Fisiologici Registrazioni e RNA sequenziamento delle appendici gustative del Mosquito febbre gialla<em&gt; Aedes aegypti</em

Riepilogo

Utilizzando due metodi per stimare l'espressione genica nei principali appendici gustative di Aedes aegypti, abbiamo individuato il set di geni putativamente sottostanti le risposte neuronali di composti amari e ripugnanti, come determinato da un esame elettrofisiologico.

Abstract

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

Introduzione

Composti come DEET, Picaridin, Citronellale e IR3535 hanno dimostrato di respingere in modo efficace le zanzare, comprese le importanti vettori della malattia Aedes aegypti ^1,2. Registriamo potenziali d'azione dei neuroni sensoriali associati a specifici sensilla gustativa per determinare le cellule coinvolte con repellenza zanzare. Accoppiato con sequenziamento valle di geni espressi in questi tessuti, possiamo identificare i geni più probabile che mediano le risposte di queste cellule per lo screening di nuovi composti per le capacità repellenza migliorate.

RNA-Seq è uno strumento potente, diventando rapidamente standard per il rilevamento delle modifiche temporali e spaziali in espressione genica. RNA-Seq analisi di appendici chemosensoriali insetti e gli organi sono stati utilizzati per scoprire recettori molecolari in diverse specie di insetti ^3-5, migliorando notevolmente il convenzionale PCR-ricerche gene per gene ^6. Gli insetti rappresentano la classe degli animali più diversi, presentano molte opportunità di studiare la connessione tra geni e fenotipi unici. Tecnologia RNA-seq può essere impiegato su qualsiasi tessuto vivente insetto. Allo stesso modo, la registrazione elettrofisiologica da cellule sensoriali all'interno uniporous sensilli gustativi può essere raggiunto in molte diverse specie di insetti. L'abbinamento di queste due tecniche permette ai ricercatori di restringere i geni coinvolti set in un fenotipo chemosensory osservato. Diverse specie presenteranno sfide specifiche, ma possono informare il collegamento tra i geni dei recettori chemosensoriali e un adattamento chemosensory. Le dimensioni e la morfologia dei chemosensory sensilli è variabile e rendere necessario l'risoluzione dei problemi durante la registrazione di potenziali di azione per ridurre il rumore e identificare segnali ripetibili. Dissezioni di organi chemiosensoriali possono essere banale o delicati e richiede tempo, a seconda della morfologia e dimensioni dell'insetto. Recupero di RNA di alta qualità può richiedere un po 'di risoluzione dei problemi e, come ad esempio evitare alcuni pigmenti durantecollezione tessuti.

Mentre dimostrare gli effetti dei composti repellenti attraverso studi comportamentali è diretta e informativo, questo approccio è tempo intenso e largo rispetto al meccanismo d'azione. Elettrofisiologia accoppiato con RNA-Seq consente analisi più specifiche su ciò che spinge a comportamenti di evitamento insetti. Una volta che il "toolkit" della discriminazione chimico è stato identificato in una specie di insetti, i tentativi più specifiche per migliorare il repellenti conosciute sono possibili. Recettori e proteine ​​associate a cellule sensoriali responsabili di questi comportamenti possono essere espressi heterologously per lo screening chimico diretta. Inoltre, modellistica molecolare in grado di prevedere quali sostanze chimiche si suscitare reazioni forti da questi recettori ^7.

L'istantanea di tutti i geni attivi in ​​una serie limitata di tessuti chemosensoriali può anche essere utile per identificare geni simili in altre specie. Utilizzando omologia di sequenza e di espressione similarities, i ricercatori possono formare gruppi di recettori molecolari più probabile che mediano le risposte a repellenti che sono ampiamente efficaci sugli insetti. Vi presentiamo il seguente protocollo per aiutare i ricercatori a decostruire percorsi chemosensoriali insetti e di convincere di più per approfondire la neuroetologia di non-modello e insetti economicamente importanti.

Protocollo

1. allevamento Ae. adulti aegypti

1. Le uova si schiudono in circa ¾ di pollice in acque poco profonde cassetto. Sovraffollamento ridurrà la dimensione degli adulti.
2. Larve posteriore a 25 ° C (12-HL: 12-HD) ed alimentare con cibo per pesci a terra.
   NOTA: sovralimentazione può ridurre i tassi di sopravvivenza.
3. Rimuovere pupe individualmente da pipetta Pasteur quotidiano e trasferimento in piatti di plastica (9 centimetri × 5,5 centimetri) all'interno secchielli di contenimento con fini coperchi maglia, stabilendo così 24 gruppi di età hr.
4. Mangimi zanzare adulte soluzione al 10% di saccarosio dal batuffolo di cotone collocato sulle pareti schermo di un contenitore gabbia le zanzare in una camera climatica a 27 ° C e 70% di umidità relativa sotto la stessa fotoperiodo come larve.
5. Per elettrofisiologia, utilizzare 5-10 giorno animali vecchi. In generale, gli animali più grandi produrranno risultati migliori. Per l'isolamento di RNA, usare gli animali che si trovano all'interno di un unico 24 ore raggruppamento età nel vecchio campo di 5-10 giorni.

2. Preparazione delle sostanze chimiche

1. Determinare una concentrazione adeguata di elettroliti (ad esempio 1-10 mm) suscita l'attività minima da neuroni sensoriali selezionati. 10 mM NaCl o 1mm KCl sono elettroliti ragionevoli per testare l'attività di base quando si inizia un esperimento.
2. Sciogliere ogni chimica sperimentale nel solvente appropriato (se non l'acqua, usare etanolo o DMSO) che ha poco o nessun effetto sulla attività picco rispetto all'elettrolito sola. Le concentrazioni finali di 10% etanolo o 1% DMSO sono concentrazioni iniziali ragionevoli.
3. Selezionare appropriata (ad esempio il chinino per amaro o di saccarosio per dolci) i prodotti chimici di controllo che sono ben descritti, deterrenti alimentazione o stimolanti negli insetti.

3. Elettrofisiologia (registrazione punta ^8; Figura 1)

1. Elettrodi di vetro Form tirando meccanicamente capillari di vetro. Ottimizzare il calore e tirare le impostazioni di tirare vetro per formare recordi opportunamente sagomataElettrodi ng. Rompere con cautela fine del elettrodo di vetro con pinze sotto un microscopio da dissezione per creare elettrodo punta apertura che è sufficientemente ampia per busta bersaglio sensillum, ma abbastanza piccolo per evitare il contatto con le strutture vicine.
2. Al microscopio, identificare visivamente dalla morfologia e posizionare il target sensilla / sensillum per garantire la ripetibilità della registrazione punta. Animali Prep per consentire l'accesso gratuito al sensilla dall'angolo di entrata dell'elettrodo.
3. Freddo insetti anestetizzare adulti in freezer a -20 ° C. Evitare danni ai neuroni periferici da sovraesposizione a temperature fredde. Tagliare sottili strisce di nastro adesivo con lama di rasoio sul vetrino. Immobilizzare intero insetto su un vetrino con strisce strette.
4. Inserire un filo di tungsteno affilata chimicamente nel torace dorsale o occhio per servire come indifferente (terra) dell'elettrodo.
5. Riempire elettrodo vetro fatto a passo 3,1 con una soluzione stimolante di interesse. Utilizzando una siringa inserita, compilare capIllary dalla fine tirato a Blunt fine. Rovesciare tutte le bolle d'aria, tenendo fine abbattuto. Inserire un filo d'argento (chloriding opzionale) nell'elettrodo di vetro fatto a passo 3.1 per servire come elettrodo di registrazione e stimolante.
6. Collegare gli elettrodi ad un preamplificatore che è stato progettato per registrazioni da contatto chemoreceptive sensilli negli insetti. Questo preamplificatore (300 Hz-3 kHz filtro passa-banda) ridurrà il tempo di assestamento di catturare l'attività neuronale più vicino allo stimolo introduzione possibile. Raccogliere, archiviare e analizzare i segnali elettrici con un microcomputer dotato di software di registrazione picco.
   NOTA: Messa a terra del sistema di registrazione correttamente può migliorare drasticamente il rapporto segnale-rumore.
7. Stimolare sensilla con una soluzione di controllo (solo elettrolita) per garantire la funzionalità. Conte picchi a partire 200 msec seguito l'artefatto stimolo per tutte le preparazioni.
8. Casuale l'ordine di sostanze chimiche di prova per tutti gli esperimenti, tranne studi dose-risposta,per eliminare pregiudizi. Per gli studi dose-risposta, esporre sensilla ad aumentare concentrazioni della sostanza chimica sperimentale. Lasciare un minimo di 3 minuti tra stimoli al fine di garantire un adeguato recupero.
   NOTA: Questo requisito può variare a seconda degli insetti e sensilli. Soglia è definita come quella concentrazione per cui errore standard non si sovrappone con l'errore standard per la concentrazione più bassa testata.

4. RNA Isolamento e Sequencing (Figura 2)

1. Preparare i pestelli RNasi-free ermetici da loro raffreddamento in ghiaccio secco prima di tessuto disruption.Prepare accompagnano pestelli RNasi-free che si adattano provette con tappo a scatto saldamente. Tenere tubi di raccolta chiusi a meno dissezione attivamente per evitare eccessiva formazione di condensa.
2. Utilizzando aspiratore filtrato, mettere da 30 a 40 le zanzare-anestetizzato freddo (15 sec in -20 ° C freezer) sul palco freddo e mostra per il sesso. Luogo animali dorsale lato negativo, afferrare le ali per non danneggiare appendici gusto.
3. Utilizzando due coppie di pinza sottile, sezionare Paired Labella o tarsi da maschi o femmine sotto un microscopio da dissezione e limitare l'inserimento di tessuti adiacenti.
   NOTA: 500 Labella accoppiato produce circa 800-1000 nanogrammi di mRNA totale. 400 tarsi individuale (5 segmenti ciascuno) produrranno 1,200-1,800 nanogrammi di mRNA totale.
4. Con un paio di Ansimare-pinze, leggermente cogliere proboscide zanzara solo prossimali di Labella esporre mandrini interni. Utilizzando altra coppia di raccolta-pinze, rimuovere Labella e aggiungere tessuto lato del tubo di raccolta a freddo.
5. Con un paio di pinze, leggermente cogliere gamba zanzare allo svincolo di tibia e primo segmento tarsale. Utilizzando altra coppia di pinze, rimuovere tarsi e aggiungere tessuto lato del tubo di raccolta a freddo.
   NOTA: Prendere in considerazione i tipi di cellule a livello di interfaccia del tessuto desiderato e indesiderati. Mentre è importante limitare l'inclusione di tessuto limitrofo, è altrettanto importante non omettere porzioni di tessuto desiderato. Il ficampione finale deve rappresentare accuratamente l'intero organo di interesse. Creare un confine preciso con le pinze di presa in modo tale che una pinza di raccolta possono liberare proprio raschiando o afferrare solo il tessuto desiderato.
6. Periodicamente, spin down tubo di raccolta brevemente 0 ° C centrifugare a 9.000 xg per mantenere il tessuto sul fondo della provetta. Se l'umidità si accumula nei tubi di raccolta durante la dissezione, aggiungere 50ul di freddo reagente Trizol per coprire il tessuto raccolti.
7. Utilizzando anti-macchia marcatore laboratorio, etichetta chiaramente uno senza RNase 1,5 ml schiocco provetta con tappo per ogni tipo di tessuto per la raccolta. Usando 1,5 ml provetta rack e azoto liquido, congelare poi macinare tessuto in polvere fine (pezzi pregiati se in Trizol). Ripetere una volta. Portare il volume totale di Trizol a 1 ml e sospendere nuovamente il tessuto terra nel vortex.
8. Aggiungere 200 ul di cloroformio e mescolare accuratamente. Dopo 5 min a temperatura ambiente, centrifugare a centrifugare a 4 ° C e 11.000 xg per 15 min. Attentamenteaggiungere strato acquoso direttamente ad una colonna filtro DNA genomico. Spin down a 11.000 x g per 5 min. Aggiungere uguale volume di RNase-free etanolo al 70% a flusso continuo e mescolare pipetta. Trasferire il liquido a una colonna collezione RNA e continuare l'estrazione di RNA secondo le istruzioni fornite.
9. Quantificare e valutare la purezza di RNA totale su uno spettrofotometro di precisione e procedere con qualsiasi metodo di sequenziamento RNA standard.

5. quantitativa RT-PCR convalida di RNA Sequencing (Figura 3)

1. Selezionare come molti geni come possibile confrontare i livelli di espressione genica relativi su una gamma dinamica, sia in previsto abbondanza sequenza e la funzione del gene chemosensory presunta.
2. Coppie di progettazione di primer per ogni gene target per amplificare uno specifico prodotto della PCR 100-180 paio di basi. Escludi non specifico di amplificazione gDNA garantendo almeno un fondo per set estende un confine introne. In alternativa, utilizzare il trattamento DNasi per ridurre la contaminazione genomico.
3. Raccoglieretessuto insetto come descritto nel paragrafo precedente. Calcolare la quantità di tessuto è necessario per fornire abbastanza RNA per completare tutte le reazioni qRT-PCR.
   NOTA: triplice copia biologica e reazioni triplicate tecnici forniranno la massima fiducia nei risultati.
4. Calcola relativa quantificazione gene come X _bersaglio ^{- (Ct [destinazione] -Ct [riferimento])} per ogni gene target e media per ogni replica, sia biologico e tecnico. Utilizzare gene housekeeping (s) per normalizzare valori Ct tra i replicati biologici e di sradicare la scala Y in confronto di espressione relativa.
5. Valutare la somiglianza di RNA-Seq e dataset qRT-PCR usando la procedura di equivalenza bootstrap basato ^{regressione-9,} in modo iterativo applicato, per i dati di ogni tessuto.
   NOTA: Questa procedura identifica la più piccola "regione di somiglianza" che può essere costruito intorno alla dati RNA-Seq e qRT-PCR osservata, e consentire l'espressione genica relativa come misurato da qRT-PCR da considerare statisticamente equivalente alla misurazione dell'espressione genica relativa da RNA-seq.

Risultati

Le registrazioni in tracce di potenziali d'azione da Ae. aegypti sensilla gustativa (Figura 1) dimostrare l'efficacia della stimolazione diretta con una gamma di prodotti chimici. Questa tecnica può essere usata per quantificare risposte a qualsiasi sostanza chimica stimolante contando punte di una data ampiezza e durata in un intervallo di tempo ragionevole (generalmente inferiore a 500 ms). Registrazioni Trace devono essere facilmente riproducibili sotto un dato insieme di condizioni...

Discussione

L'aspetto più impegnativo di potenziali d'azione di registrazione da sensilla gustativa è decidere quali risposte sono "normali". Quando impiegando singolo sensillum gustativa punta registrando la prima volta per una determinata specie di insetti, il numero totale e sensibilità dei neuroni recettori gustativi (GRN) sono probabilmente sconosciuta. Molte registrazioni preliminari vengono prima tenuti a decidere la gamma e le concentrazioni di sostanze chimiche da testare. In questo caso, abbiamo comin...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass capillary	A-M Systems	628000	Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4"
Silver wire	A-M Systems	7875	.015" bare
Tungsten wire	Alfa Products	369	0.127 mm diameter
Fine forceps	Fine Science Tools	11252	#5SF Inox
Refridgerated stage	BioQuip Products	1429	Chill Table
Preamplifier	Syntech	Taste Probe	preamplifier
Software for electrophysiology	Syntech	Autospike	software for electrophysiology
TetraMin fish food	Tetra	Tropical fish food granules	fish food ground to fine powder
TRIzol	Life Technologies	15596-026	RNA isolation reagent
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74136	includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns
Nanodrop spectrophotometer	Nano Drop Products	ND-1000	tabletop spectrometer
R statistics	freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka)	www.r-project.org	Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment.
1.5 ml tube rack	Evergreen	240-6388-030	Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue.
1.5 ml collection tubes with pestle	Grainger	6HAX6	RNase free
Centrifuge	Thermo Scientific	11178160	Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube.
Primer-BLAST Primer Designing tool	NCBI	n/a