Физиологические Записи и РНК Секвенирование Вкусовые придатков Желто-лихорадки комаров<em&gt; Комар желтолихорадочный</em

Резюме

Использование двух методов оценки экспрессии генов в крупных вкусовых придатков Комар желтолихорадочный, мы определили набор генов, предположительно, лежащих в основе нейронных ответов на горьких и отталкивания соединений, а определяется электрофизиологического исследования.

Аннотация

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

Введение

Соединения, как DEET, Picaridin, цитронеллаль и IR3535 было показано, что эффективно отпугивания комаров, в том числе важных переносчиков болезней Комар желтолихорадочный ^1,2. Мы записываем потенциалы действия от сенсорных нейронов, связанных с конкретной вкусовой сенсилл для определения клеток, участвующих с москитной отталкивающей. В сочетании с выходным последовательности экспрессируются гены в этих тканях, мы можем выявить гены, скорее всего, посреднические ответов этих клеток, направленных на выявление новых соединений для улучшения возможностей для отпугивания.

Секвенирование РНК является мощным инструментом, быстро становится стандартом для отслеживания временных и пространственных изменений экспрессии генов. Секвенирование РНК анализы насекомых хемосенсорных придатков и органов были использованы для выявления молекулярные рецепторы в нескольких видов насекомых ^3-5, значительно улучшая на обычной ПЦР на основе поисков гена геном ^6. Насекомые представляют собой наиболее разнообразную класс животных, предварительноляющих много возможностей изучать связь между генами и уникальных фенотипов. Секвенирование РНК технология может быть использована на любой живой насекомых ткани. Кроме того, электрофизиологические записи от сенсорных клеток в вкусовой uniporous сенсилл может быть достигнуто во многих различных видов насекомых. Спаривание этих двух методов позволяет исследователям сузить набор генов, участвующих в наблюдаемой хемосенсорной фенотипа. Различные виды представит конкретные проблемы, но может сообщить связь между хемосенсорных рецепторных генов и адаптации хемосенсорной. Размер и морфология хемосенсорной сенсилл является переменной и может потребовать ремонта ошибок при записи потенциалов действия, чтобы снизить уровень шума и определить повторяющиеся сигналы. Вскрытия хемосенсорного органов может быть тривиальным или деликатный и требует много времени, в зависимости от морфологии и размера насекомого. Восстановление из высококачественной РНК может потребовать их устранению, а также, например, избегая определенных пигментов воКоллекция тканей.

В то время как демонстрации влияния отталкивающих соединений через поведенческих испытаний является прямым и информативным, этот подход затрат времени и широкое по отношению к механизму действия. Электрофизиологии в сочетании с Секвенирование РНК позволяет более конкретных анализов, что движет уклонения от поведения насекомых. После того, как "инструментарий" химической дискриминации были выявлены в видов насекомых, более конкретные попытки улучшить известные репелленты возможно. Рецепторы и связанные с ними белков в чувствительных клетках, ответственных за эти поведения могут быть выражены гетерологично для непосредственного химического скрининга. Кроме того, молекулярное моделирование может предсказать, какие химические вещества будут вызывать сильные реакции от этих рецепторов ^7.

Снимок всех активных генов в узком наборе хемосенсорных тканей также могут быть полезны в идентификации подобных генов у других видов. Использование гомологию последовательности и выражения сиmilarities, исследователи могут сформировать наборы молекулярных рецепторов, скорее всего, посреднических ответов на репеллентов, которые в целом эффективным против насекомых. Мы приведем следующий протокол, чтобы помочь исследователям в деконструкции насекомых хемосенсорных пути и убедить более углубиться в Нейроэтология не-модели и экономически важных насекомых.

протокол

1. Разведение Ae. Aegypti взрослых

1. Высиживают яйца в приблизительно ¾ дюйма воды в мелководных лоток. Перенаселение приведет к сокращению размера взрослых.
2. Задняя личинки при 25 ° C (12-HL: 12-HD), а накормить землю корма для рыб.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перекармливание может снизить уровень выживаемости.
3. Удалить куколки индивидуально пипетки Пастера в день и передать пластиковой посуды (9 см х 5,5 см) внутри небольших ведрах по сдерживанию с мелкими крышками сетки, создав таким образом 24 ч возрастным группам.
4. Кормовые взрослых комаров 10% раствор сахарозы с ватным тампоном размещенных как на экране стенах корпуса сепаратора комары в климатическую камеру при 27 ° С и 70% относительной влажности, при одной и той же фотопериода как личинок.
5. Для электрофизиологии, используйте 5-10 день старых животных. В общем, крупные животные будут лучшие результаты. Для выделения РНК, используют животных, которые находятся в одном 24 ч возрастной группировки в 5-10-дневного возраста диапазона.

2. Подготовка химических веществ

1. Определить подходящую концентрацию электролита (например, 1-10 мм), которое вызывает минимальную активность в отдельных сенсорных нейронов. 10 мМ NaCl или 1mm KCl разумные электролиты контрольного испытания активности, когда начинают эксперимент.
2. Растворите каждой экспериментальной химического вещества в подходящем растворителе (если не вода, употреблять этанол или ДМСО), который имеет мало или вообще не влияет на импульсной активности по сравнению с электролит в одиночку. Конечные концентрации 10% этанола или 1% ДМСО разумные исходные концентрации.
3. Выберите соответствующий (например, хинин горьким или сахарозы в течение Sweet) химических средств, которые хорошо описанных кормления сдерживающие факторы или стимуляторы насекомых.

3. электрофизиологии (совет записи ^8, рисунок 1)

1. Форма стеклянные электроды механически вытягивать стеклянные капилляры. Оптимизация тепло и тянуть настройки, чтобы вытащить стекло, чтобы сформировать соответствующую форму recordiнг электроды. Осторожно разорвать конец стеклянного электрода с помощью щипцов при вскрытии микроскопом, чтобы создать кончик электрода отверстие, которое является достаточно широким, чтобы конверт целевой сенсиллу, но достаточно малы, чтобы избежать контакта с соседними структурами.
2. Под микроскопом, визуально определить по морфологии и положение цели сенсилл / сенсиллу, чтобы обеспечить повторяемость записи наконечника. Подготовительные животные для обеспечения свободного доступа к сенсилл от угла влета электрода.
3. Холодные анестезии взрослых насекомых в морозильной камере при -20 ° С. Избегайте повреждения периферических нейронах Нахождение в холодных температурах. Вырезать узкие полоски скотча с лезвием бритвы на стекле. Остановите все насекомое на стекле с использованием узких полос.
4. Вставка химически заостренный вольфрамовой проволоки в спинной грудной клетки или глаза в качестве индифферентного (земля) электрода.
5. Заполните стеклянный электрод, выполненный в шаге 3,1 с стимулирующие решения интересов. Использование вставлен шприц, крышку заливной горловиныIllary от вытащил конца, чтобы тупой конец. Флик все пузырьки воздуха, держа вытащил конец вниз. Вставьте серебряную проволоку (хлорирующим дополнительный) в стеклянный электрод сделали в шаге 3.1 в качестве записи и стимулирующего электрода.
6. Подключите электроды к предусилителя, который предназначен для записи от контакта chemoreceptive сенсилл в насекомых. Это предусилитель (300 Гц-3 кГц полосовой фильтр) позволит сократить время установления для захвата активность нейронов как можно ближе к стимул введение насколько это возможно. Сбор, хранение и анализ электрических сигналов с использованием микрокомпьютера, оснащенный программным обеспечением для записи шип.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Заземление установки записи должным образом, может существенно улучшить отношение сигнал-шум.
7. Стимулировать сенсиллы с контрольным раствором (только электролита), чтобы обеспечить функциональность. Граф шипы, начиная 200 мс следующие стимула артефакт для всех препаратов.
8. Случайный порядок испытаний химических веществ для всех экспериментов, за исключением исследований доза-реакция,устранить перекос. Для исследований доза-ответ, чтобы подвергнуть сенсиллы возрастающих концентраций химических экспериментальной. Разрешить минимум 3 минуты между раздражениями, чтобы обеспечить адекватное восстановление.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это требование может варьироваться в зависимости от насекомых и сенсилл. Порог определяется как концентрации, для которых стандартная ошибка не перекрывается с стандартной ошибки для самой низкой испытанной концентрации.

4. Выделение РНК и секвенирование (рис 2)

1. Подготовьте подогнанных РНКазы пестики охлаждением их на сухом льду до ткани disruption.Prepare сопровождающих РНКазы пестики, которые соответствуют оснастки крышки пробирки плотно. Держите сбора трубки закрыт, если активно рассечения, чтобы избежать образования конденсата.
2. Использование отфильтрованного аспиратор, место 30 до 40 холодного наркозом комаров (15 сек в -20 ° C морозильнике) на холодной сцене и сортировать по полу. Место животные спинной стороной вниз, захватывая крылья, чтобы не повредить вкусовые придатки.
3. Использование двух пар тонких щипцов, анализировать парных Labella или лапки из мужчин и женщин при вскрытии микроскопом и ограничить включение соседних тканей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 500 в паре Labella дает примерно 800-1000 нг тотальной мРНК. 400 индивидуальных лапки (5 сегментов, каждый) дают 1,200-1,800 нг тотальной мРНК.
4. С одной паре задыхаясь-щипцы, слегка понять комаров хоботок просто проксимальнее LaBella подвергая внутренние стилеты. Использование другую пару коллекторно-щипцы, удалить Labella и добавить ткань в сторону холодной пробирку.
5. С одной парой щипцов, слегка понять комаров ногу на стыке большой берцовой кости и первого членика лапки. Использование другую пару щипцов, удалить лапки и добавить ткань в сторону холодной пробирку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Примите во внимание типы клеток на границе желательные и нежелательные ткани. Хотя важно, чтобы ограничить включение соседних тканей, в равной степени важно, чтобы не пропустить части требуемой ткани. Фантастическиенал образец должен точно представлять всю орган интересов. Создать точную границу с щипцы, так что коллекция щипцы могут точно освобождению соскоблить или захват только нужную ткань.
6. Периодически, спин вниз коллекцию пробирки на 0 ° C центрифуге при 9000 мкг в держать ткань в нижней части трубы. Если влага накапливается в коллекции трубок во время вскрытия, добавить 50 мкл холодного Trizol реагента, чтобы покрыть накопившийся ткани.
7. Использование анти-смазыванию лаборатории маркера, четко обозначить один РНКазы 1,5 мл оснастки колпачок трубки для каждого типа ткани для коллекции. Использование 1,5 мл стойку трубки и жидкий азот, замораживание затем измельчить ткань в мелкий порошок (мелкие куски, если в TRIZOL). Повторить один раз. Довести общий объем триазол до 1 мл и ресуспендируют в грунтовые ткани на вортексе.
8. Добавить 200 мкл хлороформа и тщательно перемешать. После 5 мин при комнатной температуре, спин вниз в центрифуге при 4 ° С и 11000 мкг в течение 15 мин. Внимательнодобавить водный слой непосредственно к геномной ДНК колонке фильтра. Спин вниз на 11000 х г в течение 5 мин. Добавить равный объем РНКазы 70% этанола, проточные и перемешать с помощью пипетки. Трансфер жидкости в колонну сбора РНК и продолжают экстракции РНК согласно инструкциям.
9. Количественная и оценки чистоты общей РНК на точность спектрофотометра и заполните любым стандартным способом РНК последовательности.

5. Количественный RT-PCR Проверка РНК Секвенирование (Рисунок 3)

1. Выбор, как много генов, как можно сравнивать относительные уровни экспрессии генов в динамическом диапазоне, как в предсказанной последовательности и обилие предполагаемой функции хемосенсорных гена.
2. Дизайн пары праймеров для каждого гена-мишени для амплификации конкретной 100-180 пар оснований ПЦР-продукта. Исключить неспецифической амплификации GDNA путем обеспечения, по меньшей мере один праймер за множества охватывает интрона границу. Кроме того, использование лечение ДНКазы, чтобы уменьшить геномной загрязнения.
3. Собиратьткани насекомых, как описано в предыдущем разделе. Посчитайте, сколько ткани необходимо для обеспечения достаточного РНК завершить все реакции Qrt-ПЦР.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Биологическая трех экземплярах и реакции технические тройные обеспечит максимальную уверенность в результатах.
4. Рассчитать относительную гена количественное определение X _цели ^{- (Ct [цель] -ct [ссылка])} для каждого гена-мишени и в среднем для каждого повторить, как биологических, так и технических. Используйте ген (ы) Уборка нормализовать значения Ct между биологических повторяет и укоренить масштаб Y-ось в сравнении относительном выражении.
5. Оценка сходство Секвенирование РНК и Qrt-ПЦР наборов данных с использованием регрессии, на основе начальной загрузки процедуру эквивалентности ^9, итерационно применяться, чтобы данные из каждой ткани.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура определяет наименьший «Регион сходства", которые могут быть построены вокруг наблюдаемого Секвенирование РНК и Qrt-PCR данных и позволяют выражение относительной гена, измеряется qRT-ПЦР следует рассматривать статистически эквивалентно измерению экспрессии гена относительной РНК-SEQ.

Результаты

В след записи потенциалов действия из Ae. Aegypti вкусовые сенсиллы (Рисунок 1) продемонстрировать эффективность прямой стимуляции с диапазоном химических веществ. Этот метод может быть использован для количественной оценки ответов на любой стимулирующий химических путем п?...

Обсуждение

Наиболее сложным аспектом потенциалов действия записи из вкусовой сенсилл решает, какие ответы "нормально". При использовании одного наконечника вкусовые сенсиллу записи в первый раз для данного вида насекомых, общее количество и чувствительности вкусовых нейронов рецепторов (G...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass capillary	A-M Systems	628000	Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4"
Silver wire	A-M Systems	7875	.015" bare
Tungsten wire	Alfa Products	369	0.127 mm diameter
Fine forceps	Fine Science Tools	11252	#5SF Inox
Refridgerated stage	BioQuip Products	1429	Chill Table
Preamplifier	Syntech	Taste Probe	preamplifier
Software for electrophysiology	Syntech	Autospike	software for electrophysiology
TetraMin fish food	Tetra	Tropical fish food granules	fish food ground to fine powder
TRIzol	Life Technologies	15596-026	RNA isolation reagent
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74136	includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns
Nanodrop spectrophotometer	Nano Drop Products	ND-1000	tabletop spectrometer
R statistics	freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka)	www.r-project.org	Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment.
1.5 ml tube rack	Evergreen	240-6388-030	Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue.
1.5 ml collection tubes with pestle	Grainger	6HAX6	RNase free
Centrifuge	Thermo Scientific	11178160	Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube.
Primer-BLAST Primer Designing tool	NCBI	n/a