Physiologische Aufnahmen und RNA-Sequenzierung der gustatorischen Anhangsgebilde der Gelbfieber-Moskito-<em&gt; Aedes aegypti</em

Zusammenfassung

Mit beiden Methoden, die Genexpression in den großen Geschmacks Anhängsel Aedes aegypti schätzen, haben wir den Satz von Genen, die mutmaßlich zugrunde liegenden neuronalen Antworten zu bitter und abstoßend Verbindungen identifiziert, wie durch elektrophysiologische Untersuchung bestimmt.

Zusammenfassung

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

Einleitung

Verbindungen wie DEET, Picaridin, Citronellal und IR3535 wurde gezeigt, dass Mücken, einschließlich der wichtigen Krankheitsüberträger Aedes aegypti ^1,2 wirksam abwehren. Wir erfassen Aktionspotentiale aus sensorischen Neuronen mit bestimmten Geschmacks Sensillen verbunden, um die Zellen mit Moskitoabweisung beteiligt zu bestimmen. Mit nachgeschaltetem Sequenzierung der exprimierten Gene in diesen Geweben gekoppelt ist, können wir die Gene wahrscheinlich Vermittlung der Reaktionen dieser Zellen, um neue Verbindungen zu verbessern abweisende Fähigkeiten Bildschirm identifizieren.

RNA-seq ist ein mächtiges Werkzeug, schnell zum Standard für die Verfolgung von zeitlichen und räumlichen Veränderungen in der Genexpression. RNA-seq-Analysen von Insekten chemosensory Anhängsel und Organe wurden zur molekularen Rezeptoren in verschiedenen Insektenarten ^3-5 aufzudecken, stark von herkömmlichen PCR-basierte Suche Gen Verbesserung von Gen ^6. Insekten stellen die verschiedensten Tierklasse, vor,senting viele Möglichkeiten die Verbindung zwischen Genen und einzigartige Phänotypen zu studieren. RNA-seq-Technologie kann auf jedem lebenden Insektengewebe eingesetzt werden. Ebenso können elektrophysiologische Ableitung von Sinneszellen im uniporous Geschmacks Sensillen in vielen verschiedenen Insektenarten erreicht werden. Die Paarung dieser beiden Techniken ermöglicht es den Forschern, die in einem beobachteten chemosensory Phänotyp beteiligt Satz Gene einzugrenzen. Verschiedene Arten werden spezifische Herausforderungen stellen, kann aber die Verbindung zwischen chemosensorischen Rezeptorgene und einer chemosensorischen Anpassung zu informieren. Die Größe und die Morphologie der chemosensorischen Sensillen ist variabel und kann bei der Aufnahme von Aktionspotentialen, um Lärm zu reduzieren und identifizieren reproduzierbare Signale erfordern eine umfangreiche Fehlersuche. Dissektionen chemosensorischer Organen kann trivial oder schwierige und zeitaufwendig, in Abhängigkeit von der Morphologie und Größe des Insekts. Rückgewinnung von hochwertigen RNA kann einige Fehlersuche sowie erfordern, wie beispielsweise die Vermeidung bestimmter Pigmente inGewebesammlung.

Zwar zeigen die Auswirkungen der abweisende Verbindungen durch Verhaltensversuche ist direkt und informativ ist dieser Ansatz Zeit intensive und breit in Bezug auf Wirkmechanismus. Elektrophysiologie in Verbindung mit RNA-seq ermöglicht eine spezifische Analysen dessen, was treibt Vermeidungsverhalten in Insekten. Sobald das "Toolkit" von chemischen Diskriminierung in einer Insektenart identifiziert worden, um genauere Versuche verbessern bekannten Repellents sind möglich. Rezeptoren und assoziierten Proteinen in Sinneszellen für diese Verhaltensweisen verantwortlich sind, können heterolog für direkte chemische Screening ausgedrückt werden. Weiterhin können molekulare Modellierung vorherzusagen, welche Chemikalien starken Antworten von diesen Rezeptoren ⁷ zu entlocken.

Die Momentaufnahme aller aktiven Gene in einer engen Gruppe von chemosensorischen Gewebe können auch nützlich bei der Identifizierung von ähnlichen Genen in anderen Spezies. Mit Sequenzhomologie und Ausdruck similarities Forscher können Sätze von molekularen Rezeptoren wahrscheinlich Vermittlung antwortet Repellentien, die breitenwirksame auf Insekten zu bilden. Wir präsentieren den folgenden Protokoll, um Forscher in die Dekonstruktion Insekten chemosensory Wege zu helfen und mehr zu überreden, in die Neuroethologie von nicht-Modell und wirtschaftlich wichtigen Insekten zu vertiefen.

Protokoll

1. Aufzucht Ae. aegypti Erwachsene

1. Hatch Eier in etwa ¾ Zoll Wasser in flache Schale. Überbelegung wird die Größe des Erwachsenen zu reduzieren.
2. Rück Larven bei 25 ° C (12-hl: 12-HD) und führen mit Grundfischfutter.
   HINWEIS: Überfütterung kann die Überlebensraten zu reduzieren.
3. Entfernen Puppen einzeln von Pasteur-Pipette täglich und Transfer in Plastikschalen (9 cm x 5,5 cm) in kleinen Contain Eimer mit feinmaschigen Deckel und schafft so 24 Stunden Altersgruppen.
4. Feed erwachsenen Mücken 10% Saccharose-Lösung mit Wattebausch auf den Bildschirm Wände eines Käfiggehäuse platziert die Mücken in einer Klimakammer bei 27 ° C und 70% relativer Luftfeuchtigkeit unter dem gleichen Photoperiode als Larven.
5. Für Elektrophysiologie, verwenden 5-10 Tage alten Tieren. Im Allgemeinen werden größere Tiere zu besseren Ergebnissen führen. Für die RNA-Isolierung, verwenden Sie Tiere, die in einem einzigen 24-Stunden-Alter Gruppierung in der 5-10 Tage alten Reihe sind.

2. Vorbereitung von Chemikalien

1. Bestimmen eines geeigneten Elektrolytkonzentration (zB 1-10 mM), die minimale Aktivität von ausgewählten sensorischen Neuronen auslöst. 10 mM NaCl und 1 mM KCl, vernünftig sind Elektrolyte zur Baseline-Aktivität zu testen, wenn zu Beginn eines Experiments.
2. Löse jede Versuchschemikalie geeigneten Lösungsmittel (wenn nicht Wasser, mit Ethanol oder DMSO), die wenig oder keine Wirkung auf Spike-Aktivität im Vergleich zu allein Elektrolyten. Endkonzentrationen von 10% Ethanol oder 1% DMSO, vernünftig sind Ausgangskonzentrationen.
3. Wählen Sie die entsprechende (zB Chinin für bitter oder Saccharose süß) Steuer Chemikalien, die gut beschrieben sind Fütterung Abschreckung oder Stimulanzien in Insekten.

3. Elektrophysiologie (Spitze Aufnahme ^8, Abbildung 1)

1. Form-Glaselektroden durch mechanisches Ziehen von Glaskapillaren. Optimieren Wärme und ziehen Sie die Einstellungen auf Glas zu ziehen, um entsprechend geformte recordi bildenng Elektroden. Vorsichtig abbrechen Ende Glaselektrode mit einer Pinzette unter einem Binokular zu Elektrodenspitze Öffnung, die breit genug ist, um die Ziel Sensillum Umschlag, aber klein genug, um den Kontakt mit benachbarten Strukturen zu vermeiden erstellen.
2. Unter dem Mikroskop visuell durch Morphologie identifizieren und positionieren Sie den Ziel Sensillen / Sensillum, um die Wiederholbarkeit der Spitze Aufnahme zu gewährleisten. Prep Tiere freien Zugang zu Sensillen von Winkel Elektroden Eintrag kann.
3. Kalte Anesthetize erwachsenen Insekten in Gefrierschrank bei -20 ° C. Schäden an peripheren Neuronen durch übermäßige Kälte zu vermeiden. Schneiden Sie schmale Streifen Klebeband mit Rasierklinge auf Glasobjektträger. Immobilisieren ganze Insekt auf einem Glasobjektträger mit schmalen Streifen.
4. Legen Sie eine chemisch geschärft Wolframdraht in die dorsalen Thorax oder Augen als indifferent (Masse) Elektrode dienen.
5. Füllen Glaselektrode in Schritt 3.1 mit einer anregenden Lösung von Interesse gemacht. Mit einem einge Spritze, füllen KappeIllary aus zog Ende stumpfen Ende. Streichen Sie alle Luftblasen, halten zog Ende nach unten. Legen Sie eine Silberdraht (chloriding optional) in die Glaselektrode in Schritt 3.1, um als Aufnahme und Stimulationselektrode zu dienen.
6. Schließen Elektroden an einen Vorverstärker, der für Aufnahmen von Kontakt chemorezeptiven Sensillen von Insekten ausgelegt ist. Dieser Vorverstärker (300 Hz-3 kHz-Bandpassfilter) wird die Einschwingzeit auf neuronale Aktivität so nah wie möglich Einführung Reiz einzufangen reduzieren. Sammeln, speichern und elektrische Signale mit einem Mikrocomputer mit Spike-Recording-Software ausgestattet analysieren.
   HINWEIS: Die Erdung des Aufnahme-Setup richtig kann Signal-zu-Rausch-Verhältnis deutlich verbessern.
7. Stimulieren Sensillen mit einer Kontrolllösung (Elektrolyt nur), um die Funktionalität zu gewährleisten. Graf Spikes ab 200 msec nach dem Reizartefakt für alle Zubereitungen.
8. Zufälliger Reihenfolge Testchemikalien für alle Experimente, außer Dosis-Wirkungs-Studienzum Vorspannen zu beseitigen. Für Dosis-Wirkungs-Studien, aufzudecken sensilla steigenden Konzentrationen der Versuchschemikalie. Warten Sie mindestens 3 Minuten zwischen Stimulationen eine ausreichende Erholung sicherzustellen.
   HINWEIS: Diese Anforderung kann je nach Insekten und Sensillen variieren. Threshold ist als die Konzentration, für die Standardfehler nicht mit der Standardfehler für die geringste untersuchte Konzentration lappen definiert.

4. RNA Isolierung und Sequenzierung (Figur 2)

1. Bereiten Sie die dicht schließende RNase-freien Stößel durch Abkühlung auf Trockeneis vor Gewebe disruption.Prepare Begleit RNase-freies Stößel, der Schnappdeckel Rohre eng anliegen. Halten Sammelröhrchen, wenn aktiv sezieren, um überschüssige Kondensation zu vermeiden geschlossen.
2. Mit gefiltert Sauger, legen 30 bis 40 Kalt betäubt Mücken (15 sec in -20 ° C Tiefkühlschrank) auf Kältestufe und Art von Sex. Platz Tieren dorsalen Seite nach unten, Greifen Flügel Geschmack Anhängsel nicht beschädigen.
3. Mit zwei Paaren von feinen Pinzette, sezieren gepaarten labella oder tarsi von Männern oder Frauen unter einem Binokular und Einbeziehung der angrenzenden Gewebe zu begrenzen.
   HINWEIS: 500 gepaart labella ergibt etwa 800-1.000 ng Gesamt-mRNA. 400 Einzel tarsi (5 Segmente jeweils) zu erhalten 1.200-1.800 ng Gesamt-mRNA.
4. Mit einem Paar keuchenden-Pinzette, leicht begreifen Mücke Rüssel proximal labella auszusetzen inneren Mandrins. Mit anderen Paar der Sammlung-Pinzette entfernen labella und fügen Gewebe Seite kalten Sammelröhrchen.
5. Mit einer Pinzette, leicht begreifen Moskito Bein an der Kreuzung von Schienbein und Fußwurzelknochen ersten Segment. Mit anderen Pinzette, entfernen tarsi und fügen Gewebe Seite kalten Sammelröhrchen.
   Hinweis: Beachten Sie die Zelltypen an der Schnittstelle zwischen erwünschten und unerwünschten Gewebe. Während es wichtig ist, die Aufnahme benachbarte Gewebe zu begrenzen, ist es ebenso wichtig, keine Abschnitte von gewünschten Gewebe wegzulassen. Der final Probe muss genau darzustellen das ganze Organ von Interesse. Erstellen Sie eine genaue Grenze mit den Greifzangen, dass Sammelzange präzise durch Schaben oder greifen nur das gewünschte Gewebe zu befreien.
6. Von Zeit zu Zeit, Spin-down Sammelröhrchen kurz in 0 ° C Zentrifuge bei 9000 xg, um Gewebe auf dem Boden des Röhrchens zu halten. Wenn sich Feuchtigkeit sammelt sich im Sammelröhrchen beim Präparieren, fügen Sie 50 ul kaltem Trizolreagenz gesammelte Gewebe zu bedecken.
7. Mit Anti-Schmutz Labormarker, eindeutig zu kennzeichnen ein RNase-freies 1,5 ml Schnappdeckel Rohr für jeden Gewebetyp für die Sammlung. Mit 1,5-ml-Röhrchen Rack und flüssigem Stickstoff gefrier dann schleifen Gewebe zu feinem Pulver (feine Stücke, wenn in Trizol). Wiederholen Sie einmal. Bringen Gesamtvolumen von 1 ml Trizol zu resuspendieren und Grundgewebe durch Vortexen.
8. Geben Sie 200 ul Chloroform und gründlich mischen. Nach 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren in Zentrifuge bei 4 ° C und 11.000 × g für 15 min. Vorsichtighinzuzufügen wässrige Schicht direkt an eine genomische DNA Filtersäule. Spin down bei 11.000 x g für 5 min. Hinzufügen gleichen Volumen RNase-free 70% Ethanol Durchflußrichtung und Mischen mit einer Pipette. Übertragen Flüssigkeit zu einer RNA Sammlung Spalte und weiter RNA-Extraktion gemäß den Anweisungen.
9. Messen und bewerten die Reinheit der Gesamt-RNA auf einem Präzisions-Spektralphotometer und fahren mit jedem Standard-RNA-Sequenzierungsmethode.

5. Quantitative RT-PCR-Validierung von RNA Sequencing (Figur 3)

1. Auszuwählen, wie viele Gene wie möglich, um die relative Genexpression über einen Dynamikbereich zu vergleichen, die beide in vorhergesagten Sequenz Fülle und vermuteten chemosensory Genfunktion.
2. Design-Primerpaare für jedes Zielgen eine bestimmte 100-180 Basenpaar-PCR-Produkt zu verstärken. Ausschließen unspezifische gDNA Verstärkung durch, die mindestens ein Primer pro Satz umfasst ein Intron-Grenze. Alternativ können Sie DNase-Behandlung, um genomische Kontamination zu verringern.
3. SammelnInsektengewebe wie in vorhergehenden Abschnitt beschrieben. Berechnen Sie, wie viel Gewebe ist erforderlich, um genügend RNA bieten alle qRT-PCR-Reaktionen durchzuführen.
   HINWEIS: Biologische dreifacher Ausfertigung und technische dreifach Reaktionen maximale Vertrauen in Ergebnisse zu liefern.
4. Berechnen relativer Genquantifizierung als X _Ziel ^{- (Ct [target] -Ct [Referenz])} für jedes Zielgen und Durchschnitt für jede Wiederholung, sowohl biologische und technische. Verwenden Housekeeping-Gen (en) Ct-Werte zwischen biologischen Replikaten zu normalisieren und die Y-Achse Skala im Vergleich der relativen Expression verankern.
5. Beurteilen Sie die Ähnlichkeit der RNA-seq und qRT-PCR Datensätze mit dem Regressionsbasis, Bootstrap Gleichwertigkeit Verfahren ^9, iterativ angewendet, um die Daten aus jedem Gewebe.
   HINWEIS: Dieses Verfahren identifiziert das kleinste "Ähnlichkeitsregion", die sich um die beobachtete RNA-seq und qRT-PCR-Daten konstruiert werden können, und lassen Sie die relative Genexpression durch qRT- gemessenPCR als statistisch äquivalent zur Messung der relativen Genexpression durch RNA-seq werden.

Ergebnisse

Die Trace-Aufzeichnungen von Aktionspotentialen von Ae. aegypti Geschmacks Sensillen (Abbildung 1) zeigen die Wirksamkeit der direkten Stimulation mit einer Reihe von Chemikalien. Diese Technik kann verwendet werden, um Antworten auf jede Stimulierung chemischen durch Zählen Spitzen einer gegebenen Amplitude und Dauer über einen angemessenen Zeitraum (im allgemeinen weniger als 500 ms) zu quantifizieren. Trace-Aufzeichnungen müssen unter einem gegebenen Satz von experimentellen Bedingungen l...

Diskussion

Die größte Herausforderung bei der Aufnahme von Aktionspotentialen von Geschmacks Sensillen ist zu entscheiden, welche Antworten sind "normal". Bei der Verwendung von einzelnen Geschmacks Sensillum Spitze der Aufnahme das erste Mal für eine bestimmte Insektenarten, die Gesamtzahl und die Empfindlichkeiten der Geschmacksrezeptorzellen (KNS) sind wahrscheinlich unbekannt. Viele vorläufigen Aufzeichnungen werden zunächst erforderlich, den Bereich und die Konzentrationen von Chemikalien zu testen, zu entschei...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass capillary	A-M Systems	628000	Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4"
Silver wire	A-M Systems	7875	.015" bare
Tungsten wire	Alfa Products	369	0.127 mm diameter
Fine forceps	Fine Science Tools	11252	#5SF Inox
Refridgerated stage	BioQuip Products	1429	Chill Table
Preamplifier	Syntech	Taste Probe	preamplifier
Software for electrophysiology	Syntech	Autospike	software for electrophysiology
TetraMin fish food	Tetra	Tropical fish food granules	fish food ground to fine powder
TRIzol	Life Technologies	15596-026	RNA isolation reagent
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74136	includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns
Nanodrop spectrophotometer	Nano Drop Products	ND-1000	tabletop spectrometer
R statistics	freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka)	www.r-project.org	Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment.
1.5 ml tube rack	Evergreen	240-6388-030	Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue.
1.5 ml collection tubes with pestle	Grainger	6HAX6	RNase free
Centrifuge	Thermo Scientific	11178160	Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube.
Primer-BLAST Primer Designing tool	NCBI	n/a