استخدام فتح المتاهة ميدانية لقياس الحركي والقلق تشبه السلوك في الفئران

Summary

A protocol is provided to use an Open Field Maze to access general locomotor activity, anxiety and emotionality in a laboratory mouse model.

Abstract

Animal models have proven to be invaluable to researchers trying to answer questions regarding the mechanisms of behavior. The Open Field Maze is one of the most commonly used platforms to measure behaviors in animal models. It is a fast and relatively easy test that provides a variety of behavioral information ranging from general ambulatory ability to data regarding the emotionality of the subject animal. As it relates to rodent models, the procedure allows the study of different strains of mice or rats both laboratory bred and wild-captured. The technique also readily lends itself to the investigation of different pharmacological compounds for anxiolytic or anxiogenic effects. Here, a protocol for use of the open field maze to describe mouse behaviors is detailed and a simple analysis of general locomotor ability and anxiety-related emotional behaviors between two strains of C57BL/6 mice is performed. Briefly, using the described protocol we show Wild Type mice exhibited significantly less anxiety related behaviors than did age-matched Knock Out mice while both strains exhibited similar ambulatory ability.

Introduction

The Open Field Maze (OFM) was initially developed in 1934 as a test to measure emotionality in rodents¹. It has attained the status of being one of the most widely used measures of behavior in animal psychology². It provides an easy and fairly rapid assessment of well-defined behaviors requiring no training to the test subject and little to no specialized training for the human administering the test. These attributes have led to wide-spread use of the open field maze in research extended to other animal species such as calves, pigs, rabbits, primates, honeybees and lobsters³. Part of its popularity arises from the fact that the psychological and physiological concepts underlying the tests are generally straight-forward and well understood. For example, it has been postulated that evolutionary forces have selected for a common response in animals such that most species display anxiety-mediated fear or flight responses to specific stimuli. Rodents for example, show distinct aversions to large, brightly lit, open and unknown environments⁴. We can assume they have been phylogenetically conditioned to see these types of environments as dangerous. All of these features are incorporated in the open field maze and form the basis of its use in behavioral paradigm testing.

An open field maze consists of a wall-enclosed area that is of sufficient height to prevent the subject from escaping. Typical maze shapes are circular or square with an area large enough, based on the size of the subject tested, to elicit a feeling of openness in the center of the maze. A number of variables can be scored in the open field maze with most parameters involving differing types of motor activity². Ambulation is the most common behavior studied but others such as latency or rearing can also be measured. Most often, rodent behavior is analyzed in a bare maze. However, the addition of objects, either one or many to the maze floor, adds the ability to see how the subject interacts with novel additional stimuli². Relevant parameters when objects are presented are typically the number of approaches to an object or in some cases, preference or aversion for one object over another.

Many behavioral tests of anxiety are based on the subject animal’s body activity and locomotion⁵. Interpreting behavioral tests for emotionality while separating non-emotional confounding factors, such as motor activity, has been the subject of intense debate^6,7. As the OFM was originally described, two measures of emotionality can be deduced, locomotor activity and fecal boli deposits or defecation¹. However, these two measures have been shown in some studies to be unrelated supporting the conclusion that emotionality in rodents is multidimensional⁵. Regardless, discrepancies in the literature regarding these measures and emotionality or anxiety in mouse models may be attributed to differences in analysis criteria or differences in testing procedures. Studies have conclusively linked results from OFM analysis with other measures of anxiety when comparing mouse models⁸.

Protocol

ملاحظة: تم تقديم جميع إجراءات تنفيذه هنا لوالموافقة عليها من قبل IACUC (مكتب البحوث الامتثال) وجرت وفقا المبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة. وكانت الفئران المستخدمة في الاختبار السلوكي نموذج السذاجة وعدم استخدامها لإجراء اختبارات أخرى. وقد وصفت البرية نوع C57BL / 6 و نوك اوت الفئران المستخدمة في هذا البروتوكول من قبل ⁹ والبيانات المقدمة هنا من أن المخطوطة.

1. إعداد غرفة الاختبار وافتح جهاز الميداني

1. استخدام وحدة متعددة متاهة حقل مفتوح (تسجيل الخروج)، ويتألف من أربع غرف النشاط كان يستخدم لهذا التحليل (الشكل 1). كل غرفة قياس 50 سم (طول) × 50 سم (العرض) × 38 سم (ارتفاع)، والمصنوعة من كثافة عالية بيضاء والبلاستيك غير قابلة للاختراق.
2. الملمس الطوابق من المتاهة لالجر خلال التمشي في حين كانت جدران المتاهة على نحو سلس. وكانت الأرباع متاهة فارغة تماما لهذا الغرض من هذا الاختبار. في النظر في بقية هذا بروتوالعقيد، وسوف تستخدم رباعي واحد من المتاهة المذكورة أعلاه للتدليل على تسجيل الخروج.
3. مسح الغرفة مع الايثانول 95٪ قبل استخدامها وقبل الاختبارات اللاحقة لإزالة أي أدلة رائحة عن طريق الماوس الموضوع السابق غادر.
4. السماح للإيثانول لتتبخر تماما مسبق لاختبار الفئران. وهذا قد يستغرق 5-10 دقيقة بين كل دورة الاختبار.
5. لهذا التحليل، استخدم برنامج SMART التتبع من جهاز PanLab / هارفارد لتسجيل وتقييم حركة الماوس.
   ملاحظة: أي كاميرا التجارية التتبع والبرمجيات يمكن استخدامها لتتبع موضوع اختبار وتقييم النتائج من متاهة حقل المفتوحة. من المهم جدا بالنسبة للمستخدم النهائي لفهم كيفية معايرة وتشغيل البرمجيات المستخدمة لكل تحليل فردي. بغض النظر عن كاميرا فيديو وتتبع البرمجيات المستخدمة، ويتم الحصول على أفضل النتائج عندما تكون الكاميرا والبرامج ومعايرة بشكل صحيح وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
6. أداء الاختبار الأولغ معيار مضاءة الغرفة قادرة على احتواء الجهاز متاهة والكمبيوتر المطلوبة لتشغيل البرنامج. تعليق كاميرا فيديو فوق متاهة إما عن طريق إرفاقها إلى السقف أو باستخدام أي نظام الدعم المرتفع الذي يسمح للعدسة الكاميرا لرؤية المنطقة بأكملها متاهة (الشكل 2).
7. بصفتك مسؤول البشري للاختبار، ومن المؤكد أن لديك مساحة كافية في الغرفة لتكون غير قابلة للرصد تماما من اختبار المواضيع في متاهات حتى لا تؤثر على سلوك الفئران.

2. إعداد برنامج لقياس آخر

1. فتح برنامج التتبع.
2. مرة واحدة يتم فتح البرنامج، حرك المؤشر إلى "تتبع واحدة، يخضع" الخيار الموجود تحت "بيانات اقتناء" علامة التبويب وبنقرة واحدة لفتح هذا الخيار.
3. اختيار "خلفية ثابتة" الخيار الموجود في الجزء السفلي من الشاشة.
4. بعد اختيار "خلفية ثابتة" هو اختارن، فمن الضروري استخدام البرنامج لالتقاط صورة من المتاهة قبل إضافة مواضيع الاختبار. للقيام بذلك، حرك المؤشر إلى زر "صور" الموجود في الجزء السفلي من الشاشة وبنقرة واحدة.
   ملاحظة: سوف يقوم البرنامج التقاط صورة من السيناريو دون اختبار الموضوع الذي سوف تطرح من الصورة التي اتخذت خلال عملية تتبع. وينتج عن ذلك سوى حركة هذا الموضوع يجري تحليلها من قبل البرنامج.
5. تأكد من أن الصورة الخلفية التي اتخذت فوق إزالة تماما من تتبع البرامج عن طريق تحريك المؤشر إلى الزر "اختبار" الموجود في الجزء السفلي من الشاشة والنقر مرة واحدة. سيظهر حقل الأبيض الصلبة إذا تمت إزالة صورة الخلفية تماما عن الصورة تتبع. إذا تغيرت ظروف الإضاءة أو يتم نقل المتاهة عن طريق الخطأ، وسوف ترى السوداء "الظلال" في هذا المجال مما يدل على الصورتين لا تتطابق تماما. لتصحيح هذا الوضع، ببساطة تكرار الظريفص 2.4 أعلاه.
6. بعد التأكد من إعدادات الخلفية، استخدم خيار التوقيت لتكوين الطريقة التي يتم التحكم فيها وقت خلال الاستحواذ. للقيام بذلك، حرك المؤشر إلى "تكوين" علامة التبويب وانقر مرة واحدة على "مواقيت" البند. استخدام إطار افتتح حديثا لدخول المعلمات التجريبية.
7. لهذا البروتوكول، اختار "الوقت المبرمج" الخيار كما تتبع فترة 10 دقيقة. تعيين "فترة اختفاء" ل5 ثانية للسماح وقت المستخدم لوضع الماوس في وسط المتاهة، والابتعاد قبل الشروع في تتبع. أدخل "شراء الوقت" من 10 دقيقة لمدة الاختبار. تعيين "أوقفوا السيطرة" لتعيين "عندما الوقت المبرمج (10 دقيقة) هو أكثر" والتي سوف تتحول تلقائيا إلى الكاميرا وظيفة تتبع من البرنامج.
8. تحريك المؤشر إلى "انهيار" الزر بعد أن تم تعيين كافة توقيت لإغلاق النافذة. أنت الآن جاهز لبدء الاختبارالإجراء جي.

3. إدارة الاختبار الميداني المفتوحة

ملاحظة: حزمة البرامج المستخدمة في هذا البروتوكول يتيح تتبع ما يصل الى 16 الفئران الفردية في وقت واحد. لسهولة إنجاز وكما ذكر أعلاه، فإن بروتوكول مناقشتها هنا هو للماوس واحدة باستخدام رباعي واحد من تسجيل الخروج. لالمعدات المستخدمة لهذا البروتوكول، ويمكن تتبع بحد أقصى 4 الفئران الفردية باستخدام كل رباعي من المتاهة. إذا باستخدام متاهة متعددة الضميمة، بعد وضع الماوس الموضوع الأول في رباعي المحددة لها، ووضع الفئران المتبقية في الربع بهم متاهة المعنية لتتبع التحليل. لأغراض هذا البروتوكول، ومزيد من التعليمات أن تكون محددة لرباعي واحد من المتاهة.

1. جعل الفئران في أقفاص وطنهم من غرفة مساكنهم إلى غرفة الاختبار. السماح للفئران حتى يتأقلم إلى غرفة إجراء مدة لا تقل عن 30 دقيقة قبل بدء الاختبار.
2. إزالة متر واحدOUSE من قفص المنزل عن طريق الامساك بلطف ذيله ووضع الماوس في وسط متاهة حقل مفتوح حين تفعيل بالتزامن برنامج سمارت عن طريق النقر على زر واحد على بدء لبدء تتبع حركة الماوس. فمن الطبيعي للالماوس للتحرك فورا على الجدران المحيطة من المتاهة وتوقيت إطلاق وتتبع القبض على الماوس يجب أن تتزامن لتسجيل هذه الحركة.
3. السماح بحرية الحركة ودون انقطاع من الفأرة الموضوع في جميع أنحاء رباعي منها من المتاهة لفترة واحدة 10 دقيقة وهي الفترة التي سوف تتبع البرامج تسجل حركة (الشكل 3).
4. في نهاية فترة الاختبار، والتقاط الماوس الموضوع بلطف، وإزالته من هذه المتاهة، وإعادته إلى القفص وطنه.
5. قبل تنظيف المتاهة، عد بصريا الكريات بولي البرازية الحالية في متاهات وتسجيل أرقام لمزيد من التحليل يدويا.
6. إزالة جميع الكريات البرازية ويمسح عن كل البقع من التبول. رش الأرض وجدران رباعي متاهة مع 95٪ من الإيثانول ومسح أسفل مع منشفة ورقية نظيفة. السماح للحل الإيثانول لتجف تماما قبل اختبار الفئران الأخرى.
7. كرر الإجراء مع الماوس المقبل.

4. قياس وتحليل السلوك أثناء إجراء اختبار

ملاحظة: للحصول على القياس، وتتميز ثلاثة جوانب من السلوك حقل مفتوح بسهولة باستخدام هذا البروتوكول (انظر المناقشة). في تعليمة موجزا عن كيفية الوصول إلى هذه القياسات في تتبع برامج الفيديو التالي.

1. من الشاشة الرئيسية للبرنامج SMART، حرك المؤشر إلى "المناطق" علامة التبويب وبنقرة واحدة "تعريف" لفتح محرر المنطقة.
2. اتبع تعليمات مفصلة في دليل البرامج العضو الذكية لا تحديد مناطق أو شبكات لتراكب على مسارات تتبع. هنا، تم استخدام البرنامج لتحديد 5 × 5 شبكة من 10 سم الساحات التي تغطي الأرض من المتاهة ( الشكل 4). تأكد من حفظ ملف المنطقة التي تم إنشاؤها قبل إغلاق محرر المنطقة.
3. من الشاشة الرئيسية للبرنامج SMART، حرك المؤشر إلى "تحليل" علامة التبويب وبنقرة واحدة لفتح نافذة تحليل البيانات.
4. تحريك المؤشر إلى "ملف" التبويب وفتح ملف المنطقة تم إنشاؤها أعلاه.
5. نقل المؤشر إلى "تكوين" علامة التبويب وفتح "تحليل المسار" الخيار. سيؤدي هذا إلى فتح نافذة "التكوين تحليل واحدة، يخضع".
   1. تحريك المؤشر إلى "ستاندارد" علامة التبويب ونقل "المسافة سافر" معلمة من مربع معلمات متاح (الجانب الأيسر) إلى مربع معلمات وشملت (الجانب الأيمن).
   2. تحريك المؤشر إلى "مناطق الانتقال" علامة التبويب ونقل كافة المعلمات المناسبة إلى مربع معلمات وشملت على النحو الوارد أعلاه.
   3. تأكد من تحديد "المسار الكامل" مربع في الجزء السفلي من النافذة.
   4. مولقد المؤشر إلى زر موافق وأغلق النافذة التكوين تحليل أحادية الموضوع.
      ملاحظة: اعتمادا على التحليل كنت ترغب في القيام بها، العديد من الخيارات الأخرى يمكن اختيار في هذه النافذة لبيانات الألغام من التحليل. قراءة دليل المستخدم مفصل للبرنامج محدد لتحديد ما هي أهم المعايير لتحليل البيانات الخاصة بك.
6. تحت علامة التبويب ملف في الجانب الأيسر العلوي من إطار البرنامج، افتح نافذة المسار موضوع واحد ووضع علامة الاختيار بجانب كل المسارات التي يجري تحليلها. تحريك المؤشر إلى الزر تحقق الأقسام في الجزء العلوي من النافذة وانقر لإغلاق إطار المسار إكسبلورر.
7. تحريك المؤشر إلى زر "الذهاب" في إطار تحليل البيانات وبنقرة واحدة لبدء تحليل البيانات المسار الصحيح.
8. يمكن تحليل البيانات أن يكون الناتج إما ملفات نصية ASCII أو أنها يمكن تصديرها مباشرة إلى جدول EXCEL. استخدام أدوات الإخراج من برنامج البرنامج الذي تستخدمه لإخراج داتا للاستخدام الخاص بك.
   ملاحظة: مجموع المسافة المقطوعة والوقت الذي يقضيه في المناطق المشار إليها سوف يكون الناتج باتباع الخطوات تحليل البيانات المذكورة أعلاه. مرة أخرى، يتم التأكيد على أن الخطوات للوصول إلى هذه القياسات الممثلة هنا سوف تختلف تبعا للبرنامج المستخدم المستخدمة. ولكن البيانات نفسها وتفسير النتائج ينبغي أن تكون مستقلة مماثل للبرنامج البرمجيات المستخدمة. ومن الجدير بالذكر أيضا أن تتم إزالة التحيز المسؤول اختبار من هذا البروتوكول وجميع البيانات التي تم جمعها وكميا البيانات المقاسة من قبل البرنامج وليس المسؤول. وبالتالي لا يوجد أي عنصر qualifiable إلى البيانات التي تم جمعها كما هو موضح.

النتائج

متوسط ​​عدد الأفراد لكل سلالة من الفئران تم اختبارها في معظم الحالات هو ما يقرب من 20 إلى توليد أهمية إحصائية كافية. ومع ذلك، يمكن لهذا العدد أن يكون في حدود 8-30 اعتمادا على توافر الماوس. اعتمادا على قياس أو المقارنات المطلوبة، بل هو أيضا مواتية لاستخدام موضوعات العمر ...

Discussion

فتح المتاهة الميدان هي واحدة من المنصات الأكثر استخداما على نطاق واسع في الدراسات السلوكية الحيوانية. وهناك عدد من المعلمات التقليدية وعلم السلوك الهامة ^2،4 يمكن جمعها وتحليلها خلال أداء تسجيل الخروج. هذه البيانات تسمح الباحث لقياس السلوكيات تتراوح بين النشاط...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multi Unit Open Field Test	San Diego Instruments, Inc.	White 7001-0354	Any single or multi unit open field maze can be used
SMART DT Tracking Software	PanLab/Harvard Apparatus	76-0695	Any tracking software can be utilized with this protocol
Sony 990x Video Camera Recorder	Sony	CCD-TRV328	Any suitable video camera can be attached to computer for recording tracking profiles.