Fisiológicas Recordings e RNA Sequenciação dos gustativas Appendages do Mosquito-febre amarela<em&gt; Aedes aegypti</em

Resumo

O uso de dois métodos para estimar a expressão do gene nos principais apêndices gustativas de Aedes aegypti, identificamos o conjunto de genes putativamente subjacentes às respostas neuronais para compostos amargos e repulsivas, conforme determinado pelo exame eletrofisiológico.

Resumo

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

Introdução

Compostos como DEET, Picaridin, Citronelal e IR3535 foram mostrados para repelir os mosquitos de forma eficaz, incluindo os importante vetor da doença Aedes aegypti ^1,2. Registramos potenciais de ação de neurônios sensoriais associados com sensilla gustativa específica para determinar as células envolvidas com mosquito repelência. Juntamente com a jusante sequenciação de genes expressos nestes tecidos, que pode identificar os genes mais provável que medeiam as respostas destas células, a fim de rastrear novos compostos para melhorar a capacidade de repelência.

RNA-seq é uma ferramenta poderosa, rapidamente se tornando padrão para controlar alterações temporais e espaciais na expressão gênica. Analisa RNA-seq de apêndices quimio insectos e órgãos foram usadas para descobrir receptores moleculares em várias espécies de insectos ^3-5, melhorando consideravelmente em pesquisas de genes baseados em PCR convencional pelo gene ^6. Insetos representar a classe animal mais diverso, prétando muitas oportunidades para estudar a relação entre os genes e os fenótipos únicos. Tecnologia de RNA-seq pode ser empregue em qualquer tecido de insectos vivos. Da mesma forma, a gravação electrofisiológica de células sensoriais dentro sensilas gustativa uniporous pode ser conseguido de muitas diferentes espécies de insectos. O emparelhamento das duas técnicas, permite que os pesquisadores para reduzir os genes envolvidos no conjunto de um fenótipo chemosensory observado. Diferentes espécies apresentará desafios específicos, mas podem informar a conexão entre genes de receptores de quimio e uma adaptação chemosensory. O tamanho ea morfologia dos chemosensory sensilla é variável e poderá exigir solução de problemas durante a gravação de potenciais de ação para reduzir o ruído e identificar sinais repetíveis. As dissecções de órgãos quimio pode ser trivial ou delicado e demorado, dependendo da morfologia e tamanho do insecto. Recuperação de RNA de alta qualidade pode exigir alguma resolução de problemas, bem como, tais como evitar certos pigmentos durantecoleta de tecido.

Ao demonstrar os efeitos dos compostos repelentes através de ensaios de comportamento é direta e informativa, esta abordagem é demorada e ampla em relação ao mecanismo de ação. Eletrofisiologia juntamente com RNA-seq permite análises mais específicas do que impulsiona comportamentos de esquiva em insetos. Uma vez que o "kit" de discriminação produtos químicos foi identificado em uma espécie de insecto, tentativas mais específicos para melhorar repelentes conhecidos são possíveis. Receptores e proteínas associadas em células sensoriais responsáveis ​​por estes comportamentos podem ser expressas de forma heteróloga para o rastreio química directa. Além disso, modelagem molecular pode prever quais os produtos químicos que induzem respostas fortes de estes receptores ^7.

O instantâneo de todos os genes activos num conjunto restrito de tecidos quimio pode também ser útil na identificação de genes semelhantes noutras espécies. Usando homologia de sequência e de expressão de similarities, os investigadores podem formar conjuntos de receptores moleculares mais provável que medeiam respostas aos repelentes que são amplamente eficaz de insectos. Nós apresentamos o seguinte protocolo para auxiliar os pesquisadores na desconstrução vias quimio insetos e persuadir mais se aprofundar no neuroethology de não-modelo e insetos de importância econômica.

Protocolo

1. Cria Ae. adultos aegypti

1. Ovos eclodem em cerca de ¾ de polegada de água na bandeja rasa. A superlotação irá reduzir o tamanho dos adultos.
2. Larvas Rear a 25 ° C (12-HL: 12-HD) e se alimentam com comida de peixe chão.
   NOTA: super-alimentação pode reduzir as taxas de sobrevivência.
3. Remover pupas individualmente por Pasteur pipeta diária e transferir para pratos de plástico (9 cm × 5,5 cm) dentro de pequenos baldes de confinamento, com tampas de malha fina, estabelecendo, assim, 24 grupos etários hr.
4. Mosquitos adultos alimentar 10% de solução de sacarose por bola de algodão colocado nas paredes de tela de uma habitação gaiola os mosquitos em uma câmara a 27 ° C e 70% de umidade relativa do ar sob o mesmo fotoperíodo como larvas.
5. Para eletrofisiologia, use 5-10 dias animais velhos. Em geral, os animais maiores irão produzir melhores resultados. Para o isolamento do RNA, usar animais que estão dentro de um único agrupamento idade 24 hr no intervalo de 5-10 dias de idade.

2. Preparação de Produtos Químicos

1. Determinar a concentração adequada de eletrólitos (por exemplo, 1-10 mM) que provoca atividade mínima de neurônios sensoriais selecionadas. NaCl 10 mM ou 1 mM KCl são eletrólitos razoáveis ​​para testar actividade de base ao começar um experimento.
2. Dissolver cada produto químico experimental em solvente apropriado (se não a água, o uso de etanol ou DMSO) que tem pouco ou nenhum efeito na actividade de pico quando comparadas aos electrólito sozinho. As concentrações finais de etanol a 10% ou 1% de DMSO são concentrações de partida razoáveis.
3. Selecione adequado (por exemplo quinina por amargo ou sacarose para doces) de controle de produtos químicos que são bem descritos impedimentos alimentação ou estimulantes em insetos.

3. Eletrofisiologia (gravação ponta ^8; Figura 1)

1. Eletrodos de vidro Form puxando mecanicamente capilares de vidro. Otimizar calor e puxar configurações para puxar vidro para formar recordi forma apropriadaeletrodos GN. Quebre cuidadosamente off final do eletrodo de vidro usando uma pinça sob um microscópio de dissecação para criar ponta do eletrodo de abertura que é grande o suficiente para envolver sensillum alvo, mas pequeno o suficiente para evitar o contacto com estruturas vizinhas.
2. Sob um microscópio, identificar visualmente pela morfologia e posicionar o alvo sensilla / sensillum para garantir a repetibilidade de gravação ponta. Animais da preparação para permitir o acesso livre para sensilla de ângulo de entrada do eletrodo.
3. Anesthetize insetos adultos frias no congelador a -20 ° C. Evite danos aos neurônios periféricos por exposição excessiva ao frio. Corte tiras estreitas de fita adesiva com lâmina de barbear em lâmina de vidro. Imobilizar todo inseto em uma lâmina de vidro usando tiras estreitas.
4. Insira um fio de tungstênio quimicamente afiada no tórax dorsal ou olho para servir como o indiferente (terra) eletrodo.
5. Preencha eletrodo de vidro feita no passo 3.1 com uma solução estimulante de interesse. Usando uma seringa inserido, preencher capIllary de ponta puxado para blunt end. Deitar fora todas as bolhas de ar, segurando fim puxou para baixo. Coloque um fio de prata (chloriding opcional) para o eletrodo de vidro feita no passo 3.1 para servir como gravação e eletrodo estimulante.
6. Conecte-se eletrodos para um pré-amplificador que é projetado para gravações de contato chemoreceptive sensilla em insetos. Este pré-amplificador (300 Hz-3 kHz filtro de banda) irá reduzir o tempo de estabilização para capturar a atividade neuronal tão perto de estímulo introdução possível. Coletar, armazenar e analisar sinais elétricos usando um microcomputador equipado com software de gravação de pico.
   NOTA: O aterramento da configuração de gravação corretamente pode melhorar drasticamente a relação sinal-ruído.
7. Estimular sensilas com uma solução de controlo (apenas electrólito) para garantir a funcionalidade. Contagem de pontos a partir de 200 ms após o artefato estímulo para todas as preparações.
8. Aleatória a fim de produtos químicos de teste para todas as experiências, excepto estudos de dose-resposta,para eliminar o preconceito. Para os estudos de dose-resposta, para expor sensilas concentrações crescentes da substância química experimental. Permitir que um mínimo de 3 min entre as estimulações para garantir a recuperação adequada.
   Nota: Esta exigência pode variar dependendo do inseto e sensilla. O limiar é definido como a concentração para a qual o erro padrão não se sobrepõe com o erro padrão para a concentração mais baixa testada.

4. Isolamento de ARN e Sequenciação (Figura 2)

1. Prepare os pilões livre de RNAse bem ajustados pelo arrefecimento los em gelo seco antes de tecido disruption.Prepare acompanham pilões livre de RNase que se encaixam tubos de tampa de pressão com força. Manter tubos de coleta fechados a menos que dissecando ativamente para evitar o excesso de condensação.
2. Usando aspirador filtrada, coloque 30 a 40 mosquitos frio anestesiados (15 seg em freezer -20 ° C) na fase fria e ordenar por sexo. Coloque animais dorsal lado para baixo, segurando asas para não danificar apêndices gustativas.
3. O uso de dois pares de uma pinça fina, dissecar labella pareado ou tarsos de machos ou fêmeas sob um microscópio de dissecação e limitar a inclusão dos tecidos adjacentes.
   NOTA: 500 labella emparelhado rende aproximadamente 800-1.000 nanogramas de ARNm total. 400 tarsos indivíduo (5 cada) produzem segmentos 1,200-1,800 nanogramas de ARNm total.
4. Com um par de ofegantes-fórceps, levemente agarrar tromba mosquito apenas proximais para labella expondo estiletes interiores. Usando outro par de recolha-pinça, retire labella e adicionar o tecido para o lado do tubo de coleta de frio.
5. Com um par de fórceps, levemente agarrar mosquito perna no cruzamento da tíbia e do primeiro segmento tarsal. Usando outro par de fórceps, retire tarsos e adicionar o tecido para o lado do tubo de coleta de frio.
   Nota: Tenha em conta os tipos de células na interface do tecido queria e indesejado. Embora seja importante para limitar a inclusão de tecidos vizinhos, é igualmente importante para não omitir as porções de tecido desejado. A final amostra deve representar fielmente todo o órgão de interesse. Criar um limite preciso com a pinça de apreensão de tal forma que uma pinça de coleta pode precisamente libertar por raspagem ou pegar apenas o tecido desejado.
6. Periodicamente, girar tubo de coleta brevemente em 0 ° C centrifugar a 9000 xg para manter o tecido no fundo do tubo. Se a umidade se acumula nos tubos de coleta durante a dissecção, adicione 50uL de reagente Trizol fria para cobrir o tecido coletado.
7. Usando marcador laboratório anti-manchas, identifique claramente um livre de RNase 1,5 ml encaixe tubo de tampa para cada tipo de tecido para a coleção. Usando 1,5 ml suporte de tubos e nitrogênio líquido, congelada em seguida, moer tecido em pó fino (pedaços finos se em Trizol). Repetir uma vez. Levar o volume total de 1 ml de Trizol para ressuspender e tecido triturado por agitação em vórtex.
8. Adicionar 200 ul de clorofórmio e misture bem. Depois de 5 min à temperatura ambiente, rotação para baixo numa centrífuga a 4 ° C e 11.000 xg durante 15 min. Cuidadosamenteadicionar fase aquosa directamente numa coluna de filtro de DNA genómico. Girar a 11.000 x g durante 5 min. Adicionar um volume igual de RNase etanol a 70% a fluir-through e misture por pipeta. Transferir líquido a uma coluna de recolha de RNA e continuar a extracção de RNA por as instruções fornecidas.
9. Quantificar e avaliar a pureza do RNA total em um espectrofotômetro de precisão e prosseguir com qualquer método RNA seqüenciamento padrão.

5. quantitativa de RT-PCR de RNA Sequenciação de validação (Figura 3)

1. Seleccione tantos genes quanto possível comparar os níveis de expressão de genes relativos ao longo de um intervalo dinâmico, tanto em abundância previsto sequência e função do gene chemosensory presumido.
2. Pares de criação de iniciadores para cada gene alvo para amplificar um produto de PCR específico 100-180 pares de bases. Excluir amplificação gDNA não específica, garantindo pelo menos um iniciador por conjunto se estende por uma fronteira intron. Como alternativa, use o tratamento DNase para reduzir a contaminação genômica.
3. Coletartecidos de insecto, tal como descrito na secção anterior. Calcule quanto tecido é obrigada a fornecer RNA suficiente para completar todas as reações qRT-PCR.
   NOTA: triplicado Biológica e reações triplicado técnicos irá proporcionar o máximo de confiança nos resultados.
4. Calcule quantificação gene relativo como _alvo X ^{- (Ct [alvo] -Ct [referência])} para cada gene alvo e médio para cada réplica, tanto biológica quanto técnico. Use gene (s) serviço de limpeza para normalizar valores Ct entre repetições biológicas e para erradicar a escala do eixo Y em comparações de expressão relativa.
5. Avaliar a semelhança de RNA-seq e conjuntos de dados de qRT-PCR utilizando o, procedimento de bootstrap equivalência com base em regressão ^9, aplicada iterativamente, para os dados a partir de cada tecido.
   NOTA: Este procedimento identifica a mais pequena "região de semelhança" que pode ser construído em torno dos dados de RNA-seq e qRT-PCR observado, e permitir a expressão do gene como medido pela relação qRT-PCR para ser considerado estatisticamente equivalente à medição da expressão do gene em relação ao ARN-seq.

Resultados

As gravações de traço de potenciais de ação de Ae. sensilas gustativa aegypti (Figura 1) demonstrar a eficácia da estimulação directa com uma gama de produtos químicos. Esta técnica pode ser usada para quantificar respostas a qualquer químico estimulador contando picos de uma determinada amplitude e duração ao longo de um intervalo de tempo razoável (geralmente menos do que 500 ms). Gravações de rastreamento deve ser facilmente reproduzíveis sob um dado conjunto de con...

Discussão

O aspecto mais desafiador de potenciais de ação de gravação de sensilla gustativa é decidir quais as respostas são "normais". Quando se emprega única ponta sensillum gustativa gravação pela primeira vez para uma determinada espécie de inseto, o número total e sensibilidade dos neurônios dos receptores gustativos (GRNs) são provavelmente desconhecido. Muitas gravações preliminares são primeiros obrigados a decidir o alcance e as concentrações de produtos químicos para testar. Neste exemplo, q...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass capillary	A-M Systems	628000	Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4"
Silver wire	A-M Systems	7875	.015" bare
Tungsten wire	Alfa Products	369	0.127 mm diameter
Fine forceps	Fine Science Tools	11252	#5SF Inox
Refridgerated stage	BioQuip Products	1429	Chill Table
Preamplifier	Syntech	Taste Probe	preamplifier
Software for electrophysiology	Syntech	Autospike	software for electrophysiology
TetraMin fish food	Tetra	Tropical fish food granules	fish food ground to fine powder
TRIzol	Life Technologies	15596-026	RNA isolation reagent
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74136	includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns
Nanodrop spectrophotometer	Nano Drop Products	ND-1000	tabletop spectrometer
R statistics	freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka)	www.r-project.org	Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment.
1.5 ml tube rack	Evergreen	240-6388-030	Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue.
1.5 ml collection tubes with pestle	Grainger	6HAX6	RNase free
Centrifuge	Thermo Scientific	11178160	Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube.
Primer-BLAST Primer Designing tool	NCBI	n/a