת הציבורי גלקסי (https://usegalaxy.org) ו- FTP להעלות מערכי נתונים Illumina בפורמט fastq.
2. הכן קבצים שהועלו עם כלי FastqGroomer ¹⁴ תחת NGS: תפריט QC ומניפולציה; אם ציוני האיכות כבר מקודדים בPhred + 33 (סנגר), דלג על שלב זה, פשוט על ידי שינוי סוג הקובץ לfastqsanger תחת התכונות לכל בסיס הנתונים.
3. לנתח את האיכות הכללית של כל מערך נתונים באמצעות כלי FastQC תחת NGS: QC והמניפולציהנו.
   הערה: תשומת לב מיוחדת צריכה להינתן לגרפיקה לתוכן רצף לאיכות רצף בסיס וכל בסיס וכתוצאה מכך, כמו אלה מספקים הערכות לפרמטרים המשמשים לחיתוך הקצוות קורא.
4. Trim קורא להשליך 3 'מסתיים עם נתוני איכות נמוכות באמצעות הכלי FASTQ איכות גוזם ¹⁴ תחת NGS: תפריט QC ומניפולציה. הגדר את הכלי לעבד רק 3 'מסתיים לציון איכות נמוכה מ -20.
5. הסר רצפי מתאם מקורא באמצעות כלי קליפ (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/) תחת NGS: תפריט QC ומניפולציה. הגדר את הכלי כדי לבטל קורא עם פחות מ 45 נ"ב עזב, קלט הרצף של המתאם המשמש ולבחור את הפלט לכולל שני רצפים המקוטעים והלא-קטועים. בנוסף, בוחר שלא להשליך רצפי בסיסים ידועים מאחר שרוב הבסיסים באיכות נמוכות כבר הוסרו בשלב האחרון.
6. שימוש ברצפי כלי Trim (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/) תחת NGS: QC ותפריט מניפולציה, לקצץ הבסיסים הראשונים של קורא להסרת 5 הטיה 'רצף זוהתה על ידי FastQC (בדרך כלל 10).
   הערה: בשלב זה, זה רעיון טוב לרוץ FastQC שוב ולהשוות עם הניתוח הקודם כדי לקבוע אם איכות בסיס הנתונים השתפרה.
7. הורד ולפרוק ההרכבה הגנום העוף האחרונה עבור דפדפן הגנום UCSC מIllumina iGenomes (http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn) ולהעלות את קובץ כל פורמט FASTA הגנום ואת הקובץ בפורמט GTF ביאור גנים להיסטוריה Galaxy באמצעות העלאת קובץ הכלי תחת תפריט נתונים קבלו.
8. מפה קוראת לכל דגימה לגנום העוף באמצעות aligner TopHat2 ¹⁵ תחתNGS: תפריט RNA ניתוח. בחר להשתמש הגנום מההיסטוריה (בחר את קובץ FASTA נטען בשלב 4.7).
9. לבנות transcriptome חזתה עבור כל דגימה באמצעות חפתים ¹⁶ תחת NGS: תפריט RNA ניתוח. בחר להשתמש ביאור התייחסות כמדריך (בחר את קובץ GTF נטען בשלב 4.7) והפעל את האפשרויות לבצע תיקון הטיה (מההיסטוריה, קבצי FASTA משלב 4.7) ושימוש נכון לקריאה מרובה.
10. מיזוג transcriptomes חזוי לכל הדגימות באמצעות Cuffmerge ¹⁶ תחת NGS: תפריט RNA ניתוח. בחר להשתמש ביאור התייחסות (קובץ GTF משלב 4.7) ונתונים רצף (מההיסטוריה, קבצי FASTA משלב 4.7).
11. השוואת קבצי BAM נוצרו על ידי TopHat2 עבור כל דגימה באמצעות Cuffdiff ¹⁶ תחת NGS: תפריט RNA ניתוח. בתמלילי השדה לבחור ליtranscriptome rged שנוצרה על ידי Cuffmerge ולהפעיל את האפשרויות לבצע תיקון הטיה (מההיסטוריה, קבצי FASTA משלב 4.7) ושימוש נכון לקריאה מרובה.
12. מיין ביטוי ההפרש בדיקת טבלאות מספרים עולה בעמודת 13 (ערך q) באמצעות מיון כלי הסינון ומיון בתפריט.
    הערה: גנים / תמלילים מראים ביטוי ההפרש משמעותי בין תנאי ניסוי יציג את ערכי q הנמוכים ביותר.
13. לבדוק את תוצאות בחינה ויזואלית עם גרפים כיסוי, להמיר קבצים הראשונים BAM לפורמט bedGraph שימוש באפשרות יצירת BedGraph כיסוי הגנום ¹⁷ תחת תפריט BEDTools. להשבית דיווח של אזורים ללא כיסוי, לבחור לטיפול בערכים איחו כמרווחים שונים ולשנות את גודל הכיסוי על ידי גורם שמנרמל עומק רצף לכל בסיסי הנתונים מושווים.
14. להמיר את הקובץ לפורמט bedGraph וכתוצאה מהרם-הראש, שימוש בכלי פאה / BedGraph לרם-הראש (http://www.genome.ucsc.edu/) תחת תפריט פורמטי המרה. העלה את הקבצים את רם-הראש כמסלולים מותאמים אישית בדפדפן הגנומי של האוניברסיטה קליפורניה (http://www.genome.ucsc.edu/) להרכבת galGal4 ולחפש גן של עניין כדי להמחיש את הכיסוי במערכי הנתונים.

תוצאות

כדי לאמת את השיטה שתוארה, שתי דגימות בקרה נוצרו מהעוברים electroporated עם pMES הריק הווקטור ⁷ ודגימה אחת מהעוברים transfected עם אותו הווקטור המכיל את התוסף לבנות SCRT2-ZNF, אשר מקודד תחומים אבץ-אצבע של SCRT2 עוף ^18. דגימות מניב RNA סך 11-22 מיקרוגרם כל נלקחו מבריכות של 8 עד 12 עוברים....

Discussion

כאן אנו מספקים הנחיות לניתוח השפעות לאחר electroporation של חוט השדרה העוף. למרות electroporation של וקטורי DNA הוא בתדירות גבוהה יותר המשמש לביטוי יתר של גן של עניין, אפשר גם להשתמש במבנים קידוד שליליים דומיננטי, חלבוני quimeric או מבשרים לsiRNAs ליצור תנאי תפקוד הגן לדפוק למטה ^19-21. ל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Indian ink	Any supplier
18G x 1 1/2 needle	BD	305196
3 ml syringe	BD	309657
Tris	MP Biomedicals	819620
F D & C Blue 1	Spectra Colors Corporation	5.FC.0010P0	Food Dye used to visualize DNA injection
Ringer's solution (1 L)
- 7.2 g NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
- 0.37 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
- 0.225 g CaCl2•2H2O	Fisher Scientific	10043-52-4
- 0.217 g Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0.02 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
- ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4
- ddH2O to 1 L
- Filter and autoclave
PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L)
- 8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
- 0.2 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
- 1.15 g Na2HPO4•7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0.2 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
- ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2
- ddH2O to 1 L and filter
- 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate)	Sigma-Aldrich	D-5758
- Shake vigorously and let stand overnight at room temperature
- Autoclave
Sieved spoon	Any supplier
Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes	Corning Life Sciences	351007
RNaseZap RNase decontamination solution	Life Technologies	AM9780
Fine point surgical scissors	Any supplier
Straight fine point tweezers	Any supplier
Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes	Kimble Chase	40A502
9'' glass Pasteur pipette	Any supplier
Manual pipette pump	Any supplier
Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes	Corning Life Sciences	MCT-150-C
Microcentrifuge	Any supplier
RNAlater solution for RNA stabilization	Life Technologies	AM7020
RNAqueous total RNA isolation kit	Life Technologies	AM1912
Molecular Biology Grade Ethanol	Any supplier
RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies	5067-1511
2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies	G2939AA
Truseq RNA Sample Preparation Kit v2	Illumina	RS-122-2001/RS-122-2002