생리 녹음 및 황열병 모기의 미각 부속 기관의 RNA 시퀀싱<em&gt; Aedes aegypti</em

요약

전기 생리 학적 시험에 의해 측정 Aedes aegypti의 주요 부속 미각 유전자 발현을 추정하기 위해 두 가지 방법을 사용하여, 우리는, 추정되는 쓴맛 반발 화합물 신경 반응을 기본 유전자 세트를 확인했다.

초록

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

서문

DEET, 피카, 시트로 넬랄 및 IR3535 등의 화합물을 효과적으로 ^1,2 aegypti 중요한 질병 벡터 Aedes을 포함하여 모기를 격퇴하는 것으로 나타났다. 우리는 모기 반발과 관련된 세포를 결정하기 위해 특정 미각 sensilla과 관련된 감각 뉴런에서 활동 전위를 기록한다. 이러한 조직에서 발현 유전자의 하류 서열과 결합, 우리는 개선 발수 기능에 대한 새로운 화합물을 스크리닝하기 위해 가장 가능성이 세포의 반응을 매개하는 유전자를 식별 할 수있다.

RNA-SEQ 신속 유전자 발현에 시간적, 공간적 변화를 추적하기위한 표준이되고, 강력한 도구입니다. RNA-서열은 곤충 화학 감각 부속 분석과 기관은 크게 유전자 ^(6)에 의해 기존의 PCR 기반 검색 유전자에 개선, 여러 종의 곤충 ^3-5 분자 수용체를 발견하는 데 사용되었다. 곤충은 가장 다양한 동물 클래스를 나타냅니다, 사전많은 기회를 공무 원은 유전자와 독특한 표현형 사이의 연결을 공부한다. RNA-서열 기술은 살아있는 곤충 조직에 이용 될 수있다. 마찬가지로, 미각 uniporous sensilla 감각 세포 내에서 전기 생리 학적 기록은 다양한 곤충 종으로 달성 될 수있다. 이 두 기술의 페어링은 연구자가 관찰 화학 감각 표현형에 포함 된 세트 유전자를 좁힐 수 있습니다. 다른 종은 특정 과제를 제시하지만, 화학 감각 수용체 유전자와 화학 감각 적응 사이의 연결을 알릴 수있다. 크기와 화학 감각 sensilla의 형태는 가변적이며 노이즈를 줄이고 반복 신호를 식별하는 활동 전위를 기록 할 때 광범위한 문제 해결이 필요할 수 있습니다. 화학 감각 기관의 해부는 사소한 또는 섬세하고 시간이 곤충의 형태와 크기에 따라 소비 할 수있다. 고품질 RNA의 이러한 복구 중에 특정의 안료를 피로서뿐만 아니라, 약간의 문제가 필요할 수조직 수집.

행동 시험을 통해 발수 화합물의 효과를 입증하는 직접적이고 유익한 반면,이 방법은 시간의 동작 메커니즘에 대해서 집중적 넓다. RNA-서열과 결합 전기 생리학은 곤충 회피 행동을 원동력의보다 구체적인 분석이 가능합니다. 화학 차별 "툴킷"곤충 종 식별되면,보다 구체적인 시도는 알려진 방충제이 가능에 향상시킬 수 있습니다. 이러한 행동에 대한 책임을 감각 세포의 수용체와 관련된 단백질은 직접 화학적 스크리닝을 위해 이종 표현 될 수있다. 또한, 분자 모델링 화학 물질이 수용체 ^7에서 강한 반응을 이끌어내는 것이다 예측할 수있다.

화학 감각 조직의 좁은 세트의 모든 활성 유전자의 스냅 샷은 다른 종에서 비슷한 유전자를 식별하는 데 유용 할 수있다. 서열 상 동성 및 표현시 사용milarities, 연구자들은 대부분 곤충에 광범위하게 효과가 기피제에 대한 응답을 매개 분자 수용체의 세트를 형성 할 수있다. 우리는 곤충 화학 감각 경로를 해체 연구자를 돕기 위해 비 모델과 경제적으로 중요한 곤충의 neuroethology으로 탐구하는 것이 더 설득하기 위해 다음과 같은 프로토콜을 제시한다.

프로토콜

1. 양육 애. aegypti 성인

1. 얕은 트레이에 약 ¾ 인치 물에 해치 계란. 과밀 수용은 성인의 크기를 줄일 수 있습니다.
2. 후면 유충 25 ° C (12 헥토 리터 : 12-HD)에 지상 물고기 음식으로 공급.
   주 : 과잉 사료가 생존율을 감소시킬 수있다.
3. 매일 파스퇴르 피펫에 의해 개별적으로 번데기를 제거하고, 따라서 24 시간 연령 그룹을 설립, 미세 메쉬 뚜껑 플라스틱 접시에 작은 봉쇄 버킷 내부 (5.5 cm × 9cm)를 전송합니다.
4. 케이지 하우징의 화면 벽에 배치면 공에 의해 피드 성인 모기의 10 % 자당 용액 애벌레와 같은 광주에서 27 ° C 및 70 % 상대 습도 환경 챔버의 모기.
5. 전기 생리학의 경우 5 ~ 10 일 이전 동물을 사용합니다. 일반적으로, 더 큰 동물 나은 결과를 산출 할 것이다. RNA 분리의 경우, 5-10 일 이전 범위의 단일 24 시간 연령 그룹 내에있는 동물을 사용합니다.

2. 화학 물질의 제조

1. 선택된 감각 뉴런에서 최소한의 활동을 이끌어 전해질 (예 : 1 ~ 10 mM의)의 적절한 농도를 결정합니다. 10 mM의 염화나트륨 또는를 1mM의 KCl 실험을 시작할 때 기본 활동을 테스트하기 위해 합리적인 전해질 수 있습니다.
2. 혼자 전해질에 비해 스파이크 활동에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 각 실험 적당한 용매 화학 (그렇지 않으면 물 사용 에탄올 또는 DMSO)에 용해. 10 % 에탄올, 1 % DMSO의 최종 농도는 적당한 출발 농도이다.
3. 곤충의 먹이 방어벽이나 자극을 잘 설명되어 제어 화학 물질 (달콤한에 대한 쓴 또는 자당에 대한 예를 들어, 말라리아) 적절한를 선택합니다.

3. 전기 생리학 ⁽⁸ 팁 기록 1 그림)

1. 기계적으로 유리 모세관을 당겨 양식 유리 전극. 열을 최적화하고 적절하게 모양 recordi를 형성하기 위해 유리를 끌어 설정을 당겨NG 전극. 조심스럽게 그 대상을 sensillum 봉투 좁아서하지만 인접 구조물과의 접촉을 피하기 위해 충분히 작은 개구 전극 팁을 만들 해부 현미경 집게를 사용하여 유리 전극의 단부를 끊는.
2. 현미경 하에서 시각적 형태에 의해 식별 및 팁 기록 반복성을 보장하기 위해 목표 sensilla / sensillum 위치. 준비 동물 전극 항목의 각도에서 sensilla에 무료로 액세스를 허용합니다.
3. -20 ° C에서 냉동실에 콜드 마취 성인 곤충. 차가운 온도에 과다 노출에 의해 주변 신경 세포의 손상을 방지. 유리 슬라이드에 면도날 셀로판 테이프의 좁은 스트립을 잘라. 좁은 스트립을 사용하여 유리 슬라이드에 고정시킨다 전체 곤충.
4. 무관심 (접지) 전극 역할을하는 등의 흉부 또는 눈에 화학적으로 날카롭게 텅스텐 와이어를 삽입합니다.
5. 관심의 자극 솔루션 단계 3.1에서 만든 유리 전극을 입력합니다. 삽입 된 주사기를 사용하여 캡을 채우기뽑아 끝에서 illary는 끝을 무디게합니다. 헐 끝을 잡고, 모든 공기 방울을 쓸어 넘기. 기록 및 자극 전극 역할을하는 단계 3.1에서 만든 유리 전극에 실버 와이어 (chloriding 옵션)를 삽입합니다.
6. 곤충에 연락처 chemoreceptive의 sensilla에서 녹음 용으로 설계된 프리 앰프에 전극을 연결합니다. 이 프리 앰프 (300 HZ-3 kHz의 대역 통과 필터)는 가능한 한 도입 자극에 가까운 신경 세포의 활동을 캡처 안정 시간을 줄일 수 있습니다. 수집, 저장 및 스파이크 기록 소프트웨어를 구비 한 마이크로 컴퓨터를 이용하여 전기 신호를 분석한다.
   주 : 대폭 신호 대 잡음비를 개선 할 수있다 적절히 녹화 설정을 접지.
7. 기능성을 보장하기 위해 제어 용액 (전해질 만)으로 sensilla을 자극한다. 모든 준비에 대한 자극 이슈 다음 200 밀리 초를 시작 스파이크를 계산합니다.
8. 용량 - 반응 연구를 제외하고, 모든 실험에 대해 테스트 약품의 순서를 랜덤 화,편견을 제거합니다. 용량 - 반응 연구를위한, 실험 화학 물질의 농도를 증가시키는 sensilla 노출. 적절한 복구를 보장하는 자극 사이의 3 분의 최소 허용.
   참고 :이 요구 사항은 곤충과 sensilla에 따라 다를 수 있습니다. 임계치는 표준 오차가 시험 된 최소 농도의 표준 오차와 중복되지 않는 것을위한 농도로 정의된다.

4. RNA의 분리 및 시퀀싱 (그림 2)

1. 단단히 스냅 캡 튜브에 맞게 조직 disruption.Prepare 동반 된 RNase없는 방앗 전에 드라이 아이스에 그들을 냉각하여 밀착 RNAse가없는 방앗를 준비합니다. 적극적으로 초과 응축을 방지하기 위해 해부하지 않는 폐쇄 수집 튜브를 유지합니다.
2. 필터링 흡입기를 사용하여, 30 ~ 40 냉간 마취 모기 (° C의 냉동고 -20에서 15 초) 감기 무대와 종류의 성별을 배치합니다. 장소 동물 맛 부속을 손상하지 않도록 날개를 잡고, 아래 쪽 지느러미.
3. 미세 두 쌍의 집게를 사용하여 해부 현미경 수컷 또는 암컷에서, 페어링 라벨라 또는 tarsi 해부 및 인접 조직의 포함을 제한한다.
   참고 : 500 쌍 라벨라 총 mRNA의 약 800 ~ 1,000 나노 그램을 얻을 수 있습니다. (400) 개인 tarsi (5 세그먼트 각) 총 mRNA를 1,200-1,800 나노 그램을 얻을 수 있습니다.
4. 허걱 - 포셉 한 쌍, 가볍게 내부 stylets 노출 라벨라에 바로 인접 모기 코를 잡고. 컬렉션 포셉의 다른 쌍을 사용하여, 라벨라를 제거하고 차가운 수집 관의 측면에 조직을 추가합니다.
5. 포셉 한 쌍, 가볍게 경골 먼저 눈꺼풀 세그먼트의 교차점에 모기 다리를 잡고. 포셉의 다른 쌍을 사용하여, tarsi를 제거하고 차가운 수집 관의 측면에 조직을 추가합니다.
   참고 : 원 원치 않는 조직의 인터페이스에서 계정에 세포 유형을 가져 가라. 조직은 이웃의 포함을 제한하는 것이 중요하지만, 그것은 조직의 원하는 부분을 생략하지 않는 것도 중요하다. Fi를최종 샘플은 정확하게 관심의 전체 기관을 대표해야합니다. 수집 집게 정확하게 벗기거나 만 원하는 조직을 잡아 해방 할 수 있도록 쥐고 집게로 정확한 경계를 만듭니다.
6. 주기적으로 튜브의 맨 아래에있는 조직을 유지하기 위해 9,000 XG에서 간단히 0 ° C 원심 분리기 컬렉션 튜브를 스핀 다운. 수분이 해부하는 동안 수집 튜브에 축적되면, 수집 된 조직을 충당하기 위해 추운 트리 졸 시약 50 ㎕를 추가합니다.
7. 오염 방지 실험실 마커를 사용하여 명확하게 하나의 RNase가없는 1.5 ml의 수집을위한 각 조직 유형에 대한 캡 튜브 스냅 레이블을 붙입니다. (트리 졸의 경우 미세 조각) 1.5 ML 튜브 랙 및 액체 질소를 사용하여 한 미세 분말로 조직을 분쇄 동결. 한 번 반복합니다. 1 ml의 트리 졸의 전체 볼륨을 가져와 와동에 의해 지상 조직을 재현 탁.
8. 클로로포름 200 ㎕ 씩 첨가하고 잘 혼합한다. 실온에서 5 분 후, 12 ° C에서 15 분 동안 11,000 XG에서 원심 분리기에서 스핀 다운. 주의하여게놈 DNA 필터 컬럼에 직접 수성 층을 추가합니다. 5 분 동안 11,000 X g에서 스핀 다운. 통해 흐름과 피펫으로 섞어의 RNase없는 70 % 에탄올의 동일한 볼륨을 추가합니다. RNA 수집 컬럼에 액체를 전송하고 제공된 지침에 따라 RNA 추출을 계속합니다.
9. 정량화 및 정밀 분광 광도계에 총 RNA의 순도를 평가하고 표준 RNA 시퀀싱 방법으로 진행합니다.

5. 정량적 RT-PCR RNA 시퀀싱의 검증 (그림 3)

1. 예측 된 시퀀스 추정 화학 감각 풍부하고 유전자 기능 모두에서의 동적 범위에 걸쳐 상대적인 유전자 발현 수준을 비교하기 위해 가능한 한 많은 유전자를 선택한다.
2. 각각의 표적 유전자에 대한 디자인 프라이머 쌍은 특정 100-180 염기쌍 PCR 생성물을 증폭한다. 세트 당 적어도 하나의 프라이머를 확인하여 비특이적 gDNA를 증폭을 제외하면 인트론 경계에 걸쳐있다. 대안 적으로, 게놈 오염을 줄이기 위해 DNase의 처리를 사용한다.
3. 수집이전 섹션에 설명 된대로 곤충 조직. 모든 QRT-PCR 반응을 완료하는 데 충분한 RNA를 제공 할 필요가 얼마나 많은 조직 계산한다.
   참고 : 생물 세중 및 기술 세중의 반응은 결과에서 최대의 확신을 제공 할 것입니다.
4. 생물학적 기술을 모두 각 각 대상 유전자와 평균에 대한 ^{(CT [대상] -ct [참조])} 복제 ^- X _대상으로 상대 유전자 정량을 계산합니다. 생물학적 복제물 사이 코네티컷 값을 정상화 하우스 키핑 유전자 (들)을 사용하여 상대 표현의 비교에서 Y 축 스케일을 뿌리.
5. RNA-SEQ와 회귀 - 기반, 부트 스트랩 절차 등가 ^구 반복적 각 조직으로부터 데이터에 적용을 사용 QRT-PCR 데이터 세트의 유사도를 평가한다.
   주 :이 절차는 관측 된 RNA-SEQ와 QRT-PCR 데이터들로 생성 될 수있는 최소 "유사성의 영역"을 식별하고, qRT- 의해 측정 된 상대적 유전자 발현을 허용PCR-RNA는 서열 번호 상대적 유전자 발현의 측정에 통계적으로 동일하게 간주한다.

결과

애에서 활동 전위의 추적 기록. aegypti 미각 sensilla (도 1) 화학 약품의 범위와 직접 자극의 효과를 입증한다. 이 기술은 합리적인 시간 범위 (일반적으로 적은 500 ms보다)를 통해 주어진 진폭과 지속 시간의 스파이크를 계산하여 어떤 자극하는 화학 물질에 대한 응답을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 추적 기록은 실험 조건 주어진 조건에서 쉽게 재현 할 수 있어야합니...

토론

미각 sensilla에서 녹음 활동 전위의 가장 어려운 측면이있는 응답을 결정하는 것입니다 "정상적인."주어진 곤충 종, 총 수 및 미각 수용체 뉴런의 감도 (GRNs)에 대한 첫 번째 시간을 기록하는 하나의 미각 sensillum 팁을 사용하면됩니다 가능성이 알 수 없습니다. 많은 예비 녹음을 먼저 범위 및 테스트하는 화학 물질의 농도를 결정해야합니다. 이 경우에, 우리는 단일 GRN DEET (도 1)의

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass capillary	A-M Systems	628000	Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4"
Silver wire	A-M Systems	7875	.015" bare
Tungsten wire	Alfa Products	369	0.127 mm diameter
Fine forceps	Fine Science Tools	11252	#5SF Inox
Refridgerated stage	BioQuip Products	1429	Chill Table
Preamplifier	Syntech	Taste Probe	preamplifier
Software for electrophysiology	Syntech	Autospike	software for electrophysiology
TetraMin fish food	Tetra	Tropical fish food granules	fish food ground to fine powder
TRIzol	Life Technologies	15596-026	RNA isolation reagent
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74136	includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns
Nanodrop spectrophotometer	Nano Drop Products	ND-1000	tabletop spectrometer
R statistics	freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka)	www.r-project.org	Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment.
1.5 ml tube rack	Evergreen	240-6388-030	Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue.
1.5 ml collection tubes with pestle	Grainger	6HAX6	RNase free
Centrifuge	Thermo Scientific	11178160	Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube.
Primer-BLAST Primer Designing tool	NCBI	n/a