Fizyolojik Kayıtlar ve Sarı-ateş Sivrisinek Tat Çıkıntılara RNA Sıralama<em&gt; Aedes aegypti</em

Özet

Elektrofizyolojik inceleme ile belirlendiği zaman Aedes aegypti büyük tat uzantıları gen ekspresyonunu değerlendirmek için iki yöntem kullanılarak,, varsayım olarak, acı ve itici bileşikler, nöronal yanıtları altında yatan genlerin dizi belirledik.

Özet

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

Giriş

DEET, Picaridin, sitronellal ve IR3535 gibi bileşikler etkili bir ^1,2 aegypti önemli hastalık vektörü Aedes dahil sivrisinek, püskürtmek için gösterilmiştir. Biz sivrisinek iticilik ile ilgili hücreleri belirlemek için özel tat Sensilla ile ilişkili duyusal nöronlar aksiyon potansiyelleri kayıt. Bu dokularda eksprese edilen genlerin alt baş dizilemesi ile birleştiğinde, geliştirilmiş iticilik özellikleri için yeni bileşiklerin taranması için büyük olasılıkla bu hücrelerin yanıtlara aracılık genleri tespit edebilir.

RNA-seq hızla gen ifadesinde zamansal ve mekansal değişiklikleri izleme için standart haline güçlü bir araçtır. RNA seq böcek duyusal kulakçıkların analizleri ve organların büyük gen ⁶ geleneksel PCR bazlı arama gen iyileştirilmesi, çeşitli insekt türlerinin ^3-5 moleküler reseptörlerine ortaya çıkarmak için kullanılmaktadır. Böcekler en çeşitli hayvan sınıfını temsil, önbirçok fırsat reyi genler ve benzersiz fenotipleri arasındaki bağlantıyı incelemek için. RNA seq teknoloji herhangi bir yaşayan böcek doku üzerinde kullanılabilecektir. Benzer şekilde, uniporous tat Sensilla duyu hücrelerinden elektrofizyolojik kayıt birçok farklı böcek türleri elde edilebilmektedir. Bu iki teknik eşleştirme araştırmacılar gözlenen kimyasal duyu fenotip dahil set genleri daraltmak için izin verir. Farklı türler belirli zorlukları sunacak, ancak kimyasal duyu reseptör genleri ve bir kimyasal duyu adaptasyon arasındaki bağlantıyı bilgilendirebilir. büyüklüğü ve kimyasal duyu Sensilla morfolojisi değişkendir ve gürültüyü azaltmak ve tekrarlanabilir sinyalleri tespit aksiyon potansiyelleri kaydederken kapsamlı sorun giderme gerekebilir. Kimyasal duyu organlarının diseksiyonu önemsiz ya da hassas ve zaman böcek morfolojisi ve büyüklüğüne bağlı olarak, alıcı olabilir. Yüksek kaliteli RNA Kurtarma böyle sırasında belirli pigmentleri kaçınarak, yanı sıra bazı sorun giderme gerekebilirDoku Kolleksivonu.

Davranış denemelerle itici bileşiklerin etkisini gösteren doğrudan ve bilgilendirici olmakla birlikte, bu yaklaşım, zaman etki mekanizması ile ilgili olarak, yoğun ve geniştir. RNA-seq ile birleştiğinde Elektrofizyoloji böcekler kaçınma davranışları neyin daha spesifik analizler için izin verir. Kimyasal ayrımcılık "araç", bir böcek türlerinde tanımlanmıştır sonra, daha özel girişimler bilinmektedir kovucular mümkündür geliştirmek için. Bu davranışlarından sorumlu duyu hücrelerinde reseptörleri ve ilgili proteinler doğrudan kimyasal tarama için heterolog bir şekilde eksprese edilebilir. Ayrıca, moleküler modelleme kimyasallar bu reseptörlerin ⁷ güçlü tepkiler hangi tahmin edebilirsiniz.

duyusal dokuların dar kümesindeki tüm aktif genlerin fotoğraf da diğer türlerdeki benzer genlerin tanımlanması yararlı olabilir. Dizi homolojisi ve sentezleme si kullanılarakmilarities, araştırmacılar büyük olasılıkla böcekler üzerinde geniş etkili kovucular yanıtlar aracılık moleküler reseptör setleri oluşturabilir. Biz böcek kimyasal duyu yolları yapısökümünden araştırmacılar yardımcı olmak ve sigara modeli ve ekonomik açıdan önemli böceklerin Nöroetoloji dalmak için fazla ikna için aşağıdaki protokol mevcut.

Protokol

1. Yetiştirme Ae. aegypti yetişkin

1. Sığ tepside yaklaşık ¾ inç suda Hatch yumurta. Aşırı kalabalık yetişkinler boyutunu azaltacaktır.
2. Arka larva 25 ° C (12-HL: 12-HD) de ve zemin balık gıda ile beslemek.
   NOT: Fazla besleme sağkalım oranlarını azaltmak olabilir.
3. Günlük Pasteur pipeti tek tek pupa çıkarın ve böylece 24 saat yaş gruplaşmalar kurulması, ince örgü kapaklı plastik tabaklar küçük çevreleme kovalar içinde (5.5 cm x 9 cm) aktarın.
4. Bir kafes yuvanın elek çeperlerine yerleştirilen pamuk besleme yetişkin sivrisinekler,% 10 sukroz çözeltisi larvaları ile aynı bir fotoperyod ile 27 ° C'de ve% 70 nispi nemde bir çevre odasında sivrisinekler.
5. Elektrofizyoloji için, 5-10 gün eski hayvanları kullanın. Genel olarak, büyük hayvanların daha iyi sonuçlar üretecektir. RNA izolasyonu için, 5-10 gün eski aralığında bir tek 24 saat yaş gruplama içinde olan hayvanları kullanın.

2. Kimya hazırlanması

1. Seçilen duyusal nöronlar minimal aktivite ortaya çıkaran elektrolit (örneğin, 1-10 mM), uygun bir konsantrasyonunun belirlenmesi. 10 mM NaCl veya 1mm KCl bir deney başlarken temel aktiviteyi test etmek için makul elektrolitler bulunmaktadır.
2. Tek başına elektrolit ile karşılaştırıldığında büyük çivi aktivitesi üzerinde hiç veya çok az etkiye sahip olan her deney uygun bir çözücü içinde kimyasal (eğer su kullanılması etanol ya da DMSO) içinde çözülür. % 10 etanol ya da% 1 DMSO nihai konsantrasyonu uygun başlangıç ​​konsantrasyonlardır.
3. Böcekler besleme caydırıcı veya uyarıcı iyi tarif edilmiştir kontrol kimyasalları (tatlı için acı veya sukroz gibi kinin) uygun seçin.

3. Elektrofizyoloji ⁽⁸ ipucu kayıt; 1 Şekil)

1. Mekanik cam kılcal çekerek Formu cam elektrotlar. Isı Optimize ve uygun şekilli recordi oluşturmak için cam çekmek için ayarları çekinng elektrotlar. Dikkatle hedef Sensillum zarf yeterince geniş, ama komşu yapılarla temas önlemek için yeterince küçük açılış elektrot ucu oluşturmak için bir mikroskop altında forseps kullanılarak cam elektrot ucu kesiyorum.
2. Bir mikroskop altında, görsel morfoloji ile tespit ve ucu kayıt tekrarlanabilirlik sağlamak için hedef Sensilla / Sensillum yerleştirin. Hazırlık hayvanlar elektrot giriş açıdan Sensilla ücretsiz erişim sağlamak için.
3. -20 ° C'de derin dondurucuda soğuk anestezisi yetişkin böcekler. Soğuğa aşırı maruz periferik nöronlarda zarar kaçının. Cam slayt jilet ile selofan bantı dar şeritler halinde kesilir. Dar şeritler kullanılarak cam slayt tüm böcek hareketsiz.
4. Kayıtsız (toprak) elektrot olarak hizmet dorsal toraks veya göz içine bir kimyasal bilenmiş tungsten tel yerleştirin.
5. Ilgi uyarıcı çözeltisi ile adım 3.1 yapılan cam elektrot doldurun. Eklenen bir şırınga kullanarak, kapağı doldurmakçekti ucundan Illary ucunu künt. Aşağı çekti ucunu tutarak, tüm hava kabarcıklarını dışarı itin. Kayıt ve uyarıcı elektrot olarak hizmet adım 3.1 yapılan cam elektrot içine bir gümüş tel (chloriding isteğe bağlı) takın.
6. Böceklerde temas chemoreceptive Sensilla gelen kayıtları için tasarlanmış bir ön amplifikatöre elektrotları bağlayın. Bu Preamplifikatör (300 Hz-3 kHz bant geçiren filtre) mümkün olduğunca giriş uyarıcı kadar yakın nöronal aktiviteyi yakalamak için yerleşme süresini azaltacaktır. Toplamak mağaza ve başak kayıt yazılımı ile donatılmış bir mikrobilgisayar kullanarak elektrik sinyallerini analiz.
   NOT: ölçüde sinyal-gürültü oranını artırabilir düzgün kayıt kurulumu Topraklama.
7. Işlevselliği sağlamak için bir kontrol çözümü (elektrolit yalnızca) ile Sensilla teşvik. Tüm hazırlıklar için uyaran artifact aşağıdaki 200 msn başlayan ani sayın.
8. Doz-cevap çalışmaları hariç, bütün deneyler için Test kimyasal sırasını Rastgele,önyargı ortadan kaldırmak için. Doz-cevap çalışmaları için, deney kimyasal artan konsantrasyonlarına Sensilla maruz kalmaktadır. Yeterli iyileşme sağlamak için uyarılara arasında 3 dk en az bekleyin.
   NOT: Bu gereklilik, böcek ve Sensilla bağlı olarak değişebilir. Eşik standart sapması test edilen en düşük konsantrasyonda standart hata ile örtüşmeyen olan konsantrasyon olarak tanımlanır.

4. RNA izolasyonu ve Sıralama (Şekil 2)

1. Sıkıca geçmeli kapak tüpleri uygun doku disruption.Prepare eşlik RNaz ücretsiz havan elleri önce kuru buz üzerinde onları soğutma sıkıca uydurma RNAse ücretsiz pestles hazırlayın. Aktif aşırı yoğunlaşmayı önlemek için diseksiyon sürece kapalı toplama tüpleri tutun.
2. Süzülmüş aspiratör kullanarak, 30 ila 40 soğuk anestezi sivrisinek (° C derin dondurucuda -20 15 sn), soğuk sahnede ve sıralama cinsiyete göre yerleştirin. Yer hayvanlar tat uzantıları zarar değil kanatlarını kavrama, aşağı tarafı dorsal.
3. Ince forseps iki çift kullanarak, bir mikroskop altında erkek veya kadınlardan eşleştirilmiş Labella veya tarsi incelemek ve komşu dokuların dahil sınırlamak.
   Not: 500 eşleştirilmiş labella mRNA'nın yaklaşık 800-1.000 nanogram elde edilir. 400 ayrı tarsi (5 segmentlerinin her biri) toplam mRNA 1,200-1,800 nanogram verir.
4. Nefes nefese-forseps bir çift, hafifçe iç stileleri açığa Labella'ya sadece proksimal sivrisinek burnumun kavramak. Toplama-forseps diğer çifti kullanarak, Labella kaldırmak ve soğuk toplama tüp tarafına doku ekleyin.
5. Forseps bir çift ile hafifçe tibia ve ilk tarsal segment kavşakta sivrisinek bacak kavramak. Forseps diğer çifti kullanarak, tarsi çıkarın ve soğuk toplama tüpünün yan doku ekleyin.
   NOT: istedim ve istenmeyen doku arayüzünde dikkate hücre tipleri alın. Bu doku komşu dahil sınırlamak için önemli olmakla birlikte, istenen doku bölümlerini ihmal değil aynı derecede önemlidir. final numune doğru çıkar tüm organı temsil etmelidir. Toplama forseps tam kazıma veya sadece istenilen doku kapma kurtarmak öyle ki doyumsuz forseps ile kesin bir sınır oluşturun.
6. Periyodik olarak, tüpün alt kısmında doku tutmak için 9.000 xg'de kısaca 0 ° C santrifüj toplama tüpü aşağı doğru döndürün. Nem diseksiyonu sırasında toplama tüpleri birikir ise, toplanan doku kapsayacak şekilde soğuk Trizol reaktif 50ul ekleyin.
7. Anti-leke laboratuvar işaretleyici kullanarak, açıkça bir RNaz ücretsiz 1.5 ml toplama her doku türü için kapak tüp ek etiket. (Trizol eğer ince parçalara) 1.5 ml tüp raf ve sıvı azot kullanarak, sonra ince toz haline doku öğütmek donma. Kez tekrarlayın. 1 ml Trizol toplam hacmi getirin ve vorteks zemin dokusu tekrar süspansiyon.
8. Kloroform, 200 ul ilave edin ve iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika sonra, 4 ° C'de ve 15 dakika boyunca 11,000 x g'de santrifüj aşağı doğru döndürün. Dikkatlicegenomik DNA, filtre kolonuna sulu katman ekleyin. 5 dakika boyunca 11.000 x g'de aşağı doğru döndürün. Içeri akış ve kamış ile karıştırmak için RNaz içermeyen,% 70 etanol, eşit hacim. Bir RNA toplama kolonuna sıvı aktarın ve verilen talimatlara göre RNA ekstraksiyon devam ediyor.
9. Ölçmek ve hassas spektrofotometre toplam RNA saflığını değerlendirmek ve herhangi bir standart RNA sıralama yöntemi ile devam edin.

5. Kantitatif RT-PCR RNA Dizilimine Doğrulama (Şekil 3)

1. Tahmin edilen sekans bolluğu ve varsayılan duyusal gen fonksiyonu hem de bir dinamik alan üzerinde göreceli gen ekspresyonu seviyesini karşılaştırmak için mümkün olduğu kadar çok gen seçin.
2. Her bir hedef genin için tasarım primer çiftleri belirli 100-180 baz çiftlik PCR ürünü amplifiye etmek için. Set başına en az bir astar sağlayarak non-spesifik gDNA amplifikasyon dışla bir intron sınır kapsamaktadır. Seçenek olarak ise, genom kirlenmeyi azaltmak için DNaz tedavisi kullanımı.
3. ToplamakÖnceki bölümde tarif edildiği gibi böcek doku. Tüm Mah-PCR reaksiyonları tamamlamak için yeterli RNA sağlamak için gereken ne kadar doku hesaplayın.
   NOT: Biyolojik üçlü ve teknik üçlü reaksiyonları sonuçlarında maksimum güven sağlayacaktır.
4. , Biyolojik ve teknik hem de her biri için her hedef gen ve ortalama ^{(Ct [hedef] -CT [Referans])} çoğaltmak ^- X _hedef olarak göreceli gen kantifikasyonunu hesaplayın. Biyolojik çoğaltır arasında Ct değerleri normalleştirmek için temizlik gen (ler) kullanın ve bağıl ifade karşılaştırmalarda Y ekseni ölçeği kök.
5. RNA seq ve regresyon tabanlı önyükleme denklik prosedürü ⁹ tekrarlı her dokudan elde edilen verilere uygulanan kullanılarak QRT-PCR veri setleri benzerliğini değerlendirin.
   NOT: Bu prosedür gözlenen RNA-seq ve Mah-PCR verilerine etrafında inşa edilebilir en küçük "benzerlik bölgesini" tanımlar ve qRT- ile ölçülen bağıl gen ifadesini izinPCR, RNA-seq göreceli gen ifadesinin ölçümü istatistiksel eşdeğer kabul edilecek.

Sonuçlar

Ae aksiyon potansiyellerinin iz kayıtları. aegypti tat Sensilla (Şekil 1) kimyasal bir dizi doğrudan uyarılması etkinliğini göstermektedir. Bu teknik, makul bir zaman aralığında (genellikle az 500 ms) içinde belirli bir genlik ve süreye sahip sivri sayarak bir uyarıcı kimyasal tepkiler ölçmek için kullanılabilir. İz kayıtları deneysel koşullar, belirli bir dizi şartlar altında kolaylıkla tekrar üretilebilir olmalıdır. Aksi takdirde, gözlenen fizyolojik yan...

Tartışmalar

tat Sensilla gelen kayıt aksiyon potansiyelleri en zorlu yönü hangi yanıtları karar olduğunu "normal." verilen bir böcek türlerinin toplam sayısı ve tat reseptör nöronların hassasiyetleri (GRNs) için ilk defa kayıt tek tat Sensillum ucu istihdam zaman vardır muhtemelen bilinmeyen. Birçok ön kayıtları ilk aralığı ve test etmek için kimyasal konsantrasyonlarını karar gereklidir. Bu durumda, bir tek GRN'de DEET'in (Şekil 1) düşük konsantrasyonlarda yanıt gö...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass capillary	A-M Systems	628000	Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4"
Silver wire	A-M Systems	7875	.015" bare
Tungsten wire	Alfa Products	369	0.127 mm diameter
Fine forceps	Fine Science Tools	11252	#5SF Inox
Refridgerated stage	BioQuip Products	1429	Chill Table
Preamplifier	Syntech	Taste Probe	preamplifier
Software for electrophysiology	Syntech	Autospike	software for electrophysiology
TetraMin fish food	Tetra	Tropical fish food granules	fish food ground to fine powder
TRIzol	Life Technologies	15596-026	RNA isolation reagent
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74136	includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns
Nanodrop spectrophotometer	Nano Drop Products	ND-1000	tabletop spectrometer
R statistics	freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka)	www.r-project.org	Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment.
1.5 ml tube rack	Evergreen	240-6388-030	Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue.
1.5 ml collection tubes with pestle	Grainger	6HAX6	RNase free
Centrifuge	Thermo Scientific	11178160	Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube.
Primer-BLAST Primer Designing tool	NCBI	n/a