对基因差异表达的RNA序列中电穿孔鸡胚脊髓分析

摘要

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

摘要

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

引言

在活的生物体的基因研究经常使用的鸡胚为模型，因为在OVO电代表了一个快速和廉价的方式来部分地转染胚胎结构在体内与DNA构建^1-5。编码含有荧光报告与感兴趣的基因，如pCIG ⁶或机动设备⁷在一起的一个双顺反子转录物表达载体，允许在所希望的区域转质量的快速验证处理的胚胎用于下游分析之前，在立体显微镜下。

在DNA测序的最新进展，现在有可能从使用RNA测序^-8,9- RNA样本获得数字全转录组表达图谱。因此，代替费时方法，使只有几个基因产物平行，分析如原位杂交，免疫组织化学和qPCR，用于制备cDNA文库的高通量测序可以提供全转录组的信息。对每一个基因的表达水平的实验效果的观察又可以提供关于所使用的构建体改变了通路有力的见解。这是特别容易的，如果一个基因组装配所使用的生物体是可用的，从而鸡胚又是一个合适的模型。

如果用户有访问权限的可靠的基因组测序中心，主要问题是获得高品质的RNA样品。这项工作表明获得的RNA样品从转染的神经管适用于RNA测序，以及在下游步骤中所得到的数据集的计算机分析的方法。电在HH12-13其次是48小时培养后，转染树干脊髓半解剖的核糖核酸酶自由的条件下，立即溶解并进一步降解保护的超低冰点，直到RNA纯化和图书馆preparat离子。

银河公共服务器¹⁰可以访问免费资源，用于分析的高通量测序数据。的空间供注册用户的数量是足够的小实验，从而省去了本地的计算基础设施。 RNA测序数据分析包括过滤，比对和基因表达的定量/对比。虽然有用于RNA测序数据分析的一般准则，滤波参数将在很大程度上取决于序列的质量，并应后的原始数据的质量控制分析来确定。

这个协议描述的步骤，以获得与从鸡胚胎转染体内脊髓比较RNA片段轮廓。作为代表性的结果，从转染了空载体两个独立的对照样品获得的数据集的比较表明，该方法是可重复的，应该允许鉴定差异EXPRES的SED成绩单实验样本。因此，该方法的应用有可能大大增加的发现的数量之后，一个单独的试验，从而提供一个大的数据集进行后续调查。

研究方案

1.电穿孔兴趣的HH12-13鸡胚胎的神经管在大毛的构建

用荧光报道，优选在双顺反子转录物或融合于目的蛋白质与嵌入病毒2a中的肽^11，以使快速识别与转染的令人满意的水平的个体。注意:典型的孵育时间为这个阶段是围绕48小时，在37.8℃。

1. 除去3毫升白蛋白与耦合到18G的X 1 1/2针头的注射器后，打开一个小窗口中的鸡蛋。以提高胚胎的可视化，注入少量的墨汁在无菌林格氏胚胎^1-4下方溶液以1:50稀释的。
2. 覆盖用无菌林格氏溶液中的胚胎后，注入含有2.5微克/微升通过神经管的后端的DNA直到填满一个的10mM的Tris-HCl，pH值8.2和0.1％食品染料（F，D＆amp; C）溶液到后脑区域。电穿孔，通过4毫米¹沿侧翼区域分离位置的铂电极（直径0.5mm），并提供5个脉冲的50毫秒和20 V与他们⁴之间100毫秒的间隔。
3. 电穿孔后，孵化操纵胚胎48小时以上，直到他们达到的阶段HH23，并确定个人在日光灯立体呈现转高层次的侧翼区域。
   注:孵育电穿孔后的持续时间取决于实验的目的。电穿孔质粒可以在2小时后²产生显著的表达水平。因此，如果兴趣在于发病早期基因的电穿孔后潜伏期可以减小。

2.收获成功转染胚胎解剖和电穿孔脊髓减半

注意:此过程持续2-3个小时，每10胚胎和产量1-2每个胚胎微克总RNA。神经管的解剖，需要精细动作，并把它应用到实验样品前，一些练习是必要的。

1. 净化用RNase去污溶液或通过在150℃下烘烤4小时¹²金属清扫工具和制备DEPC处理的PBS中。只使用新的认证无RNA酶的塑料制品。
   注:收获后，按照标准的护理，防止清扫时RNase污染是很重要的。
2. 收获用一双精致的解剖剪刀和过筛收集勺胚胎。保持在100毫米的培养皿中冷DEPC处理过的PBS胚胎。
3. 用一双细镊子，切出整个侧翼区（前肢芽和后肢芽的前极限的后限之间），这部分转移到含冷DEPC处理过的PBS一道新菜。
4. 用两个细玻璃针穿孔在三个不同的点于神经管和近轴中胚层之间的胚胎各背外侧边。
5. 引入两个玻璃针，在中央​​穿孔，慢慢移动中的一个远离沿着神经管前后轴。重复此步骤不是由所述第一运动达到该穿孔。用一双细镊子取出分离旁轴中胚层。
6. 把胚胎侧身，插入神经管和脊索之间的镊子的提示和他们在沿前后轴分开的两个结构相反的方向滑动。
   注意:这也应该除去大部分的中胚层的仍然附着在神经管。
7. 如有必要，删除仍然受到拉动用镊子，同时轻轻握住神经管与另一镊子附加任何大块mesodermic组织。完成后，轻轻的神经管含冷DEPC处理过的PBS采用转移到另一道菜耦合无RNase玻璃巴斯德吸管向手动移液管泵，并保持在冰上，直到所有的管子都解剖。
8. 分化神经管成两半。对于此，插入一个封闭镊子在管腔的尖端和通过移动镊子出通过它打开屋顶板。在此之后，通过切割底板与镊子尖端分开两半。
9. 来自非电穿孔半部排序电下的荧光解剖显微镜和转移到1.5ml管中填充用冰冷的DEPC处理过的PBS中。如果需要的话，轻弹的微管轻轻地释放附着在塑料壁的任何组织，并促进管的沉淀。
10. 旋转100 XG为3秒，取出非常缓慢尽可能多的PBS尽可能与1毫升微量。做到这一点，而在寻找一个光源照射，通过微管监测如有胚胎物质被吸入到枪头;如果发生这种情况，慢慢地排出，并重复centrifuga化。
11. 加入70微升的每个神经管半RNA提取裂解液和轻弹试管混合内容。在室温下孵育5分钟，并大力旋涡。重复5分钟温育和涡旋两次以上。储存在-80℃。
12. 收集每个样品至少八个神经管半部，以确保足够的产量为下一步骤。池小样本，如果几个电/夹层会话都需要积累的神经管的足够数量。储存足够的样本进行重复或一式三份每个条件。

3.净化RNA和图书馆准备了Illumina的测序

1. 取下-80℃储存样品置于冰上15-30分钟。继续解冻在室温下，直到完成。
2. 涡流井，并在室温离开5分钟。旋涡再次离心以15,000×g离心1分钟以沉淀不溶的物质。
3. 将上清转移到新管中并根据该总RNA分离试剂盒手册说明书进行RNA提取。在洗脱建议的最低量，以增加浓度。
   注:后清理DNase处理建议，以避免在RNA测序数据集的潜在基因组DNA序列的污染。
4. 轻弹管混合内容并删除5微升的质量控制分析。剩余的样品储存于-80℃直至文库制备;这些样品应解冻一次，以避免RNA降解。
5. 运行在生物分析仪器纯化的RNA用RNA 6000纳米试剂盒; RIN值必须至少为7以上进行。
6. 生成使用Illumina公司兼容的RNA测序文库制备试剂库和复用多达4个图书馆的HiSeq仪器设置为产生100 bp的单一读取一条车道。如果可能的话，包括在相同的运行，以尽量减少潜在的技术工件的所有样本。
   注:本应产生高达50万转每个样品，这是绰绰有余的，以获得范围为大多数基因¹³ EADS。

4.银河公共服务器¹⁰比较RNA测序数据集。

注:服务器的存储空间是有限的，并比较多个样品实验，可能需要删除在滤波步骤中生成的中间文件。

1. 在银河公共服务器（创建用户帐户https://usegalaxy.org ）和FTP上传Illumina的数据集FASTQ格式。
2. 准备与FastqGroomer ^14岁以下的NGS工具上传的文件:质量控制和操作菜单;如果质量得分已经编码PHRED + 33（桑格），跳过此步骤只需更改文件类型下的属性为每个数据集fastqsanger。
3. 通过分析在NGS的FastQC工具，每个数据集的总体质量:质量控制和操纵我NU。
   注:应特别注意给予对每个碱基序列的质量和每个碱基序列的内容所得到的图形，因为这些将提供估计用于修剪的读出端的参数。
4. 修剪读取放弃3"使用的工具FASTQ质量微调 ^14岁以下的NGS低质量的数据结束:质量控制和操作菜单。设置该工具只处理3'端的质量分数低于20。
5. 卸下接头序列读取从使用裁剪工具 （ http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ）在NGS:质量控制和操作菜单。设置为丢弃具有小于45 bp的左，输入所使用的适配器的顺序读取，并选择输出到包括剪切和非截取序列的工具。此外，选择不丢弃具有未知碱基序列，因为大多数的低质量的碱中的最后一个步骤中已经除去。
6. 使用工具修剪序列 （ http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ）在NGS:质量控制和操作菜单，修剪第一基地的读取，以消除FastQC检测5'序列偏置（通常为10）。
   注意:在这一点上，它是重新运行FastQC并与前面的分析进行比较，以确定该数据集的质量得到了改善一个好主意。
7. 下载并解压缩最新的鸡基因组组装从Illumina公司iGenomes在UCSC基因组浏览器（ http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn ），并上传了全基因组FASTA格式的文件和基因注释GTF格式文件使用下获取数据菜单中的工具上传文件银河系的历史。
8. 使用下对准TopHat2 ¹⁵地图读出各样品的鸡基因组农工商超市:RNA分析菜单。选择使用从历史基因组（选择步骤4.7上传的FASTA文件）。
9. 建立预测转录使用袖扣 ^16岁以下的NGS每个样本:RNA分析菜单。选择要使用的参考注解为指导（选择步骤4.7上传的GTF文件），打开选项执行偏差校正 （从历史，从步骤4.7 FASTA文件），并使用多读正确 。
10. 合并预测转录使用Cuffmerge ^16岁以下的NGS所有样本:RNA分析菜单。选择要使用的参考注释（GTF文件从步骤4.7）和序列数据（从历史，从步骤4.7 FASTA文件）。
11. 通过比较TopHat2使用Cuffdiff ^16岁以下的NGS每个样品产生BAM文件:RNA分析菜单。在现场笔录中选择了我rged转录由Cuffmerge生成并打开选项执行偏差校正 （从历史，从步骤4.7 FASTA文件），并使用多读正确 。
12. 排序差异表达测试使用的工具排序的筛选下表中列13（Q值）数值上升和排序菜单。
    注:基因/成绩单显示实验条件之间的显著差异表达将呈现最低的Q值。
13. 与覆盖图形直观地检查结果，使用该工具创建的基因组覆盖率 ¹⁷ 下BEDTools菜单BedGraph先转换BAM文件bedGraph格式。禁用报告地区无覆盖，选择将拼接的条目不同的时间间隔，并通过了标准化测序深度被比较的所有数据集的一个因素缩放范围。
14. 使用所产生的bedGraph文件转换为权贵格式工具假发/ BedGraph到大人物 （ http://www.genome.ucsc.edu/ ）在转换格式菜单。上传要人文件作为在UCSC基因组浏览器（自定义轨道http://www.genome.ucsc.edu/ ）为galGal4组件和搜索感兴趣的基因进行可视化的覆盖在所述的数据集。

结果

为了验证所描述的方法，从胚胎电穿孔用空载体机动设备⁷和从胚胎用含有插入物构造SCRT2-ZNF，其编码鸡SCRT2 ¹⁸的锌指结构域的相同向量中的一个样本中生成两个控制样品。样品得到11-22微克总RNA，每个从8至12中的胚胎池获得。所有三个样品中的生物分析仪（ 图1）进行的质量检查得分的10最佳的RIN值，这表明高品质的RNA可以与此协议来获得。

测序?...

讨论

在这里，我们为鸡脊髓电后分析效果的准则。虽然DNA载体进行电穿孔是更频繁地用于过表达感兴趣的基因，还可以使用构建体编码显性阴性，quimeric蛋白或前体的siRNA，以产生基因功能敲低的条件^19-21。事实上，从两个GAIN-和丧失功能的分析得到的转录概况比较可以指出差异表达的基因在相反的方式中的每个条件，因此具有潜在地发现更多的具体效果。

如任何方法下游?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Indian ink	Any supplier
18G x 1 1/2 needle	BD	305196
3 ml syringe	BD	309657
Tris	MP Biomedicals	819620
F D & C Blue 1	Spectra Colors Corporation	5.FC.0010P0	Food Dye used to visualize DNA injection
Ringer's solution (1 L)
- 7.2 g NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
- 0.37 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
- 0.225 g CaCl2•2H2O	Fisher Scientific	10043-52-4
- 0.217 g Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0.02 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
- ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4
- ddH2O to 1 L
- Filter and autoclave
PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L)
- 8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
- 0.2 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
- 1.15 g Na2HPO4•7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0.2 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
- ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2
- ddH2O to 1 L and filter
- 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate)	Sigma-Aldrich	D-5758
- Shake vigorously and let stand overnight at room temperature
- Autoclave
Sieved spoon	Any supplier
Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes	Corning Life Sciences	351007
RNaseZap RNase decontamination solution	Life Technologies	AM9780
Fine point surgical scissors	Any supplier
Straight fine point tweezers	Any supplier
Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes	Kimble Chase	40A502
9'' glass Pasteur pipette	Any supplier
Manual pipette pump	Any supplier
Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes	Corning Life Sciences	MCT-150-C
Microcentrifuge	Any supplier
RNAlater solution for RNA stabilization	Life Technologies	AM7020
RNAqueous total RNA isolation kit	Life Technologies	AM1912
Molecular Biology Grade Ethanol	Any supplier
RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies	5067-1511
2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies	G2939AA
Truseq RNA Sample Preparation Kit v2	Illumina	RS-122-2001/RS-122-2002