الفسيولوجية تسجيلات وRNA تسلسل الزوائد ذوقي من البعوض الحمى الصفراء<em&gt; الزاعجة المصرية</em

Summary

باستخدام طريقتين لتقدير التعبير الجيني في الزوائد الذوقية الرئيسية للبعوض Aedes aegypti، حددنا مجموعة من الجينات مزعومة الكامنة وراء الاستجابة العصبية لمركبات المريرة ومثير للاشمئزاز، على النحو الذي يحدده الفحص الكهربية.

Abstract

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

Introduction

وقد أظهرت مركبات مثل DEET، Picaridin، Citronellal وIR3535 لصد البعوض بشكل فعال، بما في ذلك ناقلات الأمراض المهم الزاعجة المصرية ^1،2. نسجل إمكانات العمل من الخلايا العصبية الحسية المرتبطة sensilla الذوقية محددة لتحديد الخلايا المشاركة مع البعوض صد. إلى جانب التسلسل المصب من الجينات التي أعرب عنها في هذه الأنسجة، ونحن قد التعرف على الجينات على الأرجح التوسط في ردود هذه الخلايا من أجل فحص مركبات جديدة لتحسين قدرات صد.

RNA وما يليها هو أداة قوية، لتصبح بسرعة قياسية لتتبع التغيرات الزمانية والمكانية في التعبير الجيني. يحلل RNA وما يليها من الزوائد حسي كيميائي الحشرات واستخدمت أجهزة للكشف عن مستقبلات الجزيئية في العديد من أنواع الحشرات ^3-5، وتحسين كبير على التقليدي القائم على PCR البحث الجين بواسطة الجينات ^6. الحشرات تمثل الطبقة الحيوان الأكثر تنوعا، قبلsenting العديد من الفرص لدراسة العلاقة بين الجينات والظواهر فريدة من نوعها. ويمكن استخدام تكنولوجيا RNA وما يليها على أي نوع من الأنسجة الحشرات الحية. وبالمثل، تسجيل الكهربية من الخلايا الحسية داخل sensilla الذوقية uniporous لا يمكن أن يتحقق في كثير من أنواع الحشرات المختلفة. الاقتران من هذه التقنيات اثنين يسمح للباحثين لتضييق الجينات مجموعة تشارك في النمط الظاهري حسي كيميائي لوحظ. سوف الأنواع المختلفة تشكل تحديات محددة، ولكن قد تبلغ العلاقة بين جينات مستقبلة حسي كيميائي والتكيف حسي كيميائي. حجم ومورفولوجية حسي كيميائي sensilla هو متغير واستكشاف الأخطاء وإصلاحها قد تتطلب واسعة النطاق عند تسجيل إمكانات العمل للحد من الضوضاء وتحديد إشارات متكررة. تشريح أجهزة حسي كيميائي قد تكون تافهة أو حساسة تستغرق وقتا طويلا، اعتمادا على التشكل وحجم الحشرة. انتعاش عالية الجودة RNA قد تتطلب بعض استكشاف الأخطاء وإصلاحها كذلك، مثل تجنب بعض أصباغ خلالجمع الأنسجة.

بينما يدل على آثار مركبات مضادة للمن خلال التجارب السلوكية غير المباشر والمفيد، وهذا النهج هو الوقت مكثفة واسعة فيما يتعلق بآلية العمل. الكهربية إلى جانب RNA-يليها تسمح للتحليلات أكثر تحديدا من ما يدفع السلوكيات تجنب في الحشرات. مرة واحدة وقد تم التعرف على "أدوات" التمييز الكيميائية في أنواع الحشرات، ومحاولات أكثر تحديدا لتحسين على المواد الطاردة للتعرف ممكنة. ويمكن التعبير عن مستقبلات والبروتينات المرتبطة بها في الخلايا الحسية المسؤولة عن هذه السلوكيات heterologously للفحص الكيميائي المباشر. وعلاوة على ذلك، يمكن النمذجة الجزيئية ويتوقع المواد الكيميائية والتي سوف تثير ردود قوية من هذه المستقبلات ^7.

قد تكون لقطة من جميع الجينات النشطة في مجموعة ضيقة من الأنسجة حسي كيميائي مفيد أيضا في تحديد جينات مشابهة في الأنواع الأخرى. عن طريق التماثل تسلسل والتعبير سيmilarities، قد شكل الباحثون مجموعة من المستقبلات الجزيئية الأرجح التوسط الردود على المواد الطاردة التي هي فعالة على نطاق واسع على الحشرات. نقدم بروتوكول التالية لمساعدة الباحثين في تفكيك مسارات حسي كيميائي الحشرات وإقناع أكثر الخوض في neuroethology عدم نموذج والحشرات الهامة اقتصاديا.

Protocol

1. تربية عزت. الكبار بعوض

1. يفقس البيض في حوالي ¾ بوصة المياه في صينية ضحلة. سوف الاكتظاظ تقليل حجم البالغين.
2. اليرقات الخلفية عند 25 ° C (12-HL: 12-HD)، وإطعام الطعام الأسماك الأرض.
   ملاحظة: الإفراط في الغذاء قد يقلل من معدلات البقاء على قيد الحياة.
3. إزالة الشرانق بشكل فردي عن طريق ماصة باستير يوميا ونقلها إلى أطباق البلاستيك (9 سم × 5.5 سم) داخل الدلاء الاحتواء صغيرة مع الأغطية شبكة غرامة، وبالتالي إنشاء 24 تجمعات سن ساعة.
4. البعوض البالغ تغذية 10٪ محلول السكروز بواسطة كرة من القطن وضعت على جدران شاشة السكن قفص البعوض في غرفة البيئية في 27 ° C والرطوبة النسبية 70٪ تحت نفس الضوئية واليرقات.
5. لالكهربية، استخدم 5-10 الحيوانات القديمة اليوم. بشكل عام، فإن الحيوانات الكبيرة تنتج نتائج أفضل. لعزل الحمض النووي الريبي، واستخدام الحيوانات التي تدخل في نطاق واحد 24 ساعة تجمع العمر في نطاق من العمر 5-10 يوم.

الحمار = "jove_title"> 2. إعداد مواد كيميائية

1. تحديد تركيز مناسب من بالكهرباء (مثل 1-10 ملم) الذي يتسبب الحد الأدنى من النشاط من الخلايا العصبية الحسية المحدد. 10 ملي كلوريد الصوديوم أو 1MM بوكل هي الشوارد معقولة لاختبار النشاط الأساسي عند بداية التجربة.
2. حل لكل مادة كيميائية تجريبية في مذيب مناسب (إن لم يكن الماء، واستخدام الإيثانول أو DMSO) الذي ليس له أثر يذكر أو معدومة على تصاعد النشاط بالمقارنة مع بالكهرباء وحدها. تركيزات النهائي من 10٪ من الإيثانول أو 1٪ DMSO هي تركيزات انطلاق معقولة.
3. اختر المناسب (مثل الكينين للمرارة أو السكروز للالحلوة) المواد الكيميائية السيطرة التي تم وصفها جيدا ردع التغذية أو المنشطات في الحشرات.

3. الكهربية (تسجيل غيض ^8؛ الشكل 1)

1. أقطاب الزجاج شكل ميكانيكيا عن طريق سحب الزجاج الشعيرات الدموية. تحسين الحرارة وسحب إعدادات لسحب الزجاج لتشكيل recordi شكل بشكل مناسبأقطاب NG. كسر بعناية قبالة نهاية الزجاج الكهربائي باستخدام ملقط تشريح تحت المجهر لخلق قطب كهربائي طرف فتح التي هي واسعة بما يكفي لالمغلف Sensillum والهدف، ولكن صغيرة بما يكفي لتجنب الاتصال مع الهياكل المجاورة.
2. تحت المجهر، وتحديد بصريا عن طريق التشكل ووضع الهدف sensilla / Sensillum وللتأكد من التكرار من تسجيل معلومات سرية. الحيوانات الإعدادية للسماح بالوصول الحر إلى sensilla من زاوية دخول القطب.
3. الحشرات تخدير الكبار الباردة في الثلاجة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. تجنب الأضرار التي لحقت الخلايا العصبية الطرفية عن التعرض المفرط لدرجات الحرارة الباردة. قطع شرائط ضيقة من شريط السلوفان مع شفرة الحلاقة على شريحة زجاجية. شل حشرة كاملة على شريحة زجاجية باستخدام شرائط ضيقة.
4. أدخل سلك التنغستن شحذ كيميائيا إلى القفص الصدري الظهري أو العين لتكون بمثابة مبال (الأرض) القطب.
5. ملء الزجاج الكهربائي في الخطوة 3.1 مع حل محفزة للاهتمام. باستخدام حقنة إدراجها، وملء غطاءillary من نهاية سحبت لفظة نهاية. نفض الغبار من جميع فقاعات الهواء، وعقد نهاية سحبت إلى أسفل. إدراج الأسلاك الفضية (chloriding اختياري) في الزجاج الكهربائي في الخطوة 3.1 لتكون بمثابة تسجيل وتحفيز الكهربائي.
6. توصيل الأقطاب الكهربائية إلى المضخم التي تم تصميمها لتسجيلات من الاتصال sensilla chemoreceptive في الحشرات. وهذا المضخم (300 هرتز، 3 كيلو هرتز ممر الموجة مرشح) تقليل الوقت تسوية للقبض على نشاط الخلايا العصبية أقرب إلى التحفيز مقدمة ممكن. جمع وتخزين وتحليل الإشارات الكهربائية باستخدام الحواسيب الصغيرة مجهزة برنامج تسجيل ارتفاع.
   ملاحظة: الأرضي الإعداد التسجيل بشكل صحيح قد يحسن بشكل كبير نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
7. تحفيز sensilla مع حل التحكم (المنحل بالكهرباء فقط) لضمان الأداء الوظيفي. عدد المسامير ابتداء من 200 ميللي ثانية بعد قطعة أثرية التحفيز لجميع الاستعدادات.
8. بطريقة عشوائية ترتيب المواد الكيميائية اختبار لجميع التجارب، باستثناء دراسات الجرعة والاستجابة،للقضاء على التحيز. للدراسات الجرعة والاستجابة، فضح sensilla إلى زيادة تركيزات هذه المادة الكيميائية التجريبية. سماح لا تقل عن 3 دقيقة بين التحفيز لضمان استرداد كاف.
   ملاحظة: قد تختلف هذا الشرط اعتمادا على الحشرات وsensilla. ويعرف عتبة كما أن التركيز الذي لا تتداخل مع الخطأ المعياري الخطأ المعياري للاختبار أقل تركيز.

4. عزل RNA وتسلسلها (الشكل 2)

1. إعداد المناسب بإحكام المدقات خالية من ريبونوكلياز عن طريق التبريد لهم على الثلج الجاف قبل الأنسجة disruption.Prepare المرافق المدقات خالية من ريبونوكلياز التي تناسب أنابيب غطاء مبكرة بإحكام. حافظ على أنابيب جمع مغلقة ما لم تشريح بنشاط لتجنب تكاثف الزائد.
2. باستخدام الشافطة تصفيتها، ضع 30 إلى 40 البعوض الباردة تخدير (15 ثانية في الثلاجة -20 درجة مئوية) على خشبة المسرح الباردة والفرز حسب الجنس. مكان الحيوانات الظهرية الجانب السلبي، واستيعاب أجنحة للا ضرر الزوائد الذوق.
3. باستخدام اثنين من أزواج من ملقط غرامة، تشريح labella الموثوقة أو الرصغي من الذكور أو الإناث تحت المجهر تشريح والحد إدراج الأنسجة المجاورة.
   ملاحظة: 500 labella يقترن ينتج حوالي 800-1،000 نانوجرام من إجمالي مرنا. 400 الرصغي الفردي (5 شرائح لكل منهما) تسفر 1،200-1،800 نانوجرام من إجمالي مرنا.
4. مع زوج واحد من يلهث-ملقط، فهم طفيفة خرطوم البعوض فقط القريبة إلى labella تعريض قلم دقيق الداخلية. استخدام زوج آخر من جمع-ملقط، إزالة labella وإضافة إلى الأنسجة الجانب من أنبوب جمع البارد.
5. مع زوج واحد من ملقط، فهم طفيفة في الساق البعوض في تقاطع الساق وأول جزء الرصغي. استخدام زوج آخر من الملقط، وإزالة الرصغي وإضافة إلى الأنسجة الجانب من أنبوب جمع البارد.
   ملاحظة: خذ بعين الاعتبار أنواع الخلايا في واجهة من الأنسجة أراد وغير المرغوب فيها. في حين أنه من المهم للحد من إدراج الأنسجة المجاورة، من المهم أيضا أن لا حذف أجزاء من الأنسجة المطلوب. وفايعينة نال يجب أن تمثل بدقة الجهاز بأكمله من الفائدة. إنشاء حدود الدقيق مع ملقط استيعاب مثل هذا ملقط جمع يمكن تحرير بدقة عن طريق كشط أو الاستيلاء على الأنسجة المطلوب فقط.
6. دوري، وتدور أسفل أنبوب جمع لفترة وجيزة في 0 ° C الطرد المركزي في 9،000 x ج للحفاظ على الأنسجة في الجزء السفلي من الأنبوب. إذا يتراكم الرطوبة في أنابيب جمع خلال تشريح، إضافة 50uL من كاشف Trizol البارد لتغطية الأنسجة التي تم جمعها.
7. باستخدام المضادة للطخة مختبر علامة، تسمية بوضوح واحدة خالية من ريبونوكلياز 1.5 مل المفاجئة أنبوب غطاء لكل نوع الأنسجة لجمع. باستخدام 1.5 مل أنبوب رف والنيتروجين السائل، وتجميد ثم طحن الأنسجة الى مسحوق ناعم (القطع الجميلة إذا كان في Trizol). أكرر مرة واحدة. جلب إجمالي حجم Trizol إلى 1 مل و resuspend الأنسجة الأرض من قبل vortexing.
8. إضافة 200 UL من الكلوروفورم وتخلط جيدا. بعد 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتدور عليها في أجهزة الطرد المركزي في 4 ° C و11،000 x ج لمدة 15 دقيقة. بعنايةإضافة طبقة مائية مباشرة إلى عمود مرشح الحمض النووي الجيني. تدور باستمرار في 11،000 ز س لمدة 5 دقائق. إضافة حجم مساو من ريبونوكلياز خالية الايثانول 70٪ في التدفق من خلال وتخلط بواسطة الماصة. نقل السائل إلى عمود جمع RNA ومواصلة استخراج الحمض النووي الريبي فقا للتعليمات المقدمة.
9. قياس وتقييم نقاء من إجمالي RNA على معمل الدقة والمضي قدما مع أي وسيلة RNA تسلسل قياسي.

5. الكمي RT-PCR RNA التحقق من صحة التسلسل (الشكل 3)

1. اختر العديد من الجينات ممكن لمقارنة مستويات التعبير الجيني النسبية على نطاق ديناميكي، سواء في توقع وفرة تسلسل ويفترض وظيفة الجين حسي كيميائي.
2. أزواج التصميم التمهيدي لكل الجين المستهدف لتضخيم 100-180 basepair PCR منتج معين. استبعاد التضخيم gDNA غير محددة من خلال ضمان التمهيدي واحد على الأقل لكل مجموعة يمتد على الحدود إنترون. بدلا من ذلك، استخدم العلاج الدناز للحد من التلوث الجيني.
3. جمعالأنسجة الحشرات كما هو موضح في القسم السابق. حساب مقدار الأنسجة هو مطلوب لتوفير ما يكفي من RNA لاستكمال جميع ردود الفعل QRT-PCR.
   ملاحظة: سوف ثلاث نسخ البيولوجي وردود الفعل ثلاث نسخ الفنية توفير أقصى قدر من الثقة في النتائج.
4. حساب الكمي الجين النسبي كما X _الهدف ^{- (ط م [الهدف] -Ct [إشارة])} لكل جينة المستهدفة والمتوسط ​​لكل تكرار، سواء البيولوجية والتقنية. استخدام الجينات التدبير المنزلي (ق) لتطبيع القيم ط بين مكررات البيولوجية وللقضاء على نطاق وY-axis في مقارنات التعبير النسبي.
5. تقييم تشابه RNA وما يليها ومجموعات البيانات QRT-PCR باستخدام القائمة على الانحدار، التمهيد إجراء التكافؤ ^9، تطبيق تكرارا، إلى البيانات من كل الأنسجة.
   ملاحظة: يحدد هذا الإجراء أصغر "المنطقة التشابه" التي يمكن بناؤها حول البيانات RNA تسلسل وQRT-PCR الملحوظ، والسماح للالتعبير الجيني النسبي مقاسا qRT-PCR للنظر يعادل إحصائية لقياس التعبير الجيني النسبي التي كتبها RNA وما يليها.

النتائج

التسجيلات أثر للإمكانات العمل من عزت. sensilla الذوقية بعوض (الشكل 1) تثبت فعالية التحفيز المباشر مع مجموعة من المواد الكيميائية. هذه التقنية يمكن استخدامها لقياس ردود على أي مادة كيميائية محفزة عن طريق عد المسامير من السعة معين ومدة على نطاق وزمنية مع?...

Discussion

الجانب الأكثر تحديا من إمكانات العمل تسجيل من sensilla ذوقي هو الذي يقرر الردود هي "طبيعية"، وعندما تستخدم Sensillum واحدة الذوقية غيض تسجيل أول مرة لأنواع الحشرات معين، فإن العدد الإجمالي والحساسيات من الخلايا العصبية المستقبلة الذوقية (GRNs) هي غير معروف على الأرجح. ويط...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass capillary	A-M Systems	628000	Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4"
Silver wire	A-M Systems	7875	.015" bare
Tungsten wire	Alfa Products	369	0.127 mm diameter
Fine forceps	Fine Science Tools	11252	#5SF Inox
Refridgerated stage	BioQuip Products	1429	Chill Table
Preamplifier	Syntech	Taste Probe	preamplifier
Software for electrophysiology	Syntech	Autospike	software for electrophysiology
TetraMin fish food	Tetra	Tropical fish food granules	fish food ground to fine powder
TRIzol	Life Technologies	15596-026	RNA isolation reagent
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74136	includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns
Nanodrop spectrophotometer	Nano Drop Products	ND-1000	tabletop spectrometer
R statistics	freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka)	www.r-project.org	Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment.
1.5 ml tube rack	Evergreen	240-6388-030	Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue.
1.5 ml collection tubes with pestle	Grainger	6HAX6	RNase free
Centrifuge	Thermo Scientific	11178160	Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube.
Primer-BLAST Primer Designing tool	NCBI	n/a