L'utilisation de l'Open Field Maze mesurer locomoteur et de l'anxiété comme comportement chez la souris

Résumé

A protocol is provided to use an Open Field Maze to access general locomotor activity, anxiety and emotionality in a laboratory mouse model.

Résumé

Animal models have proven to be invaluable to researchers trying to answer questions regarding the mechanisms of behavior. The Open Field Maze is one of the most commonly used platforms to measure behaviors in animal models. It is a fast and relatively easy test that provides a variety of behavioral information ranging from general ambulatory ability to data regarding the emotionality of the subject animal. As it relates to rodent models, the procedure allows the study of different strains of mice or rats both laboratory bred and wild-captured. The technique also readily lends itself to the investigation of different pharmacological compounds for anxiolytic or anxiogenic effects. Here, a protocol for use of the open field maze to describe mouse behaviors is detailed and a simple analysis of general locomotor ability and anxiety-related emotional behaviors between two strains of C57BL/6 mice is performed. Briefly, using the described protocol we show Wild Type mice exhibited significantly less anxiety related behaviors than did age-matched Knock Out mice while both strains exhibited similar ambulatory ability.

Introduction

The Open Field Maze (OFM) was initially developed in 1934 as a test to measure emotionality in rodents¹. It has attained the status of being one of the most widely used measures of behavior in animal psychology². It provides an easy and fairly rapid assessment of well-defined behaviors requiring no training to the test subject and little to no specialized training for the human administering the test. These attributes have led to wide-spread use of the open field maze in research extended to other animal species such as calves, pigs, rabbits, primates, honeybees and lobsters³. Part of its popularity arises from the fact that the psychological and physiological concepts underlying the tests are generally straight-forward and well understood. For example, it has been postulated that evolutionary forces have selected for a common response in animals such that most species display anxiety-mediated fear or flight responses to specific stimuli. Rodents for example, show distinct aversions to large, brightly lit, open and unknown environments⁴. We can assume they have been phylogenetically conditioned to see these types of environments as dangerous. All of these features are incorporated in the open field maze and form the basis of its use in behavioral paradigm testing.

An open field maze consists of a wall-enclosed area that is of sufficient height to prevent the subject from escaping. Typical maze shapes are circular or square with an area large enough, based on the size of the subject tested, to elicit a feeling of openness in the center of the maze. A number of variables can be scored in the open field maze with most parameters involving differing types of motor activity². Ambulation is the most common behavior studied but others such as latency or rearing can also be measured. Most often, rodent behavior is analyzed in a bare maze. However, the addition of objects, either one or many to the maze floor, adds the ability to see how the subject interacts with novel additional stimuli². Relevant parameters when objects are presented are typically the number of approaches to an object or in some cases, preference or aversion for one object over another.

Many behavioral tests of anxiety are based on the subject animal’s body activity and locomotion⁵. Interpreting behavioral tests for emotionality while separating non-emotional confounding factors, such as motor activity, has been the subject of intense debate^6,7. As the OFM was originally described, two measures of emotionality can be deduced, locomotor activity and fecal boli deposits or defecation¹. However, these two measures have been shown in some studies to be unrelated supporting the conclusion that emotionality in rodents is multidimensional⁵. Regardless, discrepancies in the literature regarding these measures and emotionality or anxiety in mouse models may be attributed to differences in analysis criteria or differences in testing procedures. Studies have conclusively linked results from OFM analysis with other measures of anxiety when comparing mouse models⁸.

Protocole

NOTE: Toutes les procédures effectuées ici ont été soumises et approuvées par IACUC (Office of Compliance recherche) et ont été réalisées suivant les directives du NIH. Souris utilisées dans le paradigme de tests comportementaux ont été naïf et ne est pas utilisé pour d'autres tests. Le C57BL / 6 de type sauvage et des souris Knock Out utilisé dans ce protocole ont été précédemment décrit ⁹ et les données présentées ici sont de ce manuscrit.

1. Préparation de la salle d'examen et Open Appareil de terrain

1. Utilisez un champ ouvert labyrinthe unité multiple (OFM) composé de quatre chambres d'activité a été utilisé pour cette analyse (Figure 1). Chaque chambre mesurée 50 cm (longueur) x 50 cm (largeur) x 38 cm (hauteur) et a été faite du blanc haute densité et de plastique non-poreux.
2. Texturer les étages du labyrinthe pour la traction lors de la marche alors que les murs du labyrinthe étaient lisses. Quadrants Maze étaient complètement vides pour le but de ce test. En contrepartie du reste de ce protocol, un seul quadrant du labyrinthe décrit ci-dessus sera utilisé pour démontrer l'OFM.
3. Essuyez la chambre avec un éthanol à 95% avant l'utilisation et avant que des tests ultérieurs pour enlever tous les indices de parfum laissées par le sujet souris précédente.
4. Laisser l'éthanol se évaporer complètement avant de tester la souris. Cela peut prendre de 5 à 10 min entre chaque séance d'essais.
5. Pour cette analyse, utilisez le logiciel SMART Suivi vidéo de PanLab / Harvard Apparatus pour enregistrer et évaluer le mouvement de la souris.
   NOTE: Ne importe quelle caméra de suivi vidéo commerciale et des logiciels peuvent être utilisés pour suivre le sujet de test et évaluer les résultats de le labyrinthe de plein champ. Il est très important pour l'utilisateur final de comprendre comment calibrer et exécutez le logiciel utilisé pour chaque analyse individuelle. Indépendamment de la caméra vidéo et de logiciels de suivi utilisé, on obtient les meilleurs résultats lorsque l'appareil photo et le logiciel sont correctement étalonnés selon les instructions du fabricant.
6. Effectuer les tests inorme na éclairage de la pièce capable de contenir l'appareil de labyrinthe et l'ordinateur requis pour exécuter le logiciel. Suspendre la caméra vidéo au-dessus du labyrinthe soit par fixation au plafond ou en utilisant ne importe quel système de support surélevée qui permet à la lentille de la caméra de voir la zone de labyrinthe ensemble (figure 2).
7. Comme l'administrateur humaine du test, assurez-vous d'avoir suffisamment d'espace dans la salle pour être complètement observables par les sujets de test dans le labyrinthe afin de ne pas influencer le comportement des souris.

2. Préparer le logiciel pour mesurer l'activité

1. Ouvrez le logiciel de suivi vidéo.
2. Une fois le logiciel ouvert, déplacer le curseur sur l'option "de suivi unique sujet" situé sous l'onglet "Data Acquisition» et seul clic pour ouvrir cette option.
3. Choisissez l'option "Arrière-plan statique" situé en bas de l'écran.
4. Après avoir choisi «Contexte statique" est choisin, il est nécessaire d'utiliser le logiciel pour prendre une image du labyrinthe avant l'addition des sujets d'essai. Pour ce faire, déplacez le curseur sur le bouton "Photo" situé en bas de l'écran et seul clic.
   REMARQUE: Le logiciel va prendre une photo du scénario sans que le sujet de test qui sera soustraite de l'image prise au cours du processus de suivi. Il en résulte que le mouvement de l'objet en cours d'analyse par le logiciel.
5. Assurez-vous que l'image de fond pris ci-dessus est complètement éliminée par le logiciel de suivi en déplaçant le curseur sur le bouton «Test» situé au bas de l'écran et en cliquant une fois. Un champ solide blanc se affiche si l'image de fond est complètement supprimé de l'image de suivi. Si les conditions d'éclairage changent ou le labyrinthe est accidentellement déplacé, vous verrez noirs "ombres" dans ce domaine indiquant les deux images ne coïncident pas parfaitement. Pour remédier à cette situation, il suffit de répéter step 2.4 ci-dessus.
6. Après avoir vérifié les paramètres de fond, utilisez l'option de synchronisation pour configurer la façon dont le temps est contrôlée lors de l'acquisition. Pour ce faire, déplacez le curseur sur l'onglet "Configuration" et cliquez une fois sur la rubrique «Timing». Utilisez la nouvelle fenêtre ouverte pour entrer dans les paramètres expérimentaux.
7. Pour ce protocole, a choisi l'option "Temps programmé" que la période de suivi de 10 min. Réglez la «période de latence» à 5 sec pour laisser le temps de l'utilisateur de placer la souris dans le centre du labyrinthe et de se éloigner avant le début du suivi. Entrez le "Temps d'acquisition" de 10 min pour la durée de l'essai. Réglez le "Stop commande" réglé sur "Lorsque le temps programmé (10 min) est plus" qui éteint automatiquement l'appareil photo et la fonction de suivi du logiciel.
8. Déplacez le curseur sur le bouton "Fermer" après que tous les horaires ont été établis pour fermer la fenêtre. Vous êtes maintenant prêt à commencer le testing procédure.

3. Administration du test Open Field

REMARQUE: Le logiciel utilisé dans ce protocole permet le suivi de jusqu'à 16 souris individuelles à un moment. Pour la facilité de réalisation et comme mentionné ci-dessus, le protocole présenté ici est pour une seule souris en utilisant un seul quadrant de la BPI. Pour l'équipement utilisé pour ce protocole, un maximum de quatre souris individuelles pourrait être suivie à l'aide chaque quadrant du labyrinthe. Si en utilisant un labyrinthe multi-enceinte, après avoir placé le premier sujet de souris dans son quadrant défini, placer les souris restantes dans leur quadrant labyrinthe respectif pour analyse de suivi. Pour les fins de ce protocole, d'autres instructions sera spécifique à un seul quadrant du labyrinthe.

1. Apportez les souris dans leurs cages à domicile de leur chambre de logement dans la salle d'examen. Laissez la souris de se acclimater à la salle d'intervention pour un minimum de 30 minutes avant de commencer le test.
2. Retirer un seul mOuse de la cage de la maison en saisissant doucement sa queue et placez la souris au milieu du labyrinthe de champ ouvert tout en activant simultanément le logiciel SMART en cliquant une seule sur le bouton Démarrer pour commencer à suivre le mouvement de la souris. Il est normal pour la souris pour déplacer immédiatement sur les parois périphériques du labyrinthe et le moment de la libération et le suivi de la capture de la souris devrait coïncider pour enregistrer ce mouvement.
3. Permettre le déplacement libre et ininterrompu du sujet tout au long de la souris le quadrant respective du labyrinthe pour une seule période de 10 minutes au cours de laquelle, le logiciel de suivi sera enregistrer le mouvement (Figure 3).
4. À la fin de la période d'essai, ramasser l'objet doucement la souris, le retirer du labyrinthe et le retourner à sa cage.
5. Avant de nettoyer le labyrinthe, comptez visuellement les pastilles Boli fécaux présents dans le labyrinthe et manuellement enregistrer les numéros pour une analyse ultérieure.
6. Retirez toutes les pelotes fécales et essuyer tous les spots de la miction. Vaporiser le sol et les murs du quadrant de labyrinthe avec 95% d'éthanol et essuyer avec une serviette en papier propre. Permettre à la solution de l'éthanol pour sécher complètement avant de tester d'autres souris.
7. Répétez la procédure avec la prochaine souris.

4. Mesure et analyse du comportement lors de la procédure d'essais

NOTE: Pour la mesure, trois aspects du comportement en plein champ sont facilement caractérisés en utilisant ce protocole (voir la discussion). Une brève instruction sur la façon d'accéder à ces mesures dans le logiciel de suivi vidéo suit.

1. De l'écran principal du logiciel SMART, déplacer le curseur sur l'onglet "Zones" et seul clic "Définition" pour ouvrir l'éditeur Zone.
2. Suivez les instructions détaillées dans le manuel de l'utilisateur du logiciel SMART ne définir des zones ou des grilles de superposer sur les chemins de suivi. Ici, le logiciel a été utilisé pour définir une grille de 5 x 5 cm de 10 cases couvrant la surface du labyrinthe ( Figure 4). Veillez à enregistrer le fichier de zone créé avant la fermeture de l'éditeur Zone.
3. De l'écran principal du logiciel SMART, déplacer le curseur sur l'onglet «Analyse» et seul clic pour ouvrir la fenêtre d'analyse des données.
4. Déplacez le curseur sur l'onglet "Fichier" et ouvrez le fichier de zone créé ci-dessus.
5. Déplacez le curseur sur l'onglet "Configuration" et ouvrez l'option "Analyse Track". Cela va ouvrir la fenêtre "configuration d'analyse unique objet".
   1. Déplacez le curseur sur l'onglet "Standard" et déplacer le paramètre "Distance parcourue" Paramètres de la zone Disponible (côté gauche) à la boîte de paramètres inclus (côté droit).
   2. Déplacez le curseur sur l'onglet "Zones Transitions" et mettre tous les paramètres appropriés à la boîte de paramètres inclus comme ci-dessus.
   3. Vérifiez que la case "Full Track" est cochée en bas de la fenêtre.
   4. Move le curseur sur le bouton OK et fermez la fenêtre à sujet unique configuration d'analyse.
      REMARQUE: Selon l'analyse que vous souhaitez effectuer, beaucoup d'autres options peuvent être choisies dans cette fenêtre pour extraire des données de l'analyse. Lire le manuel de votre programme spécifique de l'utilisateur détaillée pour déterminer quels sont les paramètres les plus importants pour l'analyse de vos données.
6. Sous l'onglet Fichier en haut à gauche de la fenêtre du programme, ouvrez la fenêtre unique objet de la piste et placer une coche à côté de toutes les pistes en cours d'analyse. Déplacez le curseur sur le bouton coche en haut de la fenêtre et cliquez sur pour fermer la fenêtre Track Explorer.
7. Déplacez le curseur sur le bouton "Go" dans la fenêtre d'analyse de données et cliquez pour lancer l'analyse des données de la piste.
8. des données d'analyse peuvent être sortie comme soit des fichiers texte ASCII ou il peut être directement exporté dans un tableur Excel. Utilisez les outils de sortie du logiciel que vous utilisez pour la sortie du data pour votre propre usage.
   REMARQUE: la distance totale parcourue et le temps passé dans les zones indiquées sera sortie en suivant les étapes de l'analyse de données décrites ci-dessus. Encore une fois, il est souligné que les étapes pour atteindre ces mesures représentées ici diffèrent en fonction du logiciel de l'utilisateur utilisé. Mais la donnée elle-même et l'interprétation des résultats doivent être indépendants similaire du programme de logiciel utilisé. Il est également intéressant de noter que le biais de l'administrateur de test est retiré de ce protocole que toutes les données recueillies est quantifiée données mesurées par le logiciel et non l'administrateur. Il n'y a donc pas d'élément qualifiable aux données recueillies de la manière décrite.

Résultats

Le nombre moyen d'individus par souche de souris testées dans la plupart des cas est d'environ 20 pour générer pertinence statistique suffisante. Toutefois, ce nombre peut être de l'ordre de 8 à 30 en fonction de la disponibilité de la souris. En fonction de la mesure ou la comparaison de besoin, il est également avantageux d'utiliser des sujets de même âge.

Le premier et sans doute le plus important paramètre spécifique pour mesurer dans le Open Field Maze est la ...

Discussion

L'Open Field Maze est une des plateformes les plus largement utilisés dans les études de comportement des animaux. Un certain nombre de paramètres classiques et éthologiques importants ^2,4 peut être collecté et analysé pendant l'exécution de la BCI. Ces données permettent aux chercheurs de mesurer les comportements allant de l'activité globale locomotrice à des comportements émotionnels liés à l'anxiété ^8. Cependant, l'utilisation de BCI ne est pas sans ses défa...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multi Unit Open Field Test	San Diego Instruments, Inc.	White 7001-0354	Any single or multi unit open field maze can be used
SMART DT Tracking Software	PanLab/Harvard Apparatus	76-0695	Any tracking software can be utilized with this protocol
Sony 990x Video Camera Recorder	Sony	CCD-TRV328	Any suitable video camera can be attached to computer for recording tracking profiles.