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Method Article
使用两种方法来估计基因表达的埃及伊蚊的主要味觉附属物,我们已经确定了一套基因假定存在的潜在的神经元的反应,以苦和排斥的化合物,通过电生理检查确定。
Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.
像DEET,Picaridin,香茅醛和IR3535化合物已被证明有效的驱蚊,包括重要的病媒埃及伊蚊 1,2。我们从具体的味觉感受器相关决定参与蚊虫驱避细胞感觉神经元记录动作电位。再加上表达的基因,在这些组织中的下游测序,我们可以识别以筛选改善斥功能的新的化合物的基因最有可能介导这些细胞的反应。
RNA-SEQ是一个强大的工具,迅速成为标准的跟踪基因表达的时空变化。昆虫化学感受附属物的RNA序列分析和器官已被用来发现几种昆虫物种3-5分子的受体,通过基因6大大提高在常规的基于PCR的基因搜索。昆虫是最多样的动物类,预senting许多机会来研究基因和独特的表型之间的连接。 RNA-SEQ技术可以受雇于任何活昆虫组织。同样地,电生理记录从内部uniporous味觉感受器感觉细胞可以在许多不同的昆虫种类来实现。这两种技术的配对使研究人员能够缩小参与的观察化学感受表型组基因。不同物种会出现特殊的挑战,但可以通知化学感应受体基因和化学感受适应之间的连接。的大小和化学感受感器的形态是可变的,记录动作电位时,以减少噪音,并确定可重复的信号可能需要大量的故障排除。化学感受器官的解剖可能是微不足道的或微妙且耗时的,这取决于形态昆虫和大小。回收的高品质RNA可能需要一些故障排除为好,如避免在某些颜料组织收集。
而通过行为试验证实剂化合物的作用是直接的和翔实的,这种方法是时间密集和广泛的方面的作用机制。电加上RNA-SEQ允许的是什么驱使避税行为的昆虫更具体的分析。一旦化学歧视的"工具箱"已经在昆虫物种鉴定,更具体的尝试,以改善已知的驱虫剂是可能的。受体和相关蛋白在负责这些行为感官细胞可以异源直接化学筛选来表示。此外,分子模型可以预测哪些化学物质会引起强烈的反应,这些受体7。
的一组化学感受组织窄所有活性的基因的快照也可能是在鉴定相似的基因在其他物种有用的。使用序列同源性和表达SImilarities,研究人员可能形成集分子受体最有可能调解反应驱虫剂是昆虫相当有效的。我们提出以下方案,以帮助研究人员在解构昆虫化学感受途径和说服更多的深入到非型号和重要经济昆虫的神经行为学。
1.饲养阂。伊蚊成人
2。对化学品的准备
3.电生理学(尖记录8;图1)
4. RNA分离和测序(图2)
5.定量RT-PCR RNA测序的确认(图3)
跟踪记录从阂动作电位。伊蚊味觉感受器( 图1)证明直接刺激与一系列的化学品的有效性。这种技术可用于通过计数一给定幅度和持续时间的尖峰在一个合理的时间范围内(一般小于500毫秒)来量化反应的任何化学刺激。迹记录必须在给定的实验条件下很容易地再现的。否则,所观察到的生理反应可以表示试验物种的个体之间罕见的表型。
原始RNA-...
的记录动作电位从味觉感受器的最具挑战性的方面是决定哪些响应是"正常的"。当使用单一味觉感器尖记录第一时间为给定的昆虫物种,总数和味觉受体的神经元的敏感性(GRNS)是可能不明。来决定的范围内,化学品,以测试的浓度许多初步录音首先必需的。在这种情况下,我们开始与该单个的GRN响应低浓度DEET( 图1)的观察。接着,我们研究了同感器内的反应的范围内已知的苦味?...
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Bryan T. Vinyard of the USDA, Agricultural Research Service, Henry A. Wallace Beltsville Agricultural Research Center, Biometrical Consulting Service, Beltsville, MD for statistical analyses. This work was supported in part by a grant to J.C.D. from the Deployed War Fighter Protection (DWFP) Research Program funded by the Department of Defense through the Armed Forces Pest Management Board (AFPMB).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Glass capillary | A-M Systems | 628000 | Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4" |
Silver wire | A-M Systems | 7875 | .015" bare |
Tungsten wire | Alfa Products | 369 | 0.127 mm diameter |
Fine forceps | Fine Science Tools | 11252 | #5SF Inox |
Refridgerated stage | BioQuip Products | 1429 | Chill Table |
Preamplifier | Syntech | Taste Probe | preamplifier |
Software for electrophysiology | Syntech | Autospike | software for electrophysiology |
TetraMin fish food | Tetra | Tropical fish food granules | fish food ground to fine powder |
TRIzol | Life Technologies | 15596-026 | RNA isolation reagent |
RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74136 | includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns |
Nanodrop spectrophotometer | Nano Drop Products | ND-1000 | tabletop spectrometer |
R statistics | freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka) | www.r-project.org | Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment. |
1.5 ml tube rack | Evergreen | 240-6388-030 | Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue. |
1.5 ml collection tubes with pestle | Grainger | 6HAX6 | RNase free |
Centrifuge | Thermo Scientific | 11178160 | Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube. |
Primer-BLAST Primer Designing tool | NCBI | n/a |
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