Physiologiques Recordings et ARN séquençage des annexes gustatives du Mosquito fièvre jaune<em&gt; Aedes aegypti</em

Résumé

L'utilisation de deux méthodes pour estimer l'expression des gènes dans les grands appendices gustatives de Aedes aegypti, nous avons identifié l'ensemble des gènes sous-jacents supposément les réponses neuronales à des composés amers et de répulsion, comme déterminé par l'examen électrophysiologique.

Résumé

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

Introduction

Il a été démontré composés comme DEET, Picaridin, Citronellal et IR3535 pour repousser efficacement les moustiques, y compris les vecteurs de maladies importantes Aedes aegypti ^1,2. Nous enregistrons des potentiels d'action des neurones sensoriels associés à gustative sensilles spécifique pour déterminer les cellules impliquées avec moustiquaire répulsion. Couplé avec le séquençage aval des gènes exprimés dans ces tissus, nous pouvons identifier les gènes les plus susceptibles médiation des réponses de ces cellules afin de dépister de nouveaux composés pour l'amélioration des capacités de répulsion.

ARN-Seq est un outil puissant, devient rapidement la norme pour le suivi des changements temporels et spatiaux de l'expression génique. Analyse de l'ARN-seq appendices chimiosensoriels insectes et les organes ont été utilisées pour découvrir des récepteurs moléculaires dans plusieurs espèces d'insectes ^5.3, ce qui améliore grandement le gène par PCR conventionnelle basée recherches par le gène ^6. Les insectes représentent la classe des animaux les plus divers, présentant de nombreuses occasions d'étudier le lien entre les gènes et les phénotypes uniques. la technologie de l'ARN-seq peut être utilisé sur ne importe quel tissu insecte vivant. De même, l'enregistrement électrophysiologique à l'intérieur de cellules sensorielles sensilla uniporous gustative peut être réalisée dans de nombreuses espèces d'insectes. Le couplage de ces deux techniques permet aux chercheurs de réduire l'ensemble des gènes impliqués dans le phénotype observé chimiosensorielle. Différentes espèces présenter des défis spécifiques, mais peuvent informer la connexion entre les gènes des récepteurs chimiosensoriels et une adaptation chimiosensorielle. La taille et la morphologie des chimiosensorielle sensilles est variable et peut exiger énormément de dépannage lors de l'enregistrement des potentiels d'action pour réduire le bruit et d'identifier les signaux reproductibles. Les dissections des organes chimiosensoriels peuvent être trivial ou délicate et longue, en fonction de la morphologie et la taille de l'insecte. Récupération de l'ARN de haute qualité peut exiger un peu de dépannage ainsi, comme éviter certains pigments courscollecte de tissu.

Tout en montrant les effets de composés répulsifs par des essais de comportement est directe et informative, cette approche exige beaucoup de temps et de large par rapport au mécanisme d'action. Électrophysiologie couplé avec l'ARN-seq permet des analyses plus spécifiques de ce qui motive les comportements d'évitement chez les insectes. Une fois que la "boîte à outils" de la discrimination chimique a été identifiée dans une espèce d'insecte, des tentatives plus spécifiques visant à améliorer le répulsifs connus sont possibles. Récepteurs et des protéines associées dans les cellules sensorielles responsables de ces comportements peuvent être exprimées de manière hétérologue pour le dépistage chimique directe. En outre, la modélisation moléculaire peut prédire quels produits chimiques seront obtenir de fortes réponses de ces récepteurs ^7.

L'instantané de tous les gènes actifs dans un ensemble restreint de tissus chimiosensoriels peut également être utile dans l'identification des gènes similaires dans d'autres espèces. Utilisation homologie de séquence et d'expression similarities, les chercheurs peuvent former des ensembles de récepteurs moléculaires les plus susceptibles de médiation réponses aux répulsifs qui sont largement efficaces sur les insectes. Nous présentons le protocole suivant pour aider les chercheurs à déconstruire voies chimiosensoriels insectes et de convaincre plus de se plonger dans l'neuroéthologie de non-modèle et les insectes économiquement importants.

Protocole

1. Elevage Ae. aegypti adultes

1. Les œufs éclosent en environ ¾ pouce d'eau dans le bac peu profond. La surpopulation va réduire la taille des adultes.
2. Larves arrière à 25 ° C (12 hl: 12-HD) et nourrir avec de la nourriture du poisson de fond.
   NOTE: La suralimentation peut réduire les taux de survie.
3. Retirer pupes individuellement par pipette Pasteur quotidienne et transfert à des plats en plastique (9 cm x 5,5 cm) à l'intérieur de petits seaux de confinement avec de fines couvercles de maille, établissant ainsi 24 groupes d'âge h.
4. moustiques adultes Feed solution à 10% de saccharose par le coton balle placée sur les murs d'écran d'un boîtier de la cage les moustiques dans une chambre de l'environnement à 27 ° C et 70% d'humidité relative dans les mêmes photopériode sous forme de larves.
5. Pour électrophysiologie, utiliser 5-10 jours vieux animaux. En général, les grands animaux produisent de meilleurs résultats. Pour l'isolement de l'ARN, utiliser des animaux qui se trouvent dans un seul 24 hr âge regroupement dans l'ancienne gamme de 5-10 jours.

2. Préparation des produits chimiques

1. Déterminer une concentration appropriée de l'électrolyte (par exemple 1-10 mM) qui provoque une activité minimale de neurones sensoriels sélectionnés. 10 mM de NaCl ou 1 mM KCl sont des électrolytes raisonnables pour tester l'activité de base lorsque l'on commence une expérience.
2. Dissoudre chaque produit chimique expérimentale dans un solvant approprié (si ce ne est l'eau, utiliser de l'éthanol ou le DMSO) qui a peu ou pas d'effet sur l'activité de pointe par rapport à l'électrolyte seul. Les concentrations finales de 10% d'éthanol ou 1% de DMSO sont les concentrations de départ raisonnables.
3. Sélectionnez approprié (par exemple la quinine en amertume ou le saccharose pour Sweet) de contrôle des produits chimiques qui sont bien décrits dissuasion d'alimentation ou de stimulants chez les insectes.

3. électrophysiologie (enregistrement de la pointe ^8; Figure 1)

1. électrodes de verre de forme en tirant mécaniquement capillaires en verre. Optimiser la chaleur et tirez réglages pour tirer verre pour former recordi forme appropriéeélectrodes Ng. Rompre avec précaution extrémité de l'électrode de verre en utilisant une pince sous un microscope de dissection pour créer pointe de l'électrode ouverture qui est assez large pour envelopper cible sensille, mais assez petit pour éviter tout contact avec les structures voisines.
2. Sous un microscope, identifier visuellement par la morphologie et la position de la cible sensilles / sensille pour assurer la répétabilité de l'enregistrement de la pointe. Prep animaux afin de permettre le libre accès aux sensilles partir de l'angle d'entrée de l'électrode.
3. Froids insectes Anesthetize adultes dans le congélateur à -20 ° C. Eviter les dommages aux neurones périphériques par une surexposition à des températures froides. Découper des bandes étroites de ruban adhésif avec une lame de rasoir sur lame de verre. Immobiliser insectes tout sur une lame de verre en utilisant des bandes étroites.
4. Insérez un fil de tungstène chimiquement affilée dans le thorax dorsal ou les yeux pour servir les indifférents (sol) électrode.
5. Remplissez électrode de verre faite à l'étape 3.1 avec une solution stimulant d'intérêt. Utilisation d'une seringue insérée, le bouchon de remplissageIllary de bout tiré Blunt fin. Flick toutes les bulles d'air, tenant fin tiré vers le bas. Insérez un fil d'argent (chlorurant en option) dans l'électrode de verre faite à l'étape 3.1 pour servir enregistrement et électrode de stimulation.
6. Connecter les électrodes à un préamplificateur qui est conçu pour des enregistrements de contacts chimioréceptifs sensilla chez les insectes. Ce préamplificateur (300 Hz-3 kHz filtre passe-bande) permettra de réduire le temps de stabilisation de l'activité neuronale capturer aussi près que possible l'introduction du stimulus. Collecter, stocker et analyser les signaux électriques en utilisant un micro-ordinateur équipé d'un logiciel d'enregistrement de pointe.
   REMARQUE: la terre la configuration d'enregistrement correctement peut considérablement améliorer le rapport signal-sur-bruit.
7. Stimuler sensilles avec une solution de contrôle (électrolyte seulement) pour assurer la fonctionnalité. Comptez pointes à partir de 200 msec suivants l'artefact de stimulation pour toutes les préparations.
8. Aléatoire l'ordre de produits chimiques d'essai pour toutes les expériences, à l'exception des études dose-réponse,pour éliminer les préjugés. Pour les études dose-réponse, exposer sensilles à des concentrations de la substance chimique expérimentale croissante. Laisser un minimum de 3 minutes entre les stimulations pour assurer une récupération adéquate.
   NOTE: Cette exigence peut varier en fonction des insectes et sensilles. Seuil est défini comme étant la concentration pour laquelle l'erreur standard ne chevauche pas l'erreur-type pour la plus faible concentration testée.

4. Isolement et séquençage de l'ARN (figure 2)

1. Préparer les pilons libre de RNAse-étanches en les refroidissant sur de la glace sèche avant tissus disruption.Prepare accompagnant pilons RNase-free qui correspondent à des tubes à bouchon de pression hermétiquement. Garder les tubes de collecte fermés à moins dissection activement pour éviter l'excès de condensation.
2. Utilisation de l'aspirateur filtrée, placez 30-40 moustiques froides anesthésiés (15 sec à -20 ° C congélateur) sur scène froide et trier par sexe. La place animaux dorsale vers le bas, saisir ailes pour ne pas endommager les appendices gustatives.
3. L'utilisation de deux paires de pinces fines, disséquer labella apparié ou tarses des mâles ou des femelles sous un microscope de dissection et de limiter l'inclusion des tissus adjacents.
   REMARQUE: 500 labella jumelé donne environ 800-1000 nanogrammes d'ARNm total. 400 tarses individuelle (5 segments chacun) donnent 1,200-1,800 nanogrammes d'ARNm total.
4. Avec une paire de halètement-pince, saisir la légère trompe moustiques juste en amont de labella exposer stylets internes. Utiliser autre paire de collecte-pince, retirer et ajouter labella tissu à côté du tube de collecte froid.
5. Avec une paire de pinces, saisir légèrement la jambe de moustiques à la jonction du tibia et du premier segment du tarse. Utilisation d'un autre paire de pinces, retirez tarses et ajouter tissu à côté du tube de collecte froid.
   NOTE: Prendre en compte les types de cellules à l'interface de tissu voulu et non désirées. Se il est important de limiter l'insertion du tissu voisin, il est tout aussi important de ne pas omettre des parties de tissu souhaitée. La fiéchantillon final doit représenter avec précision l'organe entier d'intérêt. Créer une limite précise avec la pince de préhension tels que le forceps de collecte peuvent précisément libérer en grattant ou en saisissant seulement le tissu désiré.
6. Périodiquement, spin down tube de collecte brièvement 0 ° C centrifuger à 9000 xg pour maintenir le tissu au fond du tube. Si l'humidité se accumule dans des tubes de collecte lors de la dissection, ajouter 50 pi de réactif Trizol froide pour couvrir des tissus prélevés.
7. En utilisant le marqueur de laboratoire anti-maculage, étiqueter clairement une RNase-free 1,5 ml enclenchent tube à bouchon pour chaque type de tissu pour la collecte. Utiliser 1,5 ml rack tube et de l'azote liquide, de geler puis poncer tissus en poudre fine (de belles pièces en cas de Trizol). Répéter une fois. Amener le volume total de 1 ml Trizol et remettre le tissu du sol au vortex.
8. Ajouter 200 ul de chloroforme et bien mélanger. Après 5 min à température ambiante, tourner dans la centrifugeuse à 4 ° C et 11 000 g pendant 15 min. Soigneusementajouter couche aqueuse directement sur une colonne de filtration de l'ADN génomique. Isoler à 11 000 x g pendant 5 min. Ajouter volume égal de RNase éthanol à 70% accréditives et mélanger à la pipette. Transfert de liquide à une colonne de collecte de l'ARN et poursuivre l'extraction de l'ARN selon les instructions fournies.
9. Quantifier et d'évaluer la pureté de l'ARN total sur un spectrophotomètre de précision et de procéder à toute méthode de séquençage de l'ARN standard.

5. RT-PCR quantitative de l'ARN de validation de séquençage (figure 3)

1. Sélectionnez autant de gènes que possible de comparer les niveaux d'expression des gènes relatifs sur une plage dynamique, à la fois l'abondance de la séquence prédite et la fonction du gène présumé chimiosensorielle.
2. Conception des paires d'amorces pour chaque gène cible à amplifier un produit spécifique de 100 à 180 paires de bases par PCR. Exclure gDNA amplification non spécifique en assurant au moins une amorce par ensemble se étend sur une limite intron. Vous pouvez également utiliser le traitement DNase pour réduire la contamination génomique.
3. Recueillirtissus insectes comme décrit dans la section précédente. Calculer la quantité de tissu nécessaire pour fournir suffisamment d'ARN pour compléter toutes les réactions qRT-PCR.
   NOTE: triple biologique et réactions en triple techniques fourniront un maximum de confiance dans les résultats.
4. Calculer quantification relative du gène _cible que X ^{- (Ct [cible] -Ct [référence])} pour chaque gène cible et moyenne pour chaque répétition, à la fois biologique et technique. Utilisez gène (s) de ménage pour normaliser les valeurs de Ct entre réplicats biologiques et d'enraciner l'échelle de l'axe Y dans les comparaisons d'expression relative.
5. Apprécier la similitude de l'ARN-seq et des ensembles de données qRT-PCR en utilisant les fonction de la régression, la procédure d'équivalence bootstrap ^9, appliqué de manière itérative, les données de chaque tissu.
   NOTE: Cette procédure identifie le plus petit «région de similitude" qui peut être construit autour de l'ARN-Seq données et qRT-PCR observée, et permettre l'expression relative de gènes tel que mesuré par qRT-PCR pour être considérée comme statistiquement équivalent à la mesure de l'expression relative des gènes par l'ARN-seq.

Résultats

Les enregistrements des traces de potentiels d'action Ae. aegypti sensilles gustatives (Figure 1) démontrer l'efficacité de la stimulation directe avec une gamme de produits chimiques. Cette technique peut être utilisée pour quantifier les réponses à tout produit chimique stimulant en comptant les pointes d'une amplitude et la durée donnée sur une plage de temps raisonnable (généralement moins de 500 ms). enregistrements de trace doivent être facilement reproductibles dan...

Discussion

L'aspect le plus difficile de potentiels d'action d'enregistrement de sensilles gustative est de décider lequel des réponses sont «normal». Lorsque l'on utilise seule pointe de sensille gustative l'enregistrement de la première fois pour une espèce d'insectes donnés, le nombre et la sensibilité des neurones récepteurs gustatifs totale (GRNS) sont probablement inconnu. De nombreux enregistrements préliminaires doivent d'abord décider de la gamme et les concentrations de produits chi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass capillary	A-M Systems	628000	Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4"
Silver wire	A-M Systems	7875	.015" bare
Tungsten wire	Alfa Products	369	0.127 mm diameter
Fine forceps	Fine Science Tools	11252	#5SF Inox
Refridgerated stage	BioQuip Products	1429	Chill Table
Preamplifier	Syntech	Taste Probe	preamplifier
Software for electrophysiology	Syntech	Autospike	software for electrophysiology
TetraMin fish food	Tetra	Tropical fish food granules	fish food ground to fine powder
TRIzol	Life Technologies	15596-026	RNA isolation reagent
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74136	includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns
Nanodrop spectrophotometer	Nano Drop Products	ND-1000	tabletop spectrometer
R statistics	freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka)	www.r-project.org	Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment.
1.5 ml tube rack	Evergreen	240-6388-030	Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue.
1.5 ml collection tubes with pestle	Grainger	6HAX6	RNase free
Centrifuge	Thermo Scientific	11178160	Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube.
Primer-BLAST Primer Designing tool	NCBI	n/a