열기 필드 미로의 사용은 마우스의 운동력과 불안 같은 행동을 측정하기 위해

요약

A protocol is provided to use an Open Field Maze to access general locomotor activity, anxiety and emotionality in a laboratory mouse model.

초록

Animal models have proven to be invaluable to researchers trying to answer questions regarding the mechanisms of behavior. The Open Field Maze is one of the most commonly used platforms to measure behaviors in animal models. It is a fast and relatively easy test that provides a variety of behavioral information ranging from general ambulatory ability to data regarding the emotionality of the subject animal. As it relates to rodent models, the procedure allows the study of different strains of mice or rats both laboratory bred and wild-captured. The technique also readily lends itself to the investigation of different pharmacological compounds for anxiolytic or anxiogenic effects. Here, a protocol for use of the open field maze to describe mouse behaviors is detailed and a simple analysis of general locomotor ability and anxiety-related emotional behaviors between two strains of C57BL/6 mice is performed. Briefly, using the described protocol we show Wild Type mice exhibited significantly less anxiety related behaviors than did age-matched Knock Out mice while both strains exhibited similar ambulatory ability.

서문

The Open Field Maze (OFM) was initially developed in 1934 as a test to measure emotionality in rodents¹. It has attained the status of being one of the most widely used measures of behavior in animal psychology². It provides an easy and fairly rapid assessment of well-defined behaviors requiring no training to the test subject and little to no specialized training for the human administering the test. These attributes have led to wide-spread use of the open field maze in research extended to other animal species such as calves, pigs, rabbits, primates, honeybees and lobsters³. Part of its popularity arises from the fact that the psychological and physiological concepts underlying the tests are generally straight-forward and well understood. For example, it has been postulated that evolutionary forces have selected for a common response in animals such that most species display anxiety-mediated fear or flight responses to specific stimuli. Rodents for example, show distinct aversions to large, brightly lit, open and unknown environments⁴. We can assume they have been phylogenetically conditioned to see these types of environments as dangerous. All of these features are incorporated in the open field maze and form the basis of its use in behavioral paradigm testing.

An open field maze consists of a wall-enclosed area that is of sufficient height to prevent the subject from escaping. Typical maze shapes are circular or square with an area large enough, based on the size of the subject tested, to elicit a feeling of openness in the center of the maze. A number of variables can be scored in the open field maze with most parameters involving differing types of motor activity². Ambulation is the most common behavior studied but others such as latency or rearing can also be measured. Most often, rodent behavior is analyzed in a bare maze. However, the addition of objects, either one or many to the maze floor, adds the ability to see how the subject interacts with novel additional stimuli². Relevant parameters when objects are presented are typically the number of approaches to an object or in some cases, preference or aversion for one object over another.

Many behavioral tests of anxiety are based on the subject animal’s body activity and locomotion⁵. Interpreting behavioral tests for emotionality while separating non-emotional confounding factors, such as motor activity, has been the subject of intense debate^6,7. As the OFM was originally described, two measures of emotionality can be deduced, locomotor activity and fecal boli deposits or defecation¹. However, these two measures have been shown in some studies to be unrelated supporting the conclusion that emotionality in rodents is multidimensional⁵. Regardless, discrepancies in the literature regarding these measures and emotionality or anxiety in mouse models may be attributed to differences in analysis criteria or differences in testing procedures. Studies have conclusively linked results from OFM analysis with other measures of anxiety when comparing mouse models⁸.

프로토콜

참고 : 여기서의 모든 절차에 제출하여 승인을 IACUC (연구 준수 사무소)에 의해 NIH의 지침에 따라 실시 하였다되었다. 행동 테스트 패러다임에 사용 된 마우스는 순진하고 다른 시험에 사용되지 않았다. 이 프로토콜에 사용되는 C57BL / 6 야생형과 똑 마우스는 ⁹ 이전에 설명하고 여기에 제시된 데이터는 원고에서 있습니다.

테스트 룸과 오픈 필드 장치 1. 준비

1. 네 활동 챔버로 구성된 여러 단위 열기 필드 미로 (OFM)를 사용하는 것은 이러한 분석 (그림 1)에 사용되었다. 각 챔버 측정 50cm (길이) 50cm (폭) 38cm (높이) x 및 화이트 고밀도 및 비 - 다공성 플라스틱으로 제작 된 X.
2. 미로의 벽이 부드러운 동안 보행시 견인을위한 미로의 바닥 질감입니다. 미로 사분면이 시험의 목적을 위해 완전히 비어있다. 이 프로토 나머지 고려COL 상술 미로 단일 사분면 OFM을 설명하기 위해 이용 될 것이다.
3. 이전 주제 마우스로 남아있는 향기 단서를 제거하기 위해 사용하기 전에 95 %의 에탄올과 이후 테스트하기 전에 실을 닦습니다.
4. 에탄올은 쥐를 테스트에 전에 완전히 증발하도록 허용합니다. 이것은 각 테스트 세션 사이에 5 ~ 10 분 정도 걸릴 수 있습니다.
5. 이 분석을 위해, 기록 및 마우스 움직임을 평가 PanLab / 하버드 장치로부터 SMART 비디오 추적 소프트웨어를 사용한다.
   주 : 모든 CM 영상 추적 카메라 및 소프트웨어는 오픈 필드 미로 결과를 시험 대상을 추적하고 평가할 수있다. 최종 사용자가 교정하는 방법을 이해하고 각 분석에 사용되는 소프트웨어를 실행하는 것은 매우 중요하다. 카메라와 소프트웨어가 제대로 제조업체의 지시에 따라 보정하는 경우에 상관없이 비디오 카메라 및 사용 추적 소프트웨어는 최상의 결과를 얻을 수있다.
6. 시험 I 수행NA 표준 미로 장치 및 소프트웨어를 실행하는 데 필요한 컴퓨터를 포함 할 수있는 공간을 조명. 천장에 부착 또는 카메라 렌즈가 미로 전체 영역 (도 2)을 참조 할 수있는 승강 지원 시스템을 이용하여 어느 미로 상기 비디오 카메라를 일시.
7. 시험 인간 관리자로서, 마우스의 행동에 영향을하지 않도록 미로에 피험자에 의해 완전히 관측 될 방에 공간이 충분해야.

2. 활동을 측정 할 수있는 소프트웨어를 준비

1. 비디오 추적 소프트웨어를 엽니 다.
2. 소프트웨어가 열린 후, "데이터 수집"탭이 옵션을 열려면 클릭 한 번 아래에있는 "단일 주제 추적"옵션에 커서를 이동합니다.
3. 화면 아래쪽에있는 "정적 배경"옵션을 선택합니다.
4. 선택 후 "정적 배경"를 선택이다N, 이는 앞서 피험자의 첨가로 미로의 이미지를 촬영하기 위해 소프트웨어를 사용하는 것이 필요하다. 이렇게하려면 스크린과 한 번의 클릭의 아래쪽에있는 "사진"버튼에 커서를 이동합니다.
   주 : 소프트웨어 추적 처리 동안 촬영 화상으로부터 감산 될 것이다 시험 대상없이 시나리오의 사진을 찍을 것이다. 에만 피사체의 움직임이 소프트웨어에 의해 분석되는 경우가 빈번하게 발생한다.
5. 상기 촬영 배경 이미지가 완전히 화면 하단에있는 "테스트"버튼에 커서를 이동 한 번 클릭하여 추적 소프트웨어에 의해 제거되는 것을 확인한다. 배경 이미지가 완전히 추적 이미지에서 제거되면 백색 고체 필드는 도시한다. 조명 조건 변경하거나 미로 실수로 이동하는 경우, 당신은 두 개의 이미지가 완벽하게 일치하지 않는 나타내는이 분야에서 검은 "그림자"를 볼 수있을 것입니다. 이 상황을 해결하려면 인트를 반복P 2.4 이상.
6. 배경 설정을 확인한 후, 수집 시간 동안 제어되는 방식을 구성하는 타이밍 옵션을 사용. 이렇게하려면 "구성"탭으로 커서를 이동 한 후 "타이밍"제목을 클릭하면됩니다. 실험 매개 변수를 입력합니다 새로 열린 창을 사용합니다.
7. 이 프로토콜의 경우, 10 분 추적 기간으로 "프로그램 된 시간"옵션을 선택했다. 미로의 중앙에 위치시키고 마우스를 추적 개시전 멀어 사용자 시간을 허용하기 위해 5 초에 "대기주기"를 설정한다. 시험 기간 동안 10 분의 "획득 시간"을 입력한다. "프로그램 시간 (10 분)이 끝나면"자동 카메라와 소프트웨어의 추적 기능이 꺼집니다되는 설정 "정지 제어"를 설정합니다.
8. 모든 타이밍이 창을 닫습니다 설정 한 후 "닫기"버튼에 커서를 이동합니다. 이제 테스트를 시작할 준비가절차를 보내고.

열기 필드 테스트 3. 관리

주 :이 프로토콜에서 사용되는 소프트웨어 패키지는 한 번에 최대 16 개의 개별 마우스의 추적을 허용한다. 완성의 편의를 위해 위에서 언급 한 바와 같이, 여기에서 논의 된 프로토콜은 OFM의 하나의 사분면을 사용하여 하나의 마우스입니다. 이 프로토콜을 사용하고있는 기기의 경우, 4 개인 마우스의 최대 미로의 각 사분면을 사용하여 추적 할 수 있습니다. 멀티 인클로저 미로를 사용하는 경우, 그 정의 사분면의 첫 번째 주제 마우스를 배치 한 후, 분석을 추적하는 각각의 미로 사분면에 남아있는 마우스를 놓습니다. 이 프로토콜의 목적을 위해, 상기 명령은 미로의 사분면에 고유 한 것이다.

1. 시험장에 자신의 주택 방에서 자신의 홈 케이지에 마우스를 가져. 쥐 실험을 시작하기 전에 30 분 이상 동안 절차 방에 적응하도록 허용.
2. 단일 m를 제거부드럽게 꼬리를 잡고 홈 케이지에서 여러개 동시에 마우스의 움직임을 추적 시작하기 위해 시작 버튼 하나 클릭하여 SMART 소프트웨어를 활성화하는 동안 열기 필드 미로의 중앙에 마우스를 놓습니다. 마우스가 미로의 주변 벽과 릴리스의 타이밍 즉시 이동하고 마우스 캡처를 추적하는 것은이 운동을 기록 일치해야하는 것은 정상입니다.
3. , 추적 소프트웨어는 움직임을 기록되는 시간 동안 하나의 10 분 기간 (그림 3)의 미로의 각 사분면에 걸쳐 주제 마우스의 무료 및 중단 운동을 허용합니다.
4. 시험 기간이 끝나면, 부드럽게 피사체 마우스 픽업 미로에서 제거하고 그의 홈 케이지로 복귀.
5. 미로를 청소하기 전에, 시각적으로 미로에 존재하는 배설물 boli 알약을 계산하고 수동으로 추가 분석을 위해 번호를 기록한다.
6. 모든 분변 알약을 제거하고 소변의 모든 관광 명소를 닦아. 바닥과 95 % 에탄올로 미로 사분면의 벽을 뿌려 깨끗한 종이 타월로 닦아냅니다. 허용 에탄올 용액 이전에 다른 마우스를 테스트에 완전히 건조.
7. 다음 마우스로 절차를 반복합니다.

4. 측정 및 시험 절차를 수행하는 동안 행동 분석

참고 : 측정을 위해, 오픈 필드 동작의 세 가지 측면 쉽게 (설명 참조)이 프로토콜을 사용하여 특징이다. 비디오 추적 소프트웨어에서 이러한 측정을 액세스하는 방법에 대한 간단한 명령어는 다음과 같다.

1. SMART 소프트웨어의 주 화면에서, 존 편집기를 엽니 다 "영역"탭을 클릭 한 번으로 "정의"에 커서를 이동합니다.
2. SMART 소프트웨어 사용자 설명서의 자세한 설명은 추적 경로에 오버레이 영역 또는 그리드를 정의 하는가에 따라. 여기서, 소프트웨어는 미로의 바닥을 덮는 10cm 정사각형의 5 × 5 그리드 (정의하는 데 사용 된 그림 4). 앞서 존 편집기를 종료하기 위해 만든 영역 파일을 저장해야합니다.
3. SMART 소프트웨어의 메인 화면에서 "분석"탭으로 커서를 이동 한 데이터 분석 창을여십시오.
4. "파일"탭으로 커서를 이동하고 위에서 만든 영역 파일을 엽니 다.
5. "구성"탭으로 커서를 이동하고 "트랙 분석"옵션을 엽니 다. 이것은 "단일 주제 분석 구성"창이 열립니다.
   1. "표준"탭으로 커서를 이동시키고 포함 된 매개 변수 상자 (오른쪽)에 사용 가능한 매개 변수 상자 (왼쪽)에서 "여행하고 거리"매개 변수를 이동합니다.
   2. "영역 전환"탭으로 커서를 이동하고 위의 포함 된 매개 변수 상자에 모든 적절한 매개 변수를 이동합니다.
   3. "전체 트랙"상자가 창 하단에 선택되어 있는지 확인합니다.
   4. 모OK 버튼에 커서를했습니다 및 단일 주제 분석 구성 창을 닫습니다.
      참고 : 수행하고자하는 분석에 따라, 많은 다른 옵션은 분석에서 내 데이터에이 창에서 선택 될 수있다. 매개 변수 데이터의 분석을위한 가장 중요한 결정하기 위해 특정 프로그램의 자세한 사용 설명서를 읽어 보시기 바랍니다.
6. 프로그램 창의 왼쪽 상단의 파일 탭에서 단일 주제 트랙 창을 열고 모든 트랙이 분석되고 옆에 체크 표시를합니다. 창 상단에있는 확인 표시 버튼에 커서를 이동하고 트랙 Explorer 창을 닫습니다.
7. 데이터 분석 창에서 "이동"버튼에 커서를 이동하고 하나의 트랙 데이터의 분석을 시작합니다.
8. 분석 데이터 중 하나를 ASCII 텍스트 파일로 출력 할 수 있습니다 또는 직접 엑셀 스프레드 시트로 내보낼 수 있습니다. 출력 다에 사용하는 소프트웨어 프로그램의 출력 도구를 사용하여자신의 사용에 따.
   참고 : 총 이동 거리 및 표시 영역에서 보낸 시간은 위에 설명 된 데이터 분석 단계에 따라 출력됩니다. 다시, 단계 사용한 사용자 소프트웨어 등에 따라 다르고, 여기에 나타낸 이들 측정에 도달하도록 강조된다. 그러나 데이터 자체와 결과의 해석은 소프트웨어 프로그램의 유사한 독립적이어야한다. 그것은 그 테스트 관리자 바이어스 소프트웨어가 아닌 관리자에 의해 측정 된 데이터를 정량화 수집 된 모든 데이터와이 프로토콜에서 제거도 주목할 필요가있다. 따라서 기술 된 바와 같이 수집 된 데이터에 더 qualifiable 요소는 없다.

결과

대부분의 경우 실험군 당 균주 개인의 평균 개수는 충분한 관련성 통계를 생성하기 위해 약 20이다. 그러나이 숫자는 마우스 가용성에 따라 8-30의 범위 일 수있다. 필요한 측정 또는 비교에 따라, 또한 연령 유사한 피사체를 사용하는 것이 바람직하다.

열기 필드 미로에서 측정하는 제 틀림없이 가장 중요한 특정 매개 변수는 총 외래 거리입니다. 측정 단위는 비교를 위해 부?...

토론

열기 필드 미로 동물 행동 연구에서 가장 널리 사용되는 플랫폼 중 하나입니다. 중요하고, 종래의 ^2,4- ethological 파라미터 번호를 수집하여 OFM의 수행 동안 분석 될 수있다. 이 자료는 연구자가 불안 관련 감정적 인 행동 ⁸ 전체 운동 활성에 이르기까지 행동을 측정 할 수 있습니다. 그러나, OFM의 사용에도 단점은 있습니다. 한가지 문제는 어떤 교란 시험 세션 동안 조작 될 수있는 정...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multi Unit Open Field Test	San Diego Instruments, Inc.	White 7001-0354	Any single or multi unit open field maze can be used
SMART DT Tracking Software	PanLab/Harvard Apparatus	76-0695	Any tracking software can be utilized with this protocol
Sony 990x Video Camera Recorder	Sony	CCD-TRV328	Any suitable video camera can be attached to computer for recording tracking profiles.