RNA-Seq Análise de Gene Expression Diferencial em electroporados Pintainho Embryonic Medular

Resumo

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

Resumo

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

Introdução

Estudos genéticos sobre os organismos vivos utilizam frequentemente o embrião de galinha como modelo porque em eletroporação in ovo representa uma forma rápida e barata para transf parcialmente estruturas embrionárias in vivo com DNA constrói ^1-5. Vectores de expressão bicistrónicos que codificam um transcrito contendo um repórter fluorescente em conjunto com o gene de interesse, tais como PCIG ⁶ ou ⁷ PMES, permitir a verificação rápida da qualidade transfecção na região desejada sob um microscópio estereoscópico antes de processar os embriões para análise a jusante.

Com os recentes avanços na sequenciação de ADN, é agora possível obter perfis de expressão transcriptoma digitais inteiras a partir de amostras de ARN utilizando ^ARN-8,9 Seq. Portanto, em vez de métodos demorados que permitem a análise de apenas alguns produtos de genes em paralelo, tais como hibridação in situ, imuno-histoquímica e qPCR, preparação de bibliotecas de cDNA parade alto rendimento seqüenciamento pode fornecer informações de todo o transcriptoma. Observação dos efeitos experimentais sobre os níveis de cada gene único de expressão podem, por sua vez fornecem insights poderosos sobre os percursos alterados pela construção usado. Isto é particularmente fácil, se uma montagem genómico para o organismo utilizado, está disponível, assim, o embrião de galinha é novamente um modelo adequado.

Se o usuário tem acesso a um centro de sequenciamento do genoma de confiança, a questão principal é a obtenção de amostras de RNA de alta qualidade. Este trabalho demonstra um método para a obtenção de amostras de ARN a partir de tubos neurais transfectadas adequadas para a RNA-Seq, bem como os passos a jusante para a análise in silico dos conjuntos de dados resultantes. Após eletroporação em HH12-13 seguido de 48 horas de incubação, tronco transfectadas metades da medula espinhal foram dissecados em condições livres de ribonuclease, imediatamente lisadas e mais protegida da degradação por ultra-baixo de congelamento até purificação RNA e biblioteca preparatião.

O servidor público Galaxy ¹⁰ fornece acesso a recursos livres para análise de dados de sequenciamento de alto rendimento. A quantidade de espaço oferecido para usuários registrados é suficiente para pequenos experimentos, eliminando assim a necessidade de infra-estrutura computacional local. A análise de dados de RNA-Seq inclui filtragem, alinhamento e quantificação / Comparação da expressão do gene. Embora existam diretrizes gerais para a análise de dados de RNA-Seq, parâmetros de filtragem dependerá em grande parte a qualidade do sequenciamento e deve ser determinada após a análise dos dados brutos de controle de qualidade.

Este protocolo descreve os passos para obter e comparar os perfis de RNA-Seq de frango embrionário medulas espinhais transfectadas in vivo. Como um resultado representativo, a comparação de conjuntos de dados obtidos a partir de duas amostras de controlo independentes transfectadas com um vector vazio mostraram que o método é reprodutível e deve permitir a identificação de expres diferencialmentetranscrições sed em amostras experimentais. Portanto, a aplicação deste método tem o potencial para aumentar grandemente o número de descobertas após uma única experiência e, assim, proporcionar um grande conjunto de dados para investigação posterior.

Protocolo

1. electroporate do construto de interesse nos tubos neurais da HH12-13 frango embriões no ovo

Usar um repórter fluorescente, de preferência, em uma transcrição bicistr�ica ou fundido com a proteína de interesse com um péptido intercalante 2a viral ^11, para permitir uma rápida identificação de indivíduos com níveis satisfatórios de transfecção. NOTA: O tempo de incubação típico para esta fase é de cerca de 48 horas a 37,8 ° C.

1. Abrir uma pequena janela em que os ovos após a remoção de 3 ml de albumina com uma seringa acoplada a um 18 G x 1 1/2 agulha. Para melhorar a visualização do embrião, injetar uma pequena quantidade de tinta nanquim diluída 1:50 em solução de Ringer estéril sob o embrião ^1-4.
2. Depois de cobrir o embrião com a solução estéril de Ringer, injectar uma solução de 10 mM Tris-HCl, pH 8,2 e 0,1% Corante Alimentar (F, D e C) contendo 2,5 mg / mL de ADN através da extremidade posterior do tubo neural, até que preenchaaté a região hindbrain. Para electroporate, eletrodos de platina posição (0,5 milímetros de diâmetro) separados por quatro milímetros ao longo de ^uma região do flanco e entregar cinco pulsos de 50 ms e 20 V com um intervalo de 100 ms entre eles ^4.
3. Após eletroporação, incubar os embriões manipulados por 48 horas mais até atingirem estágio HH23 e identificar indivíduos com alto nível de transfecção na região flanco sob microscópio estereoscópico fluorescente.
   NOTA: A duração da incubação após a electroporação depende do objectivo da experiência. Os plasmídeos eletroporados pode gerar níveis de expressão significativa após 2 horas ^2. Assim, se o interesse reside nos genes de início precoce do período de incubação pós-electroporação pode ser reduzida.

2. Colheita sucesso Transfected Embriões e dissecar as Metades Medula Espinhal electroporados

NOTA: Este procedimento dura 2-3 horas para cada 10 embriões e rendimentos 1-2 Ug de RNA total por embrião. A dissecção de tubos neurais requer movimentos finos e algumas sessões de prática pode ser necessária antes de aplicá-lo a amostras experimentais.

1. Descontaminar instrumentos de dissecação metálicas com solução de descontaminação de RNase ou por cozedura a 150 ° C durante 4 h ¹² e preparar tratada com DEPC PBS. Use somente novo plasticware livre de RNase certificado.
   NOTA: Após a colheita, é importante seguir o tratamento padrão para evitar a contaminação RNase durante a dissecção.
2. Colher os embriões usando um par de tesouras de dissecação multa e uma colher coleção peneirada. Manter os embriões no frio tratada com DEPC PBS numa placa de Petri de 100 milímetros.
3. Com um par de pinças finas, cortar a região do flanco inteiro (entre o limite posterior do broto de membro anterior eo limite anterior do broto de membro posterior) e transfira esta seção para um novo prato contendo frio tratados com DEPC PBS.
4. Use duas agulhas de vidro finos para perfurar em três diferentesaponta em cada lado dorsolateral do embrião entre o tubo neural e da mesoderme paraxial.
5. Introduzir as duas agulhas de vidro na perfuração central e mover-se lentamente uma delas distância ao longo do tubo do eixo ântero-posterior neural. Repita esse procedimento para as perfurações que não foram alcançados pelos primeiros movimentos. Retire a mesoderme paraxial isolada com um par de pinças finas.
6. Ligue o embrião lateralmente, inserir as pontas das pinças entre o tubo neural e da notocorda e deslizá-los em sentidos opostos ao longo do eixo ântero-posterior para separar as duas estruturas.
   NOTA: Este também deve remover a maior parte da mesoderme ainda ligado ao tubo neural.
7. Se necessário, retire todos os pedaços maiores de tecido mesodérmica que permanecem ligados puxando com um par de pinças, enquanto levemente segurando o tubo neural com outro par de pinças. Quando terminar, gentilmente transferir o tubo neural para outro prato contendo frio tratados com DEPC PBS usando umLivre de RNase pipeta de Pasteur de vidro acoplado a uma bomba de pipeta manual e manter em gelo até que todos os tubos são dissecados.
8. Dividir os tubos neurais em duas metades. Para isso, insira a ponta afiada de um par de pinças fechado na luz e abrir a placa de telhado movendo a pinça para fora através dele. Após isso, separar as metades cortando a placa de piso com as pontas pinças.
9. Ordenar electroporadas a partir de metades não-electroporado sob um escopo de dissecação fluorescente e transferir para um tubo de 1,5 ml cheio com gelado tratada com DEPC PBS. Se necessário, os microtubos agite suavemente para libertar qualquer tecido ligado às paredes de plástico e para promover a sedimentação dos tubos.
10. Rotação a 100 xg por 3 segundos e remover muito lentamente, tanto PBS possível com uma micropipeta de 1 ml. Faça isso enquanto olha para uma fonte de luz que brilha através do microtubo para monitorar se qualquer material embrionário é sugado para a ponta da pipeta; se isso acontecer, lentamente descarregar e repita a centrifugação.
11. Adicionar 70 ml de solução de lise para extração de RNA por tubo neural metade e apertar o tubo para misturar o conteúdo. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min e vórtex vigorosamente. Repetir a 5 min de incubação e vórtex mais duas vezes. Armazenar a -80 ° C.
12. Recolher pelo menos oito metades do tubo neural por amostra para garantir um rendimento adequado para o passo seguinte. Piscina amostras menores se várias sessões de eletroporação / dissecação são obrigados a acumular número suficiente de tubos neurais. Armazenar amostras suficientes para duplicatas ou triplicatas para cada condição.

3. Purify RNA e Prepare Bibliotecas para Illumina Sequencing

1. Retirar amostras de -80 ° C de armazenamento e colocar no gelo por 15-30 min. Retomar o descongelamento à temperatura ambiente até estar completa.
2. Vortex bem e deixe em temperatura ambiente por 5 min. Vortex e centrifuga-se novamente a 15000 xg durante 1 min para sedimentar o material insolúvel.
3. Transferir o sobrenadante para um novo tuboe proceder à extração de RNA de acordo com as instruções de isolamento de RNA total de manuais kit. Eluir no volume mínimo recomendado para aumentar a concentração.
   NOTA: tratamento DNase após clean-up é recomendado, a fim de evitar a contaminação potencial de sequências genômicas de DNA em RNA-Seq conjuntos de dados.
4. Flick o tubo para misturar o conteúdo e remover 5 mL para análise de controle de qualidade. Armazenar o restante amostra a -80 ° C até à preparação da biblioteca; estas amostras devem ser descongeladas apenas uma vez para evitar a degradação do RNA.
5. Executar RNA purificado em um instrumento Bioanalyzer usando o kit RNA 6000 Nano; RIN valor deve ser, pelo menos, acima de 7 para prosseguir.
6. Gerar bibliotecas usando um kit de preparação biblioteca RNA-Seq compatível Illumina e multiplexar até quatro bibliotecas em uma pista de um instrumento HiSeq definido para gerar 100 pb única lê. Se possível, inclua todas as amostras no mesmo prazo para minimizar potenciais artefatos técnicos.
   NOTA: Este deve produzir até 50 milhões de rEADS por exemplo, que é mais do que suficiente para obter cobertura para a maioria dos genes ^13.

4. Compare os conjuntos de dados de RNA-Seq no Servidor Público Galaxy ^10.

NOTA: o espaço de armazenamento do servidor é limitado e experimentos comparando muitas amostras podem requerer a exclusão de arquivos intermediários gerados nas etapas de filtragem.

1. Criar uma conta de usuário no servidor público Galaxy ( https://usegalaxy.org ) e FTP upload dos conjuntos de dados Illumina em formato fastq.
2. Prepare os arquivos enviados com a ferramenta FastqGroomer ¹⁴ do NGS: menu de QC e manipulação; se os índices de qualidade já são codificados em Phred + 33 (Sanger), ignore esta etapa, simplesmente mudando o tipo de arquivo para fastqsanger sob os atributos para cada conjunto de dados.
3. Analisar a qualidade geral de cada conjunto de dados usando a ferramenta FastQC sob a NGS: QC e manipulação menu.
   NOTA: Deve ser dada especial atenção aos gráficos resultantes para o conteúdo sequência de bases por qualidade sequência de bases e por, como estes irão fornecer estimativas para os parâmetros usados ​​para aparar as extremidades da lê.
4. Aparar lê descartar 3 'com dados de baixa qualidade, utilizando a ferramenta FASTQ Qualidade Trimmer ¹⁴ do NGS: menu de QC e manipulação. Definir a ferramenta para processar apenas 3 'para o índice de qualidade inferior a 20.
5. Remover seqüências adaptadoras de lê usando a ferramenta Clip ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) sob a NGS: menu de QC e manipulação. Definir a ferramenta para descartar leituras com menos do que 45 bp para a esquerda, a sequência de entrada do adaptador usado e escolher a saída de modo a incluir ambas as sequências cortadas e não-cortadas. Além disso, optar por não descartar sequências com bases desconhecidos pois a maioria das bases de baixa qualidade já foram removidos na última etapa.
6. Usando a ferramenta de sequências de guarnição ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ), sob a NGS: QC e menu de manipulação, apare as primeiras bases da lê para remover 5 'viés seqüência detectada por FastQC (normalmente 10).
   NOTA: Neste ponto, é uma boa idéia para executar FastQC novamente e comparar com a análise anterior para determinar se a qualidade do conjunto de dados foi melhorada.
7. Baixe e descompacte o mais recente montagem do genoma da galinha para o navegador genoma UCSC de Illumina iGenomes ( http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn ) e fazer o upload de todo o arquivo de formato genoma fasta eo arquivo de formato GTF anotação genes para a história da galáxia utilizando a ferramenta de upload de arquivos no menu Obter dados.
8. Mapa lê para cada amostra para o genoma de galinha utilizando o alinhador TopHat2 ¹⁵ sobos NGS: menu de Análise RNA. Escolha usar um genoma de História (selecione o arquivo fasta carregado no passo 4.7).
9. Construir um transcriptoma previsto para cada amostra usando abotoaduras ¹⁶ sob as NGS: menu de Análise RNA. Escolha usar anotação de referência como guia (selecione o arquivo GTF carregado no passo 4.7) e ativar as opções de realizar correção de viés (de História, arquivo fasta do passo 4.7) e usar multi-leitura correta.
10. Mesclar transcriptomes previstos para todas as amostras usando Cuffmerge ¹⁶ sob a NGS: Menu Análise de RNA. Escolha usar anotação de referência (arquivo GTF do passo 4.7) e dados de sequências (de História, arquivo fasta do passo 4.7).
11. Compare arquivos BAM gerados por TopHat2 para cada amostra usando Cuffdiff ¹⁶ sob a NGS: Menu Análise RNA. Nas transcrições de campo, selecione a metranscriptoma rged gerado pelo Cuffmerge e ativar as opções de realizar correção de viés (de História, arquivo fasta do passo 4.7) e usar multi-leitura correta.
12. Ordenar expressão diferencial testar tabelas numericamente ascensão na coluna 13 (valor q) usando o Sort ferramenta sob o menu Filtro e classificar.
    NOTA: Genes / transcrições mostrando expressão diferencial significativa entre as condições experimentais serão apresentados os valores de q menores.
13. Para verificar os resultados visualmente com gráficos de cobertura, primeiro converter arquivos para o formato BAM bedGraph utilizando a ferramenta Criar um BedGraph de cobertura do genoma ¹⁷ sob o menu BEDTools. Desativar relatório de regiões sem cobertura, escolha para tratar entradas emendados como intervalos distintos e dimensionar a cobertura por um fator que normaliza profundidade sequenciamento para todos os conjuntos de dados que estão sendo comparados.
14. Converter o arquivo para o formato bedGraph resultando figurão usando oferramenta peruca / BedGraph-a-mandachuva ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) no menu Formatos converter. Faça o upload dos arquivos bigwig como faixas personalizadas no navegador UCSC genoma ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) para a montagem galGal4 e procurar um gene de interesse para visualizar a cobertura nos conjuntos de dados.

Resultados

Para validar o método descrito, duas amostras de controlo foram gerados a partir de embriões electroporadas com as PMEs de vetores vazios ⁷ e uma amostra a partir de embriões transfectadas com o mesmo vector contendo a inserção construir SCRT2-ZnF, que codifica os domínios dedo-de-zinco de frango SCRT2 ^18. As amostras de RNA total produzindo 11-22 g cada foram obtidos a partir de misturas de 8 a 12 embriões. Todas as três amostras teve um valor óptimo RIN em 10 de um controlo de qualidade ...

Discussão

Aqui nós fornecemos orientações para a análise dos efeitos após a eletroporação do frango medula espinhal. Embora eletroporação de vetores de DNA é mais freqüentemente usado para superexpressão de um gene de interesse, pode-se também usar construções que codificam negativos dominantes, proteínas quimeric ou precursores de siRNAs para gerar condições de função do gene knock-down ^19-21. Na verdade, a comparação de perfis de transcriptoma resultantes de ambos gain- e análise por perda de f...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Indian ink	Any supplier
18G x 1 1/2 needle	BD	305196
3 ml syringe	BD	309657
Tris	MP Biomedicals	819620
F D & C Blue 1	Spectra Colors Corporation	5.FC.0010P0	Food Dye used to visualize DNA injection
Ringer's solution (1 L)
- 7.2 g NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
- 0.37 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
- 0.225 g CaCl2•2H2O	Fisher Scientific	10043-52-4
- 0.217 g Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0.02 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
- ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4
- ddH2O to 1 L
- Filter and autoclave
PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L)
- 8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
- 0.2 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
- 1.15 g Na2HPO4•7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0.2 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
- ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2
- ddH2O to 1 L and filter
- 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate)	Sigma-Aldrich	D-5758
- Shake vigorously and let stand overnight at room temperature
- Autoclave
Sieved spoon	Any supplier
Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes	Corning Life Sciences	351007
RNaseZap RNase decontamination solution	Life Technologies	AM9780
Fine point surgical scissors	Any supplier
Straight fine point tweezers	Any supplier
Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes	Kimble Chase	40A502
9'' glass Pasteur pipette	Any supplier
Manual pipette pump	Any supplier
Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes	Corning Life Sciences	MCT-150-C
Microcentrifuge	Any supplier
RNAlater solution for RNA stabilization	Life Technologies	AM7020
RNAqueous total RNA isolation kit	Life Technologies	AM1912
Molecular Biology Grade Ethanol	Any supplier
RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies	5067-1511
2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies	G2939AA
Truseq RNA Sample Preparation Kit v2	Illumina	RS-122-2001/RS-122-2002