生理录音和黄热病蚊子的味觉附属物RNA测序<em&gt;埃及伊蚊</em

摘要

使用两种方法来估计基因表达的埃及伊蚊的主要味觉附属物，我们已经确定了一套基因假定存在的潜在的神经元的反应，以苦和排斥的化合物，通过电生理检查确定。

摘要

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

引言

像DEET，Picaridin，香茅醛和IR3535化合物已被证明有效的驱蚊，包括重要的病媒埃及伊蚊 ^1,2。我们从具体的味觉感受器相关决定参与蚊虫驱避细胞感觉神经元记录动作电位。再加上表达的基因，在这些组织中的下游测序，我们可以识别以筛选改善斥功能的新的化合物的基因最有可能介导这些细胞的反应。

RNA-SEQ是一个强大的工具，迅速成为标准的跟踪基因表达的时空变化。昆虫化学感受附属物的RNA序列分析和器官已被用来发现几种昆虫物种^3-5分子的受体，通过基因⁶大大提高在常规的基于PCR的基因搜索。昆虫是最多样的动物类，预senting许多机会来研究基因和独特的表型之间的连接。 RNA-SEQ技术可以受雇于任何活昆虫组织。同样地，电生理记录从内部uniporous味觉感受器感觉细胞可以在许多不同的昆虫种类来实现。这两种技术的配对使研究人员能够缩小参与的观察化学感受表型组基因。不同物种会出现特殊的挑战，但可以通知化学感应受体基因和化学感受适应之间的连接。的大小和化学感受感器的形态是可变的，记录动作电位时，以减少噪音，并确定可重复的信号可能需要大量的故障排除。化学感受器官的解剖可能是微不足道的或微妙且耗时的，这取决于形态昆虫和大小。回收的高品质RNA可能需要一些故障排除为好，如避免在某些颜料组织收集。

而通过行为试验证实剂化合物的作用是直接的和翔实的，这种方法是时间密集和广泛的方面的作用机制。电加上RNA-SEQ允许的是什么驱使避税行为的昆虫更具体的分析。一旦化学歧视的"工具箱"已经在昆虫物种鉴定，更具体的尝试，以改善已知的驱虫剂是可能的。受体和相关蛋白在负责这些行为感官细胞可以异源直接化学筛选来表示。此外，分子模型可以预测哪些化学物质会引起强烈的反应，这些受体^7。

的一组化学感受组织窄所有活性的基因的快照也可能是在鉴定相似的基因在其他物种有用的。使用序列同源性和表达SImilarities，研究人员可能形成集分子受体最有可能调解反应驱虫剂是昆虫相当有效的。我们提出以下方案，以帮助研究人员在解构昆虫化学感受途径和说服更多的深入到非型号和重要经济昆虫的神经行为学。

研究方案

1.饲养阂。伊蚊成人

1. 孵化的鸡蛋在浅盘约¾英寸的水。拥挤会降低成人的尺寸。
2. 后排幼虫在25°C（12-HL:12-HD）和饲料与地面的鱼食。
   注:过度喂食可能会降低存活率。
3. 每天单独删除蛹由巴斯德吸管，并转移到塑料菜细网状盖（9厘米×5.5厘米）内的小水桶遏制，从而确立了24小时的年龄组。
4. 由棉花球进料成蚊10％蔗糖溶液置于笼壳体的屏壁上下同一光周期作为幼虫的蚊子在环境室中于27℃和70％相对湿度。
5. 对于电，用5-10日龄的动物。在一般情况下，较大的动物将产生更好的结果。对于RNA分离，可使用动物内，在5-10天龄的范围内的单个24小时年龄分组那个。

2。对化学品的准备

1. 确定电解质（ 如 1-10毫米）的引出最小的活动，从选定的感觉神经元的适宜浓度。 10毫米氯化钠或氯化钾为1mM是合理的电解质时，开始了一个实验来测试基线活动。
2. 溶解各实验化学在合适的溶剂（如果不是水，使用乙醇或DMSO）相比单独电解质对尖峰活性几乎没有或没有影响。最终浓度10％的乙醇或1％DMSO中是合理的起始浓度。
3. （苦或蔗糖甜如奎宁）昆虫是很好的描述喂养威慑或兴奋剂控制化学品选择合适的。

3.电生理学（尖记录^8;图1）

1. 表玻璃电极通过机械拉玻璃毛细管。优化的热量和拉设置拉玻璃形成适当形状的recordi吴电极。小心使用以创建电极尖端开口是足够宽，以包络目标感器，但是足够小，以避免与邻近结构接触在解剖显微镜下用镊子折断玻璃电极的末端。
2. 在显微镜下，用视觉形态识别和定位目标感器/感器，以确保记录头可重复性。准备动物允许从电极进入角度自由进入感器。
3. 冷麻醉成虫在冷冻在-20℃。避免外周神经元损害过度暴露于寒冷的气温。切透明胶带窄条与载玻片刀片。固定使用狭长载玻片全虫。
4. 将化学削尖的钨丝放入背胸部或眼睛充当冷漠的（地）电极。
5. 填在步骤3.1与感兴趣刺激溶液玻璃电极。使用插入注射器，瓶盖填写从拉到底illary钝结束。轻弹所有气泡，拿着拉降到底。插入一个银线（氯化可选）到在步骤3.1使玻璃电极作为记录和刺激电极。
6. 连接电极是专为录音从昆虫接触化学感受性感器前置放大器。此前置放大器（300 Hz至3 kHz的带通滤波器）将减少沉降时间捕捉到神经元的活动接近刺激引进越好。收集，存储和分析使用装备有穗记录软件的微计算机的电信号。
   注意:正确接地的记录设置可以大大提高信噪比。
7. 刺激感受器与控制解决方案（仅电解质），以确保功能。数起200毫秒后的刺激伪迹的所有准备工作尖峰。
8. 随机化的测试化学品的顺序对所有的实验中，除了剂量响应研究中，消除偏见。对于剂量响应研究中，暴露感器增加了实验化学浓度。允许一个最小的刺激之间3分钟，以确保有足够的恢复。
   注:此要​​求可能因昆虫和感器有所不同。阈值被定义为浓度的量的标准误差不与所测试的最低浓度的标准误差重叠。

4. RNA分离和测序（图2）

1. 通过在干冰冷却他们组织disruption.Prepare陪同无RNase杵适合扣帽管紧之前，请准备紧紧贴合无RNA酶的杵。保持关闭，除非积极解剖，以避免过多的冷凝收集管。
2. 使用过滤吸引，放在冷的阶段，排序按性别30〜40冷麻醉蚊子（15秒-20℃的冰箱）。地方动物背面向下，抓翅膀不损害味道的附加物。
3. 使用两对细镊子，解剖来自男性或女性配对labella或跗骨解剖显微镜下，限制包括邻近组织。
   注:500配对labella产生大约800-1000毫微克的总mRNA的。 400个人跗节（各5段）产生1,200-1,800纳克总mRNA的。
4. 随着1对喘气，钳，轻轻抓住蚊子的长鼻刚好接近labella露出内口针。使用其他对集合镊子，取出labella并添加组织，以冷收集管端。
5. 随着一对钳，轻轻抓住蚊子腿的胫骨和跗首段的交界处。使用其他钳子，去除跗节，并添加组织，以冷收集管端。
   注:考虑到细胞类型的有用和无用的组织接口。而重要的是要限制本列入邻近组织的，但同样重要的是不能省略期望的组织的部分。该网络最终样本必须准确地代表相关的整个器官。创建与抓钳，这样收集的镊子可以精确解放刮或只抓取所需的组织精确的边界。
6. 周期性的，短暂0℃的离心机降速收集管在9000 XG保持在组织管的底部。如果湿气清扫过程中积累的收集管，冷Trizol试剂的添加50μl的覆盖收集的组织。
7. 采用防污实验室标志，清楚标示1无RNase1.5毫升扣帽筒每个组织类型的集合。用1.5ml的管架和液氮，冷冻然后研磨组织成细粉（细块，如果在Trizol法）。重复一次。带来的Trizol总体积至1ml和通过涡旋重新悬浮地面组织。
8. 加入200微升氯仿调匀。 5分钟后，在室温下，在离心机降速在4℃和11000×g离心15分钟。小心直接添加水层，以基因组DNA过滤柱。降速在11000×g下5分钟。添加等体积的不含RNA酶的70％的乙醇的流通，并用移液管混合。液体转移到RNA的收集列，并继续按照提供的说明RNA提取。
9. 量化和评估精密分光光度计总RNA的纯度和进行任何标准的RNA测序方法。

5.定量RT-PCR RNA测序的确认（图3）

1. 无论是在预测序列的丰度和推定化学感受基因功能选择尽可能多的基因尽可能多的动态范围进行比较的相对基因表达水平。
2. 设计的引物对为每个目标基因扩增特定100-180碱基对的PCR产物。通过确保每个组的至少一个引物中排除非特异性扩增的gDNA跨越内含子边界。另外，使用DNA酶处理以减少基因组污染。
3. 收集如前节所述昆虫组织。计算多少组织被要求提供足够的RNA完成所有QRT-PCR反应。
   注:生物一式三份和技术一式三份的反应将提供最大的信心的结果。
4. 计算相对基因定量为X _目标 ^{-数（Ct [目标] -CT [参考]），}为每个目标基因和平均每个重复，生物和技术。用看家基因（S）正常化生物复制的Ct值，并根Y轴规模相对表达的比较。
5. 评估RNA的序列，并使用基于回归的，自举等价方法^9，迭代应用，从每个组织的数据的qRT-PCR数据集的相似性。
   注:此过程识别可以在周围观察到的RNA-SEQ和定量RT-PCR数据构建的最小的"相似的区域"，并让相关的基因表达由qRT-测PCR技术被认为是统计学相当于相对基因表达的RNA的序列的测定。

结果

跟踪记录从阂动作电位。伊蚊味觉感受器（ 图1）证明直接刺激与一系列的化学品的有效性。这种技术可用于通过计数一给定幅度和持续时间的尖峰在一个合理的时间范围内（一般小于500毫秒）来量化反应的任何化学刺激。迹记录必须在给定的实验条件下很容易地再现的。否则，所观察到的生理反应可以表示试验物种的个体之间罕见的表型。

原始RNA-...

讨论

的记录动作电位从味觉感受器的最具挑战性的方面是决定哪些响应是"正常的"。当使用单一味觉感器尖记录第一时间为给定的昆虫物种，总数和味觉受体的神经元的敏感性（GRNS）是可能不明。来决定的范围内，化学品，以测试的浓度许多初步录音首先必需的。在这种情况下，我们开始与该单个的GRN响应低浓度DEET（ 图1）的观察。接着，我们研究了同感器内的反应的范围内已知的苦味?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass capillary	A-M Systems	628000	Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4"
Silver wire	A-M Systems	7875	.015" bare
Tungsten wire	Alfa Products	369	0.127 mm diameter
Fine forceps	Fine Science Tools	11252	#5SF Inox
Refridgerated stage	BioQuip Products	1429	Chill Table
Preamplifier	Syntech	Taste Probe	preamplifier
Software for electrophysiology	Syntech	Autospike	software for electrophysiology
TetraMin fish food	Tetra	Tropical fish food granules	fish food ground to fine powder
TRIzol	Life Technologies	15596-026	RNA isolation reagent
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74136	includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns
Nanodrop spectrophotometer	Nano Drop Products	ND-1000	tabletop spectrometer
R statistics	freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka)	www.r-project.org	Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment.
1.5 ml tube rack	Evergreen	240-6388-030	Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue.
1.5 ml collection tubes with pestle	Grainger	6HAX6	RNase free
Centrifuge	Thermo Scientific	11178160	Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube.
Primer-BLAST Primer Designing tool	NCBI	n/a